GENÉTICA

Daño basal del ADN en un grupo de individuos cubanos sanos mediante ensayo Cometa alcalino*

Basal DNA damage on a group of Cuban healthy individuals by alkaline Comet assay

Dano basal no DNA em um grupo de indivíduos cubanos saudáveis através do ensaio Cometa alcalino

 

Judith Beatriz Pupo Balboa¹, Reinaldo Gutiérrez Gutiérrez², Anamarys Pandolfi Blanco³, Mildrey Cásido Rodríguez⁴, Leyenis Valdés Ramos⁴, Aimara de Armas Santiesteban⁴

¹ Dra. en Ciencias Biológicas. Especialista de I grado en Bioquímica, Investigadora Agregada.
² Master en Genética Médica, Licenciado en Ciencias Farmaceútica. Investigador Auxiliar.
³ Licenciada en Tecnología de la Salud, Especialidad de Microbiología.
⁴ Técnico Medio en Química Industrial.

* Centro Nacional de Genética Médica. Laboratorio de Estrés Oxidativo. Ave. 146 No. 3102, esq. 31. Playa, La Habana, Cuba.

CORRESPONDENCIA DRA. JUDITH B. PUPO BALBOA Centro Nacional de Genética Médica Ave. 146 No. 3102, esq. 31. Playa, La Habana, Cuba E-mail: judith.pupo@infomed.sld.cu

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Resumen

El ADN de las células humanas está sujeto de forma constante a diferentes tipos de daños debido a factores ambientales y a procesos metabólicos propios de la célula, que de no ser reparados y renovada su integridad, provocan inestabilidad genómica. Consecuentemente el daño en el ADN ha sido utilizado como marcador biológico en el biomonitoreo humano. El objetivo del presente trabajo fue determinar el daño basal del ADN en linfocitos aislados de sangre periférica de individuos voluntarios sanos, sin antecedentes patológicos y/o exposición a agentes genotóxicos. Se incluyó un total de 95 sujetos residentes en La Habana, con una edad promedio de 34±12 años, en los que el 71,13% correspondió a mujeres. Se empleó la variante alcalina del ensayo Cometa. Los niveles de daño fueron determinados en unidades arbitrarias. El daño basal del ADN, cuantificado en los 95 individuos, fue de 34,98±19,6 UA (25%=20,5 UA, 75%=47,5 UA). Los valores determinados constituyen los valores de referencia del laboratorio para el daño basal del ADN, en sujetos sanos. El punto de corte de daño al ADN, correspondiente al percentil 75, presenta aplicabilidad en el estudio de pacientes e individuos expuestos a xenobióticos. El uso de este valor permite la realización de estrategias de intervención oportunas que contribuyan a reparar tempranamente el daño detectado.

Palabras clave: Daño del ADN; Reparación del ADN; Electroforesis en gel de células individuales o ensayo Cometa.

Summary

Human cell DNA is constantly subject to different types of damage due to environmental factors and metabolic processes of the same cell, which cause genomic instability if not repaired and completely renewed. Consequently, DNA damage has been used as a biomarker in human biomonitoring. The aim of this study was to determine basal DNA damage in lymphocytes isolated from peripheral blood of healthy volunteers with no medical history and/or exposure to genotoxic agents. A total of 95 subjects from the western region of Cuba, with an average age of 34±12 years, 71.13% of whom were female were included. Alkaline Comet assay variant was used. Damage levels were determined in arbitrary units. Basal DNA damage, measured in 95 subjects, was 34.98 ± 19.6 AU (25% = 20.5 AU, 75% = 47.5 AU). The values determined are the laboratory reference values for basal DNA damage in healthy subjects. The cutoff of DNA damage, corresponding to 75 percentile, has applicability in the study of patients and subjects exposed to xenobiotics. Use of this value allows for the realization of appropriate intervention strategies that help early repair of the damage detected.

Key words: DNA damage; DNA damage repair; Single cell gel electrophoresis assay or Comet assay.

Resumo

O DNA das células humanas está constantemente sujeito a diferentes tipos de danos devido a fatores ambientais e a processos metabólicos próprios da célula, que se não forem reparados e a sua integridade renovada, provocam instabilidade genômica. Por conseguinte, o dano no DNA foi utilizado como um biomarcador no biomonitoramento humano. O objetivo deste estudo foi determinar o dano basal do DNA em linfócitos isolados de sangue periférico de voluntários saudáveis, sem antecedentes patológicos e/ou exposição a agentes genotóxicos. Um total de 95 indivíduos residentes em Havana foram incluídos, com uma idade em média de 34±12 dos quais 71,13% eram mulheres. Foi utilizada a variante alcalina do ensaio Cometa. Os níveis de dano foram determinados em unidades arbitrárias. O dano basal do DNA, medido nos 95 pacientes, foi de 34,98 ± 19,6 UA (25% = 20,5 UA, 75%=47,5 UA). Os valores determinados são os valores de referência do laboratório para o dano basal do DNA em indivíduos saudáveis. O ponto de corte de dano ao DNA, correspondente ao 75 percentil, tem aplicabilidade no estudo de pacientes e indivíduos expostos a xenobióticos. O uso deste valor permite a realização de estratégias de intervenção adequadas que ajudem a reparar precocemente o dano detectado.

Palavras-chave: Dano do DNA; Reparo do DNA; Eletroforese em gel de células individuais ou ensaio Cometa.

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Introducción

El genoma humano está sujeto de forma constante a daños de diferentes tipos, a través de la combinación de causas endógenas o exógenas. Entre las endógenas se destacan las especies reactivas del oxígeno liberadas en el metabolismo celular oxidativo. Las exógenas incluyen la luz ultravioleta, las radiaciones ionizantes, los agentes quimioterapéuticos, la dieta, el humo del tabaco, entre otras. Para mantener la integridad y estabilidad del genoma, las células han desarrollado mecanismos, denominados conjuntamente, de respuesta al daño del ADN, para detectar, señalizar y reparar las lesiones de diferentes tipos en el ADN. Deficiencias en estas vías pueden estar asociadas al desarrollo de enfermedades neurológicas, inflamatorias, cáncer, síndromes genéticos con diferentes fenotipos. Igualmente, la respuesta individual a las terapias anti-cáncer se relaciona con alteraciones en estos mecanismos de reparación ⁽¹⁾⁽²⁾. Consecuentemente, el daño en el ADN constituye un marcador biológico que se ha utilizado en el biomonitoreo humano tanto ambiental, ocupacional como clínico ^(3-6). Específicamente, se ha encontrado elevado en estudios clínicos relacionados con el cáncer de diferentes orígenes ^(1)(7-9).
En Cuba, el cáncer constituye un serio problema de salud, al constituir la primera causa de muerte de la población cubana ⁽¹⁰⁾. Sin embargo, son escasos los estudios publicados que relacionen el daño del ADN y los procesos carcinogénicos, otras enfermedades o la exposición ambiental ^(11)(12). No existen valores de referencia del daño basal del ADN publicados que puedan ser utilizados en la práctica clínica.
Habitualmente los estudios de biomonitoreo del daño y la reparación del ADN en pacientes o individuos expuestos requieren establecer comparaciones con grupos controles ^(5)(13-15). Los individuos controles no presentan la condición que se estudia ni guardan relación parental con los casos o individuos a investigar. Razonablemente, resulta de gran importancia práctica y clínica disponer de valores de referencia de los niveles de daño basal del ADN en individuos sanos en el laboratorio. El análisis estadístico de estos valores permite establecer puntos de corte que pueden ser utilizados para evaluar los resultados obtenidos en los pacientes o individuos expuestos.
Diferentes técnicas se utilizan para determinar el daño en el ADN. El ensayo Cometa, en su variante alcalina, es la más utilizada internacionalmente para determinar roturas de simple y doble hebra, sitios sensibles al álcali, rompimientos de simple hebra relacionados con la reparación por escisión incompleta, y entrecruzamientos ADN-ADN y AND-proteínas ^(16-20).
En este trabajo se determinaron los niveles de daño basal mediante el ensayo Cometa alcalino en un grupo de sujetos sanos. El objetivo fue establecer los valores de referencia y los puntos de corte de este marcador en población aparentemente sana en el laboratorio de Estrés Oxidativo del Centro Nacional de Genética Médica.

Materiales y Métodos

Se realizó una investigación observacional descriptiva de tipo transversal, en el periodo de 2008 a 2012, que fue aprobada por el Comité de Ética de la Investigación del Centro Nacional de Genética Médica.

POBLACIÓN
Se incluyeron 95 sujetos voluntarios, residentes en La Habana, de los cuales se obtuvo el consentimiento informado. El promedio de edad de los sujetos fue de 34±12 años, con un rango de edad de 5 a 76 años. Se aplicaron los criterios de selección mediante encuesta. Fueron incluidos en el estudio aquellos individuos que no padecieran enfermedades crónicas, ni infecciones agudas, que no presentaron hábito de fumar, así como la no ingestión de medicamentos o alcohol, ni exposición a radiaciones en los últimos 30 días, previos a la toma de la muestra de sangre. A todos los individuos se les determinó el daño basal del ADN.

REACTIVOS
Los reactivos, Histopaque 1077, Trypan blue, Tris, cloruro de sodio (NaCl), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), DMSO, Triton X-100, NaOH, AgNO3 (nitrato de plata), tampón salino-fosfato (PBS), agarosa regular y de bajo punto de fusión, procedieron de la compañía Sigma-Aldrich.

AISLAMIENTO DE LINFOCITOS
Se colectaron 3 mL de sangre total mediante punción venosa en condiciones de asepsia y antisepsia en tubos heparinizados a cargo de personal capacitado del laboratorio clínico. Las muestras se transportaron hacia el laboratorio, refrigeradas, protegidas de la luz y debidamente identificadas, antes de 3 horas de realizada la flebotomía. Los linfocitos de la sangre se aislaron con Histopaque 1077 por centrifugación a 2200 rpm durante 30 minutos (Centrífuga Eppendorf 5415 R). Se colectó la capa de la interfase mediante micropipeta en un tubo separado y se realizaron 3 lavados con tampón PBS frío por centrifugación. El sedimento de células se resuspendió en un volumen apropiado de tampón PBS frío para obtener una concentración aproximada de 1x105 células/mL. La supervivencia celular determinada con azul Trypan fue superior al 95%.

ENSAYO COMETA ALCALINO
Se desarrolló la variante alcalina del ensayo Cometa siguiendo las condiciones descritas por Collins y colaboradores con algunas modificaciones ⁽²⁰⁾. Los linfocitos aislados se mezclaron con agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% y se aplicaron sobre duplicados de láminas portaobjetos, previamente codificadas y cubiertas con agarosa regular al 0,75%. Las láminas se cubrieron con cubreobjetos y se colocaron a 4 ºC para permitir la polimerización de la agarosa. A continuación, se retiraron los cubreobjetos y las láminas se colocaron en solución de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 10, 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 5% DMSO, 1% Triton X-100) toda la noche a 4 ºC. Posteriormente se realizó el desenrrollamiento del ADN en tampón de pH>13 (300 mM NaOH/1 mM EDTA) durante 25 minutos a 4 ºC. La electroforesis se desarrolló en este mismo tampón a 25 V, 300 mA durante 25 minutos a 4 ºC (Fuente eléctrica Cenic, Cuba). La neutralización se realizó con tampón frío 0,4 M Tris, pH 7,5. Se utilizó la tinción con nitrato de plata para teñir los núcleos.
Una porción de las células fue tratada con H2O2 a una concentración de 200 μM, durante 5 minutos en hielo, que fue utilizado como control positivo. El H₂O₂ produjo un incremento de las unidades arbitrarias en un 82%.

CUANTIFICACIÓN DEL DAÑO EN EL ADN
Los núcleos teñidos con nitrato de plata se observaron al microscopio óptico de campo claro con un objetivo de 40x (microscopio Wild Heerbrugg). Se visualizaron 100 núcleos por lámina, de forma que se abarcó toda la lámina, evitando los bordes y las burbujas. En total, se observaron 200 núcleos por cada individuo. El daño del ADN se cuantificó en unidades arbitrarias (UA) para lo que se establecieron 5 niveles de daño (0, 1, 2, 3 y 4) desde la no presencia de daño (nivel 0) hasta la mayor evidencia de este (nivel 4) ⁽²⁰⁾.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se utilizó el programa Statistica 7 para el análisis estadístico de los datos obtenidos en el estudio. Se aplicó la estadística descriptiva y se determinó la normalidad de la variable, daño basal del ADN, mediante el Test Kruskal-Wallis. Se determinó si hubo asociación entre la edad y el daño al ADN a través de la correlación de Pearson. Se determinó si hubo diferencias significativas entre los promedios del daño basal del ADN de ambos sexos, mediante comparación de medias con desviación estándar conocida. Se consideró un valor de p<0,05.

Resultados

El daño basal del ADN se determinó en 95 sujetos controles. El valor promedio del daño basal fue de 34,98 UA. El 25% ⁽²³⁾ de los sujetos (primer cuartil) presentó valores de daño por debajo de 20,5 UA, mientras que el 75% (72) de los sujetos (tercer cuartil) mostró niveles de daño por debajo de 47,5 UA. El valor que toma este marcador en el tercer cuartil puede ser considerado el punto de corte para este grupo de individuos para determinar valores alterados de daño del ADN. El 50% de los sujetos presentó niveles de daño al ADN entre estos dos valores, representado por la mediana (30±19,6) (Tabla I).

Tabla 1. Estadística descriptiva del daño basal del ADN de los sujetos sanos.

Leyenda: N: número de individuos; DE: Desviación estándar; UA: Unidades arbitrarias.
Fuente: Datos de la investigación. Centro Nacional de Genética Médica

En la muestra estudiada se obtuvo que no existe una relación directamente proporcional entre la edad y el daño basal del ADN (Figura 1).

Figura 1. Análisis de correlación entre la edad y el daño basal del ADN en la muestra estudiada.
Fuente: Datos de la investigación. Centro Nacional de Genética Médica

El daño basal del ADN en ambos sexos fue muy similar: 34,38±30 UA en los sujetos del sexo femenino (70,52%) y 37,58±34,75 UA en los masculinos (29,47%), p=0,65.

Discusión y Conclusiones

El presente trabajo describe los resultados de la aplicación del ensayo Cometa alcalino en linfocitos aislados de sujetos sanos para determinar los niveles de daño basal del ADN.
El daño basal del ADN se refiere al daño endógeno o constitutivo, que presenta el individuo en el momento que se estudia, condicionado por la influencia del medio ambiente, la dieta y el metabolismo celular ^(18)(21)(22).
Otros factores como la edad, el sexo, el hábito de fumar, pueden tener impacto en el daño del ADN ⁽²³⁾. Sin embargo, los resultados descritos en la literatura no son concluyentes. Algunos autores solo han encontrado influencia de la edad (24-27), mientras que otros plantean que no ha existido efecto de este factor sobre el daño al ADN (28-30). De hecho, existen resultados contradictorios en trabajos de un mismo autor, respecto al efecto de la edad en el daño al ADN ^(29)(31)(32). En el presente trabajo no se halló relación del daño basal del ADN con la edad, ni hubo diferencias significativas entre ambos sexos. Dushinska et al, de manera similar, no encontraron diferencias en el daño basal del ADN entre hombres y mujeres ⁽²¹⁾, mientras que Bajpayee et al, describieron mayor daño basal del ADN en hombres que en mujeres ⁽³³⁾.
La genotoxicidad determinada por ensayo Cometa puede ser expresada utilizando diferentes parámetros, como el porcentaje de ADN de la cola (simbolizado como %T) y el conteo visual (dado en UA) ⁽³¹⁾. Los resultados obtenidos en este estudio, expresados en UA, son similares a los descritos por Palyvoda et al, ⁽³⁴⁾, al comparar la mediana del daño basal del ADN: 30 UA (cuartil 25%: 20,5 UA; cuartil 75%: 47,5 UA), versus, 33,3 UA (cuartil 25%: 16,1 UA; cuartil 75%: 59,6 UA), respectivamente.
La medición del daño del ADN en UA y en %T puede ser equivalente. Esto se logra recalculando las UA en una escala de 0-400 a una escala de 0-100, por lo que se divide por un factor de 4 ⁽³¹⁾. De este modo, Moller ⁽³¹⁾ después de analizar conjuntamente 125 artículos sobre daño basal de ADN en linfocitos aislados, determinó como valor de referencia que la mediana de %T/UA fue de 8,6 (cuartil 25%: 4,4 - cuartil 75%: 14,5). Al realizar la conversión de los resultados obtenidos en el presente estudio de UA a %T y compararlos con los descritos por Moller ⁽³¹⁾, se observó que son ligeramente más bajos (7,5; cuartil 25%: 5,125 - cuartil 75%: 11,875). A su vez, Blasiak et al, ⁽³⁵⁾ obtuvieron valores de la media de %T del daño endógeno del ADN en mujeres sanas de 48 a 76 años mucho más bajos que los obtenidos en este trabajo, incluso por debajo de los valores de referencia determinados por Moller. Por su parte, Piperakis et al, ⁽²⁶⁾ determinaron el daño basal del ADN en tres grupos de edades (5-10 años, 40-50 años, 70-80 años), calculando la media del %T (3,2±0,12; 10,2±0,13; 22,5±0,18, respectivamente). Estos resultados reflejan la variabilidad que puede presentar la determinación del daño basal del ADN en linfocitos aislados.
El efecto de la edad en el daño del ADN se explica sobre la base biológica que expone una de las teorías del envejecimiento. Con el aumento de la edad el daño del ADN se acumula, por errores en los mecanismos de reparación, debido a defectos en la expresión de genes implicados, lo que unido a la incidencia de los factores exógenos y endógenos provoca aumento del daño basal del ADN ⁽³⁶⁾. Aunque en esta investigación no se encontró que la edad sea un factor determinante del daño en el ADN, y los datos descritos en la literatura son controversiales sobre esta relación, sería recomendable aumentar el número de individuos de diferentes edades, específicamente, menores de 15 años y mayores de 50 años. En la muestra estudiada hubo una mayor representación de las edades entre 26 y 49 años, lo que pudo haber influido en los resultados descritos. Igualmente, cabe señalar que resulta difícil disponer de sujetos controles adecuados, que permitan obtener una estratificación de las edades con un número óptimo de individuos, desde el punto de vista estadístico.
Otro factor que puede modificar el daño del ADN está dado por las radiaciones solares. Moller et al, ⁽²⁹⁾ y Smolkova et al, ⁽³⁷⁾ han determinado que las diferencias estacionales tienen un efecto en el daño basal de ADN, al cuantificar niveles de daño basal marcadamente aumentados en el verano respecto al invierno. La ubicación geográfica de Cuba, en una latitud muy cercana al Trópico de Cáncer (entre los 23º 17', 19º 50' latitud norte y los 74º 08', 84º 58' longitud oeste) condiciona la recepción de altos valores de radiación solar y determina el carácter cálido de su clima (tropical estacionalmente húmedo), lo que determina que escasamente haya diferencias entre las estaciones de verano e invierno ⁽³⁸⁾. Razonablemente, en el presente estudio no se tuvo en cuenta la estación del año para la toma de la muestra de sangre. Las condiciones climáticas descritas provocan que la luz solar penetre las capas externas de la epidermis y dañe el ADN de las células circulantes en los vasos de la piel ⁽²⁹⁾. Considerando lo anterior, podría esperarse que los resultados obtenidos en esta investigación mostraran diferencias con los publicados por Moler, en cuyo análisis, la mayoría de los estudios fueron realizados en Europa, donde bajos niveles de daño en el ADN se han relacionado con una menor exposición a los rayos solares y a la temperatura ⁽³¹⁾. No obstante, son similares a los referidos por este autor.
Varios autores declaran el uso de los cuartiles 25% y 75% como puntos importantes en el análisis de sus resultados del ensayo Cometa ^(13)(31)(34). Los puntos de corte determinados en este trabajo, pueden ser utilizados en el laboratorio para evaluar los resultados obtenidos en pacientes o individuos expuestos, a los que se les determine el daño basal del ADN, como biomarcador. En este sentido cobra mayor significación biológica el percentil 75%.
Es notable la gran variabilidad observada en la literatura sobre la relación del daño en el ADN y factores como la edad y el sexo. Aunque en el presente estudio no se obtuvo este tipo de relación en los individuos estudiados, es posible plantear la utilidad de la media y la mediana de daño basal del ADN y los puntos de corte determinados, como valores de referencia de individuos sanos. Específicamente, sería posible aplicarlos en estudios de biomonitoreo humano, relacionados con el cáncer, los estilos de vida y la exposición ambiental, dado que se encuentran en los rangos publicados por Moller ⁽³¹⁾, considerando el gran volumen de datos que analizó. De este modo, el personal médico dispone de indicadores normales que le orientan en la evaluación de la magnitud del daño basal del ADN, de individuos con susceptibilidad al cáncer u otras enfermedades, así como el efecto de la radio y/o quimioterapia, con respecto a sujetos controles. La utilización de estos valores de referencia puede contribuir al manejo del tratamiento y el seguimiento clínico de pacientes e individuos expuestos.

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Recibido: 8 de enero de 2014
Aceptado: 9 de junio de 2014