BIOLOGÍA MOLECULAR

Detección de la mutación V617F del gen JAK2 mediante análisis de disociación de alta resolución

Detection of V617F mutation of JAK2 gene by high resolution melting

Detecção da mutação V617F do gene JAK2 através da análise de dissociação em alta resolução

 

Silvina Quintana^1a, Erika Schoenfeld^2b, Vanesa Di Gerónimo^3a, Nazarena Martín^4b, Fernando Pagani^4b 

¹ Ph D. Licenciada en Cs. Biológicas.
² Licenciada en Cs. Biológicas.
³ Técnica.
⁴ Médico.
^a Laboratorio de Biología Molecular, Fares Taie Instituto de Análisis, Mar del Plata. Argentina.
^b Servicio de Hematología. Clínica Colón. Mar del Plata. Argentina.

CORRESPONDENCIA DRA. SILVINA QUINTANA Laboratorio de Biología Molecular, Fares Taie Instituto de Análisis Rivadavia 3343, MAR DEL PLATA, Argentina E-mail: biologiamolecular@farestaie.com.ar

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Resumen

La Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MP) son neoplasias mieloproliferativas caracterizadas por una proliferación excesiva de una o más líneas mieloides. En el año 2005 se identificó una mutación somática en el gen Janus kinase 2 (JAK2), que resulta en el reemplazo en la proteína de una fenilalanina por una valina en la posición 617 (JAK2 V617F). Esta mutación se encuentra en el 95% de pacientes con PV, y en la mitad de los casos de TE o MP. Se han descripto metodologías que permiten identificar esta mutación: dentro de las más utilizadas se encuentran la ARMS PCR (del inglés Amplification Refractory Mutation System PCR), la secuenciación y recientemente la HRM (High Resolution Melting). En este trabajo se estudió la detección de JAK2 V617F en muestras de pacientes con desórdenes mieloproliferativos mediante HRM, determinando especificidad y sensibilidad de la misma, comparándola con la ARMS PCR y la secuenciación. Los resultados demostraron que la técnica de HRM es superior a la secuenciación y equivalente a la ARMS PCR. Las metodologías sensibles y específicas para la detección de JAK2 V617F, en pacientes con neoplasias mieloproliferativas, son de gran importancia a nivel diagnóstico ya que permiten diferenciar entre desórdenes neoplásicos y condiciones reactivas.

Palabras clave: Neoplasias mieloproliferativas; Mutación V617F del gen JAK2; Análisis de disociación de alta resolución; Especificidad y sensibilidad.

Summary

Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (TE) and Primary Myelofibrosis (MP) are myeloproliferative neoplasias characterized by excessive proliferation of one or more myeloid lines. In 2005, a somatic mutation was identified in the Janus kinase 2 gene (JAK2), resulting in the replacement of a phenylalanine in the protein for a valine at position 617 (JAK2 V617F).
This mutation was found in 95% of patients with PV, and in half of the cases of TE or MP. Different methodologies have been described to identify this mutation: the most used are ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR), sequencing and recently HRM (High Resolution Melting). In this work, detection of JAK2 V617F was studied in samples from patients with myeloproliferative disorders using HRM, determining its specificity and sensitivity in comparison with ARMS PCR and sequencing. The results showed that the technique is superior to sequencing and equivalent to ARMS PCR. Sensitive and specific methodologies for the detection of JAK2 V617F in patients with myeloproliferative neoplasias are of great importance at diagnostic level since they can differentiate between neoplastic disorders and reactive conditions.

Keywords: Myeloproliferative neoplasias; Mutation V617F of JAK2 gene; High resolution melting; Specificity and sensitivity.

Resumo

Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MP) são neoplasias mieloproliferativas caracterizadas por uma proliferação excessiva de uma ou mais linhas mieloides. Em 2005, uma mutação somática foi identificada no gene Janus quinase 2 (JAK2), resultando na substituição na proteína de uma fenilalanina para uma valina na posição 617 (JAK2 V617F). Esta mutação é encontrada em 95% dos pacientes com policitemia vera, e na metade dos casos de TE ou MP. Foram descritas metodologias para identificar esta mutação: dentre as mais utilizadas estão ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR), sequenciamento e, recentemente, HRM (High Resolution Melting). Neste trabalho a detecção de JAK2 V617F foi estudada em amostras de pacientes com neoplasias mieloproliferativas usando HRM, determinando a sensibilidade e especificidade da mesma, comparando-a com a ARMS PCR e o sequenciamento. Os resultados mostraram que a técnica de HRM é superior ao sequenciamento e equivalente à ARMS PCR. Sensíveis e específicas para a detecção de JAK2 V617F em pacientes com neoplasias mieloproliferativas, as metodologias são de grande importância em nível de diagnóstico, uma vez que permitem diferenciar entre doenças neoplásicas e condições reativas.

Palavras-chave: Neoplasias mieloproliferativas; Mutação V617F do gene JAK2; Análise de dissociação em alta resolução; Especificidade e sensibilidade.

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Introducción

Las neoplasias mieloproliferativas son un grupo de enfermedades caracterizadas por una excesiva producción de células sanguíneas, dentro de las cuales se encuentran la Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Esencial (TE), la Mielofibrosis Primaria (MP) y la Leucemia Mieloide Crónica (LMC). En estos trastornos clonales, estrechamente relacionados, las líneas sanguíneas afectadas son: eritrocitos, en el caso de PV; plaquetas, en el caso de TE, leucocitos en el caso de LMC, fibroblastos de la médula ósea en casos de MP, que ocasionan un funcionamiento anormal de las células, presentando hipersensibilidad a los factores del crecimiento. Durante 2005 se describió una mutación somática en el gen JAK2 (del inglés Janus Kinase 2), debida a la sustitución de una guanina por una timina en el nucleótido 1849 del exón 14, la cual resulta en el reemplazo de una valina por una fenilalanina en la posición 617 del dominio JH2 de la proteína, por la cual se denomina a la mutación JAK2 V617F ^(1-3).
Kralovics et al ⁽⁴⁾ han demostrado que esta mutación participa en la patogenia de las neoplasias mieloproliferativas , debido a que contribuye a la expansión clonal de estos desórdenes, especialmente por una ganancia de función del gen JAK2 y una activación constitutiva de la proteína ⁽⁴⁾. Según el tipo celular donde ocurra esta mutación, el desorden que genera es distinto. En el caso de que la mutación se produzca en los glóbulos rojos, el fenotipo que genera es la PV. En el caso de las plaquetas, es la TE, y si el tipo celular afectado son los neutrófilos, genera MP.
El valor diagnóstico principal de detectar la presencia de JAK2 V617F consiste en la demostración de clonalidad, permitiendo el diagnóstico diferencial entre condiciones neoplásicas respecto a las reactivas, como la poliglobulia secundaria y la trombocitosis reactiva.
La presencia de JAK2 V617F ha sido reportada en la mayoría de los pacientes con neoplasias mieloproliferativas; la misma puede ser detectada en el 95% de los casos de PV, y en la mitad de los casos de TE o MP ⁽³⁾. También se ha descripto la detección de JAK2 V617F en algunos pacientes con LMC ^(5-7).
La identificación reciente de esta mutación representa un importante avance en el conocimiento de la patogenia de estas neoplasias. Se han descripto diversas metodologías que permiten identificar la mutación. Según el criterio utilizado para el diagnóstico, el tipo de muestra, la sensibilidad y especificidad técnica, existen discordancias en la tasa de incidencia de JAK2 V617F en casos de PV, TE y MP ⁽⁸⁾. Dentro de las técnicas más utilizadas se encuentran: ARMS PCR (del inglés Amplification Refractory Mutation System PCR), la secuenciación y la nueva técnica HRM (del inglés High Resolution Melting), considerándose la técnica de ARMS PCR como la más sensible para la detección de JAK2 V617F ⁽⁹⁾.
El análisis de HRM es una metodología post-PCR que permite la identificación de variaciones en la secuencia de ADN, basada en el análisis de curvas de fusión de fragmentos de ADN, amplificados mediante PCR en tiempo real. Esta técnica requiere de una PCR con excelente eficiencia, además de un software dedicado ⁽¹⁰⁾. Las curvas de fusión son generadas a partir del monitoreo de fluorescencia emitida por un intercalante de ADN, que se encuentra en cantidad saturante y que no inhibe la reacción. Para ello, se eleva la temperatura de la muestra a través de un rango de temperaturas a medida que la fluorescencia va siendo recolectada. Cualquier cadena doble hebra presente en la muestra emitirá fuertemente fluorescencia a bajas temperaturas. Pero a medida que esta última aumenta, la fluorescencia disminuye al principio, lentamente, hasta que a una determinada temperatura, decae de manera abrupta, reflejando la temperatura de melting (Tm). La Tm depende de la secuencia, el contenido de GC y del largo de la secuencia del producto de PCR ⁽¹²⁾. Mediante el análisis por HRM se pueden detectar variaciones de secuencia de una sola base como los polimorfismos de única base, SNPs, (del inglés Single Nucleotide Polymorphisms) o descubrir mutaciones genéticas desconocidas. También se puede utilizar para detectar cuantitativamente una pequeña parte de ADN mutado en un background de ADN wild type (WT), con sensibilidades cercanas al 5% ^(11-13).
Se han descripto varias metodologías para la detección JAK2 V617F mediante análisis de curvas de melting ^{(14) (15)}. En el año 2009 Rapado et al describieron una metodología por análisis de curvas de melting de alta resolución para la detección de esta mutación ⁽¹⁶⁾. Debido a la alta frecuencia con que JAK2 V617F se encuentra en la PV y en menor grado en la TE y la MP, se ha postulado que la detección de esta mutación tendría un fuerte impacto en el diagnóstico, la clasificación y el tratamiento de estas entidades.
El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de una metodología de High Resolution Melting para la detección de JAK2 V617F en muestras de pacientes con neoplasias mieloproliferativas y la comparación de la metodología de HRM a nivel de especificidad y sensibilidad para detectar JAK2 V617F con las técnicas de secuenciación y ARMS PCR.

Materiales y Métodos

Materiales

MUESTRAS DE PACIENTES
Se extrajo sangre periférica de 33 pacientes con síndromes mieloproliferativos. La sangre fue extraída por punción venosa (antebrazo) y recolectada en un tubo de plástico estéril con anticoagulante EDTA. Las muestras fueron obtenidas en el Servicio de Hematología de la Clínica Colón, Mar del Plata, Argentina. Se incluyeron pacientes con diagnóstico de PV, TE, MP, LMC y poliglobulia. Todos los pacientes dieron consentimiento escrito voluntario para participar del estudio y se respetaron las recomendaciones de Helsinki durante el mismo. Además, se procesaron 10 muestras controles, 5 muestras positivas y 5 muestras negativas caracterizadas previamente por ARMS PCR, las cuales fueron utilizadas para la validación inicial de las técnicas desarrolladas.

Métodos

EXTRACCIÓN DE ADN
La extracción de ADN, se llevó a cabo con el equipo Axyprep Blood Genomic DNA Miniprep (Axygen, Tewksbury, MA, EE.UU.), según instrucciones del fabricante. El ADN extraído fue resuspendido en 100 μL de buffer TE y conservado a -20 °C.

CUANTIFICACIÓN DE ADN
Se llevó a cabo la cuantificación de ADN presente en las muestras extraídas mediante el equipo Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), utilizando el termociclador en tiempo real Rotor Gene 6000 según indicaciones del fabricante. Todas las muestras utilizadas en este estudio presentaron una concentración de ADN entre 10 y 50 ng/μL de ADN.

DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN V617F DEL GEN JAK2
Para detectar la mutación JAK2 V617F se llevaron a cabo las siguientes técnicas: ARMS PCR (17) modificada por ser realizada mediante PCR en tiempo real, HRM y Secuenciación. Todas estas técnicas involucraron la PCR en tiempo real.
Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en un equipo Rotor Gene Q (Qiagen, Hilden, Alemania) utilizando una mezcla con el intercalante fluorescente EvaGreen preformada y optimizada de todos los componentes de la reacción (Biodynamics SRL, BsAs, Argentina), exceptuando primers, moldes y agua, en un volumen final de 20 μL y por duplicado.

ARMS PCR modificada
Consiste en dos reacciones complementarias: una contiene primers específicos para amplificar ADN WT y la segunda, primers específicos que amplifican la secuencia de ADN mutado (MT). En la primera reacción los primers utilizados, Fwt (Wild Type, 5´-GCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATG) y RO (5´-ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGAT-3´) permiten amplificar una secuencia de 229 pb detectando la presencia del alelo WT. Durante la segunda reacción los primers FO (5´-TCCTCAGAACGTTGATGGCAG-3´) y Rmt (5´-GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3´) (mutante), amplifican una secuencia de 279 pb perteneciente al alelo mutado. El programa de ciclado consistió en una desnaturalización inicial de 3 min de 95 °C y 40 ciclos de 25 s a 9 °C, 40 s a 5 °C y 40 s a 72 °C. Luego de las reacciones se efectuó un análisis de melting convencional de 72 a 85 °C para detectar el genotipo de cada muestra, el alelo WT presentó una Tm de 79,8 °C, mientras que el alelo mutado presentó una Tm de 81,3 °C.

Análisis de disociación de alta resolución (HRM)
Esta técnica se llevó a cabo como un análisis post- PCR para la identificación de la mutación JAK2 V617F. Como primer paso, se realizó una amplificación por PCR en tiempo real de un fragmento de 180 pb perteneciente al exón de interés con los primers 5´-TTCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGA-3´ y Rv 5´-CTGACACCTAGCTGTGATCC-3´ ⁽¹⁶⁾. El programa de ciclado consistió en una desnaturalización inicial de 3 min de 95 °C y 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 56 °C y 20 s a 72 °C. Una vez finalizada la amplificación se efectuó el análisis por HRM mediante el programa Rotor Gene Q Series. Como controles internos, se procesó una muestra heterocigota mutado (GT) y una homocigota normal (GG); además se procesó un control negativo de amplificación sin templado.

SECUENCIACIÓN DE ADN
Los productos de PCR de 180 pb generados luego del estudio por HRM fueron analizados por secuenciación. Para ello, se sembraron en un gel de agarosa 1,5% y posteriormente se purificó la banda de interés de 180 pb. La purificación se llevó a cabo mediante el equipo Zymoclean Gel DNA Recovery (ZymoResearch, Irvine, CA, EE.UU.) según recomendaciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación fueron realizadas en un secuenciador CEQ 2000XL de Beckman Coulter (Fullerton, CA, EE.UU.), siguiendo los protocolos del fabricante. Una vez recibidas las secuencias se analizaron los electroferogramas mediante el programa Sequence Scanner V1.0 (Applied Biosystems).

CÁLCULO DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD
Se realizaron los cálculos de sensibilidad y especificidad de las técnicas HRM y secuenciación para la detección de JAK2 V617F, en estado heterocigota, con respecto a la técnica ARMS PCR, tomando en cuenta para los cálculos, todas las muestras de pacientes y los 10 controles.
Para determinar la sensibilidad de las técnicas para detectar la mutación JAK2 V617F, se realizó el siguiente cálculo:

Siendo VP: Verdaderos positivos y FN: Falsos negativos.
Para determinar la especificidad de las técnicas para detectar la mutación JAK2 V617F, se realizó el siguiente cálculo:

Siendo VN: Verdaderos negativos y FP: Falsos Positivos.

Resultados

Se realizó la detección de la mutación JAK2 V617F en todas las muestras de pacientes y en los controles, mediante tres técnicas; HRM, AMRS PCR y secuenciación, para comparar la sensibilidad y especificidad de las mismas. En la Tabla I se encuentran representados los resultados de las tres técnicas (ARMS PCR, HRM, Secuenciación) aplicadas al estudio de la mutación JAK2 V617F junto al diagnóstico de cada paciente.

Tabla I. Resultados de los análisis por HRM, ARMS PCR y secuenciación para las muestras estudiadas: Se analizaron todas las muestras de pacientes con diferentes diagnósticos: Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Esencial (TE), Mielofibrosis Primaria (MP), Leucemia mieloide crónica (LMC) y poliglobulia (P).

VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE HRM
Como primer paso, se realizó una amplificación por PCR en tiempo real de un fragmento de 180 pb perteneciente al exón de interés. Luego se llevó a cabo el análisis HRM (Figura 1).

Figura 1. Curvas de HRM para las distintas muestras analizadas. Curvas de HRM en función de la fluorescencia con respecto a la temperatura. Las muestras WT presentan un pico máximo de fluorescencia a los 80 ºC de temperatura. Las muestras V617F presentan dos picos a los 79 ºC y 80 ºC.

El análisis post-PCR se realizó con un rango de temperatura de entre 75-85 ºC. En la Figura 1 se observan las distintas curvas de melting obtenidas que representan la variación de la fluorescencia en función de la temperatura. Las muestras heterocigotas para la mutación V617F se observan en las curvas que presentan dos picos a 79 ºC y 80 ºC y las muestras negativas, WT, son las que presentan un solo pico a los 80 ºC.
Dado que se trata de una técnica novedosa se detallarán a continuación los pasos seguidos para el análisis en los ensayos de HRM.
Como primera medida, luego de cada amplificación se normalizaron las lecturas de fluorescencia. Para ello se utilizó el software Rotor Gene Q Series que permitió identificar áreas de pre- y post-melting en la zona estable de fluorescencia. Por ese motivo se colocaron las barras de normalización según el gráfico A de la Figura 2.

Figura 2. Normalización de las curvas de melting. A. Curvas de melting en función de la fluorescencia con respecto a la temperatura. Las muestras fueron analizadas con un instrumento Rotor Gene que recolectó señales fluorescentes cada 0,1 ºC de incremento de temperatura. Finalizada la corrida, en el grafico se colocaron barras pre- y post-melting en la zona estable de fluorescencia. B. Curvas normalizadas de las muestras homocigota normal (GG) y heterocigota mutado (GT).

Luego, se normalizó con respecto a un control homocigota normal (GG) y el software Rotor Gene Q Series estableció el genotipo de cada muestra analizada con un porcentaje de confianza de un 90% (Figura 3).

Figura 3. Fluorescencia normalizada respecto a controles Wild type: Se normalizaron las muestras con respecto a un control homocigota normal (GG).

La normalización de las muestras permitió eliminar las diferencias en el background de fluorescencia de modo de incrementar la habilidad del software de detectar las diferencias sutiles que pueden existir en el perfil de melting. Los resultados obtenidos para todas las muestras analizadas figuran en la Tabla I.
En la Figura 4 se muestra el electroferograma correspondiente a la muestra de un paciente WT para la mutación, en donde se observa la presencia de guanina en la posición 1849 del exón 14 en el gen JAK2, siendo homocigota normal para la mutación (A). En la Figura 4 (B) puede observarse la presencia de guanina y timina en la misma posición, demostrando que el paciente es heterocigota mutado. Los resultados obtenidos de todas las muestras analizadas por secuenciación se encuentran en la Tabla I.

Figura 4. Electroferograma que muestra la secuencia parcial del exón 14 del gen JAK2. A. Se observa la presencia de guanina y ausencia de timina en la posición 1849 del exón 14 del gen JAK2 (homocigota normal) B. Se evidencia la presencia de guanina y timina en la posición 1849 del exón 14 del gen JAK2 (heterocigota mutado).

CÁLCULO DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD PARA LA TÉCNICA DE HRM DESARROLLADA
Los cálculos se realizaron con respecto a la técnica de ARMS PCR debido a que se considera como la más sensible para la detección de esta mutación ⁽⁹⁾.Tanto la especificidad como sensibilidad de la técnica HRM desarrollada para la detección de JAK2 V617F fue del 100% (especificidad calculada: 26/26+0=100%, sensibilidad calculada: 17/17+0=100%).

CÁLCULO DE ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD PARA LA TÉCNICA DE SECUENCIACIÓN
Los mismos cálculos realizados para la técnica de HRM, fueron utilizados para la determinación de la sensibilidad y especificidad de la técnica de secuenciación, obteniéndose los siguientes resultados: sensibilidad 94% (17/17+1) y especificidad 100% (26/26+0). Para la muestra correspondiente al paciente 13, las técnicas de HRM y ARMS PCR detectaron la presencia de JAK2 V617F, mientras que no fue detectada por la técnica de secuenciación.

Discusión y Conclusiones

Con el advenimiento de la medicina personalizada existe una gran necesidad de métodos rápidos y precisos para la detección de mutaciones asociadas a las diferentes patologías. Una tecnología ideal debe ser lo suficientemente sensible como para detectar las mutaciones aun existiendo cantidades significativas de contaminación con células WT. En el caso particular de la detección de JAK2 V617F, una técnica de alta sensibilidad es esencial ya que ésta es una mutación adquirida, cuya carga alélica va en aumento con el avance de la enfermedad. Además debe ser robusta, rápida, simple y rentable para ser fácilmente llevada a cabo en un laboratorio de diagnóstico. La técnica de HRM es una técnica emergente para la detección de mutaciones en muestras clínicas. La HRM es un método no destructivo que permite un análisis posterior de los productos de PCR mediante electroforesis en gel o secuenciación. Provee un sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación, el tiempo de análisis y no requiere de procesamiento o separación después de la PCR.
Basado en su facilidad de uso, bajo costo, sensibilidad y especificidad, la HRM es la herramienta por excelencia para distintas aplicaciones: screening y detección de mutaciones, metilación, genotipado, búsqueda de SNPs, entre otras ^(11-13).
Está descripto que alrededor de un tercio de los pacientes con PV, 20 a 30% de aquellos con MP y menos del 5% con TE, son homocigotas para la mutación JAK2 V617F. En el presente estudio en todos los casos en los que se ha encontrado la presencia de JAK2 V617F fue en estado heterocigota, de modo que en ninguno de los pacientes estudiados se ha llegado a la pérdida de heterocigosidad descripta en la bibliografía ⁽⁴⁾.
La determinación de la sensibilidad y especificidad de las técnicas de HRM y la secuenciación se realizaron con respecto a la técnica ARMS PCR, debido a que ésta se considera la técnica gold standard para la detección de la mutación JAK2 V617F ⁽⁹⁾. La secuenciación, si bien permite identificar de manera precisa el tipo de mutación presente, tiene las desventajas de poseer alto costo relativo y limitada sensibilidad, lo cual se comprobó en el presente trabajo, en donde se calculó para esta técnica un 100% de especificidad pero un 94% de sensibilidad. Este último porcentaje se debió a que no se detectó JAK2 V617F en la muestra del paciente número 13, aunque sí fue detectada con las otras dos metodologías. Esto puede deberse a que en ese paciente la cantidad de mutación presente haya sido menor al 20%, límite para la detección de mutaciones por secuenciación.
En el presente trabajo la metodología de HRM previamente descripta por Rapado et al (16) mostró una sensibilidad y especificidad del 100% con respecto a la técnica de ARMS PCR, con lo cual demuestra ser una herramienta fiable para la detección de JAK2 V617F, demostrando además ser más sensible que la secuenciación. La detección precisa de JAK2 V617F es de gran importancia a nivel diagnóstico ya que permite diferenciar entre desórdenes neoplásicos y condiciones reactivas. La técnica de HRM es una metodología sensible y específica que podría utilizarse para la detección de JAK2 V617F en pacientes con neoplasias mieloproliferativas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica de la República Argentina por la financiación de proyecto mediante su instrumento FONTAR ANR 600 BIO Bioingeniería 2010 Nº 018/10.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 3 de enero de 2014
Aceptado: 27 de mayo de 2014