BIOLOGÍA MOLECULAR

Análisis de los polimorfismos europeos en el gen Lactasa entre grupos étnicos del Caribe Colombiano

Analysis of the European polymorphisms in lactase gene between ethnic groups in the Colombian Caribbean

Análise dos polimorfismos europeus no gene lactasa entre os grupos etnicos do Caribe Colombiano

 

Evelyn Mendoza Torres^1a, Lourdes Luz Varela Prieto^1a, José Luis Villarreal Camacho^1a, Marena Luz Rodríguez Ferrer^1a, Enio Armando Hernández Aguirre^1b, Carlos Arturo Silvera Redondo^2b, Daniel Antonio Villanueva Torregrosa^2a

¹ M. Sc.
² Ph. D.
^a Grupo de Investigación en Bioquímica Patológica; Programa de Medicina, Universidad Libre, Barranquilla, Colombia.
^b Grupo de investigación en Genética y Medicina Molecular; Programa de Medicina, Universidad del Norte, Barranquilla, Colombia.

CORRESPONDENCIA DANIEL ANTONIO VILLANUEVA TORREGROSA, Ph. D. Dirección: Km 7 Vía a Puerto Colombia, BARRANQUILLA, Colombia. Teléfono: +57 5 3673800 Fax: +57 5 3598567 E-mail: danielvillanueva@unilibrebaq.edu.co

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Resumen

La prevalencia de hipolactasia tipo adulto está influenciada por la etnicidad y la geografía. Los genotipos CC y GG, de los SNPs C/T-13910 y G/A-22018, respectivamente determinan hipolactasia en ciertos grupos étnicos y países del mundo. El objetivo de este estudio fue analizar estos SNPs en muestras de los tres grupos étnicos que habitan el Caribe Colombiano. Trescientos sesenta y un sujetos, agrupados como afrodescendientes, indígenas y mestizos, fueron genotipificados usando PCR/RFLP. El análisis genético se hizo mediante Arlequin 3.11 y las frecuencias genotípicas fueron comparadas con Statgraphics Centurion XVI. Solamente el SNP C/T-13910 mostró equilibrio de Hardy- Weinberg y no hubo desequilibrio de ligamiento entre los SNPs estudiados. La frecuencia del genotipo CC-13910 fue 90% en afrodescendientes, 95% en indígenas y 80% en mestizos. En indígenas la frecuencia de GG-22018 fue 23% pero dicho genotipo no se halló en afrodescendientes y mestizos. El genotipo AA-22018 no se halló en indígenas. Ningún grupo presentó el genotipo TT-13910. Las frecuencias genotípicas fueron estadísticamente diferentes entre los grupos estudiados y las de los genotipos CC-13910 y GG-22018 no concordaron con las frecuencias fenotípicas reportadas en otros estudios. Los resultados sugieren que la posibilidad diagnóstica de hipolactasia mediante genotipificación de estos polimorfismos es escasa en el Caribe Colombiano.

Palabras clave: Hipolactasia tipo adulto; Persistencia de lactasa; Genotipificación; Polimorfismo; Genotipo; Fenotipo.

Summary

The prevalence of adult-type hypolactasia is influenced by ethnicity and geography. The CC and GG genotypes of the SNPs C/T-13910 and G/A-22018, respectively indicate hypolactasia in certain ethnic groups worldwide. The aim of this study was to analyse these SNPs in samples of the three ethnic groups that inhabit the Colombian Caribbean. Three hundred and sixty-one subjects were genotyped using PCR/RFLP. These subjects were grouped as being of African descent, Indigenous and Mestizo. The genetic analysis was performed through Arlequin 3.11 and genotype frequencies were compared with Statgraphics Centurion XVI. Only SNP C/T-13910 showed Hardy-Weinberg equilibrium and there was no linkage disequilibrium between the SNPs. The frequency of CC-13910 was 90% in Afro-descendant, 95% in indigenous people and 80% in mestizos.The frequency of GG-22018 was 23% in indigenous people, but this genotype was not present in afro-descendants and Mestizos. The indigenous people did not have AA-22018, and none of the groups had TT-13910. The genotype frequencies were statistically different among the groups studied and the frequencies of CC-13910 and GG-22018 were not in concordance with the phenotype frequencies reported in other papers. The results suggest that diagnostic possibility of hypolactasia by genotyping of those polymorphisms in the Colombian Caribbean population is scarce.

Key words: Adult-type hypolactasia; Lactase persistence; Genotyping; Polymorphism; Genotype; Phenotype.

Resumo

A prevalência da hipolactasia primária tipo adulto é influenciada pela etnicidade e a geografia. Os genótipos CC e GG, dos SNPs C/T-13910 e G/A-22018, respectivamente, são determinantes da hipolactasia em alguns grupos étnicos e países do mundo. O objetivo do presente estudo foi analisar estes SNPs em amostras dos três grupos étnicos do Caribe Colombiano. Trezentas e sessenta e uma pessoas reunidas como afrodescendentes, indígenas e mestiços foram genotipificadas utilizando PCR/RFLP. A análise genética foi realizada usando o software Arlequin 3.11 e as frequências genotípicas foram comparadas com o Statgraphics Centurion XVI. Somente o SNP C/T-13910 mostrou equilíbrio de Hardy-Weinberg e não houve desequilíbrio de ligamento entre os SNPs estudados. A frequência do genótipo CC-13910 foi de 90% para afrodescendentes, 95% para indígenas e 80% em mestiços. Nos indígenas a frequência de GG-22018 foi de 23% mas tal genótipo não esteve presente na população de afrodescendentes e mestiços. O genótipo AA-22018 não foi encontrado em indígenas. Nenhum grupo apresentou o genótipo TT-13910. As frequências genotípicas foram estatisticamente diferentes entre os grupos avaliados e as dos genótipos CC-13910 e GG-22018, não concordaram com as frequências fenotípicas relatados em outros estudos. Os resultados sugerem que a possibilidade diagnóstica de hipolactasia através de genotipificação destes polimorfismos é escassa em populações do Caribe Colombiano.

Palavras chave: Hipolactasia tipo adulto; Persistência da lactase; Genotipificação polimorfismo; Genótipo; Fenótipo.

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Introducción

La Lactasa (EC 3.2.1.23), enzima que hidroliza la lactosa hasta sus respectivos monosacáridos, glucosa y galactosa, se encuentra en las microvellosidades del intestino delgado y presenta actividad máxima durante la niñez temprana ^(1-3). La caída progresiva de la actividad lactasa, después del destete, hasta llegar en el adulto a solo 5-10% de la actividad máxima, constituye el fenotipo Hipolactasia Primaria Tipo Adulto (HPTA), también llamado no-persistencia de lactasa. Este fenotipo, heredable como rasgo autosómico recesivo, se expresa en la mayoría de la humanidad (75%) y su prevalencia varía de acuerdo con la etnia y la geografía ^(4-6). En cambio, en la minoría restante persiste elevada la actividad lactasa durante toda la vida adulta, debido a la expresión del fenotipo conocido como Persistencia de Lactasa (PL), característico de poblaciones del norte de Europa, del norte de la India y de algunas tribus pastoriles africanas ^(7-9).
El diagnóstico de HPTA es importante porque este fenotipo suele ser una de las causas de intolerancia a la lactosa, un síndrome clínico caracterizado por flatulencia, diarrea y dolor abdominal ⁽¹⁰⁾. El método de diagnóstico directo, considerado estándar de oro, es la determinación de la actividad de la enzima en biopsia de mucosa intestinal. Este método es invasivo, costoso, complejo y refleja la realidad fisiológica de un punto particular a nivel intestinal ⁽¹¹⁾. Una alternativa diagnóstica novedosa y no invasiva es la genotipificación de polimorfismos tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) estrechamente asociados a los fenotipos PL/HPTA; su objetivo es la identificación de genotipos y alelos responsables de la PL o de la HPTA ⁽¹²⁾.
Enattah et al. demostraron, en sujetos finlandeses, asociación del 100% para el SNP C/T-13910 y del 96% para el SNP G/A-22018 ⁽¹³⁾. Desde entonces, el análisis de estos polimorfismos, situados corriente arriba del gen lactasa (LCT), en regiones intrónicas del gen MCM6 (Minichromosome Maintenance Complex Component), localizado en la región cromosómica 2q21, facilita el diagnóstico de PL/HPTA en descendientes de caucásicos, al identificar los genotipos. En efecto, los individuos CC-13910 y GG-22018 expresan el fenotipo HPTA; en cambio los individuos TT-13910, C/T-13910, AA- 22018 y G/A-22018 expresan el fenotipo PL. Esto significa que los alelos T-13910 y A-22018 están presentes, solamente, en individuos PL (14-16). Según Kuokkanen et al., su función sería regular la expresión de LCT activando su transcripción ⁽¹⁷⁾.
La alta frecuencia del alelo de persistenciaT*-13910 es típica en poblaciones PL de países del norte y del centro de Europa ^(13-15). Lo opuesto es propio de poblaciones PL del Africa Sub-Sahariana, de la península Arábiga y de Sudán ^(18-21). Mientras tanto, estudios realizados en brasileños de origen japonés y en hindúes del norte revelan alta frecuencia del alelo de persistencia A*-22018 y mejor capacidad de predicción de PL/HPTA del SNP G/A- 22018, en comparación con el SNP C/T-13910 ^(22)(23).
El objetivo del presente trabajo fue analizar los SNPs C/T-13910 y G/A-22018 en muestras de los tres grupos étnicos que actualmente habitan el Caribe Colombiano, a saber: mestizos, afrodescendientes e indígenas (amerindios).

Materiales y Métodos

MUESTRA
Para este estudio, se obtuvo el consentimiento informado de 502 individuos de los cuales 361 (edad media 32±6 años), de ambos géneros, no emparentados, pertenecientes a diferentes grupos étnicos con asentamiento en la región del Caribe Colombiano, fueron seleccionados, así: 130 afrodescendientes, habitantes de San Basilio de Palenque-Bolívar; 103 indígenas residentes en la Sierra Nevada de Santa Marta y 128 mestizos, habitantes de diferentes zonas de la región del Caribe Colombiano. Tanto los indígenas como los afrodescendientes habitaban zonas rurales, distantes de la Universidad donde se hizo el estudio y poseían condiciones geográficas, sociales y culturales sui generis que dificultaban el acceso. Dentro de cada grupo existió homogeneidad histórico-cultural y se verificó que los ascendientes de los individuos participantes en el estudio, hasta el cuarto grado de consanguinidad, pertenecían al respectivo grupo étnico.
El estudio se ajustó a la declaración de Helsinki, fue revisado y aprobado por el comité de Ética Científica de la Universidad Libre Seccional Barranquilla y los sujetos participantes firmaron el respectivo consentimiento informado para la realización de procedimientos.

GENOTIPIFICACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS TIPO SNP C/T-13910 Y G/A-22018
Se utilizó ADN genómico obtenido a partir de sangre venosa. Para su extracción y purificación se utilizó el equipo Wizard®Genomic (Promega®, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La identificación de los polimorfismos se hizo mediante la tecnología PCR/ RFLP (Polymerase Chain Reaction/Restriction Fragment Length Polymorphism).
La región que contiene el SNP C/T-13910 fue amplificada por PCR con los cebadores: 5'-GCTGGCAATACAGATAAGATAATGGA-3' y 5'-CTGCTTTGGTTGAAGCGAAGAT-3' ⁽¹⁸⁾. La reacción de PCR se llevó a cabo en un Termociclador PTC-100 (MJ Research®, Canadá) con un volumen total de 20 μL, que contenía tampón de PCR 1X (Tris-HCl 20 mM, pH 9,0); MgCl2 1,5 mM; dNTPs 0,2 mM; 1,5 U de Taq polimerasa y cebadores 1 μM, todos de Invitrogen®, EE.UU. Las condiciones de PCR fueron: una etapa de desnaturalización inicial a 95 ºC por 10 min seguida de 35 ciclos de 95 ºC por 1 min, anillamiento a 59 ºC por 1 min, elongación a 72 ºC por 1 min, y una elongación final a 72 ºC por 8 min. El producto de PCR fue digerido con la enzima HinfI de acuerdo con las instrucciones del fabricante (New England Biolabs®, EE.UU.). Cuando en el sitio de restricción estaba el alelo T*-13910, en la digestión se obtenían dos fragmentos de restricción, uno de 177 pb y otro de 24 pb, en cuyo caso el genotipo de la muestra se identificó como TT-13910. La presencia de un solo fragmento de 201 pb facilitó identificar el genotipo CC-13910 y la presencia de tres fragmentos de 201 pb, 177 pb y 24 pb, permitió la identificación del genotipo CT-13910.
La región que contiene el SNP G/A-22018 fue amplificada con los cebadores 5'-CTCAGTGATCCTCCCACCTC-3' y 5'-CCCCTACCCTATCAGTAAAGGC-3' ⁽²⁴⁾. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 20 μL, los cuales contenían: tampón 1X Tris-HCl 20 mM pH 9,0; MgCl2 1,5 mM; dNTPs 0,2 mM; 1,5 U de Taq polimerasa y primers 1 μM, todos de Invitrogen®, EE.UU. Las condiciones de PCR fueron: una desnaturalización inicial a 95 ºC por 10 min seguida de 34 ciclos de 95 ºC por 1 min, anillamiento a 62 ºC por 1 min, elongación a 72 ºC por 1 min, y una elongación final a 72 ºC por 8 min. El producto de PCR fue digerido con la enzima HhaI de acuerdo con las instrucciones del fabricante (New England Biolabs®, EE.UU.). Cuando en el sitio de restricción estaba el alelo G*-22018, en la digestión se obtenían dos fragmentos de restricción, uno de 196 pb y otro de 75 pb, en cuyo caso el genotipo de la muestra se identificó como GG-22018. La presencia de un solo fragmento de 271 pb facilitó identificar el genotipo AA-22018 y la presencia de tres fragmentos de 271 pb, 196 pb y 75 pb, permitió la identificación del genotipo GA-22018.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para determinar las frecuencias alélicas y genotípicas, el equilibrio de Hardy Weinberg y el desequilibrio de ligamiento, se utilizó el programa Arlequín versión 3.11 ⁽²⁵⁾. Con el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI versión 16.1.15 (Stat Point Technologies, Inc. 460 Mendoza Torres E et al. 2009) se aplicó la prueba de Chi-cuadrado para comparar las frecuencias genotípicas y alélicas entre las poblaciones. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas para valores de p <0,05.

Resultados

La distribución de los genotipos para los SNPs estudiados se muestra en la Tabla I. La comparación entre los genotipos CC-13910 y GG-22018, indicativos de HPTA en Europa, según Enattah et al. ⁽¹³⁾, y la frecuencia de HPTA reportada en otros estudios para los grupos étnicos estudiados se presentan en la Tabla II.

Tabla I. Distribución de los genotipos para los SNPs C/T-13910 y G/A-22018 en los diferentes grupos.

Tabla II. Comparación entre los genotipos CC-13910/GG-22018 y la frecuencia de HPTA, reportada por otros autores.

* El promedio de los resultados de diferentes estudios hechos en poblaciones africanas de donde provinieron los ancestros de los actuales pobladores del Palenque de San Basilio (Cook et al. 1966; Kretchmer et al. 1971; Scrimshaw et al. 1988).
** Indígenas colombianos (Alzate et al. 1969).
*** El promedio de dos estudios hechos con mestizos colombianos. El fenotipo fue evaluado mediante la prueba de hidrógeno en el aliento (Angel et al. 2005; Mendoza et al. 2012).

Todos los grupos estuvieron en equilibrio de Hardy- Weinberg para el SNP C/T-13910 (p<0,05) pero no para el SNP G/A-22018 (p>0,05). En ningún grupo se encontró desequilibrio de ligamiento entre los SNPs estudiados (p>0,05). Con respecto a los genotipos CC-13910 y CT-13910, hubo diferencia significativa (p<0,05) entre las frecuencias de los grupos estudiados. De igual manera, hubo diferencia significativa entre las frecuencias de los genotipos GG-22018, GA-22018 y AA-22018 (p<0,05). Las mayores diferencias se apreciaron al comparar las frecuencias de los genotipos de los grupos indígena y mestizo.

Discusión y Conclusiones

El perfil étnico de la población actual del Caribe Colombiano indica que ella está conformada por tres grupos: los mestizos, significativamente mayoritarios, los afrodescendientes y los indígenas o amerindios. Los mestizos son el resultado de la mezcla de europeos (caucásicos españoles), africanos y amerindios que convergieron desde el descubrimiento de América ^(26)(27).
La distribución alélica y genotípica de los SNPs LCT en las poblaciones varía de acuerdo con su perfil étnico y determina en ellas la mayor o menor predisposición a presentar el fenotipo PL o el fenotipo HPTA (28). En este trabajo se analiza la distribución de los SNPs C/T-13910 y G/A-22018 en muestras de los grupos étnicos del Caribe Colombiano.
El análisis del SNP C/T-13910 mostró que en los grupos étnicos estudiados, el alelo T*-13910, determinante de la PL en Europeos ^(29)(30), se halla en muy baja frecuencia. Este resultado es consistente con los hallazgos de Mulcare et al. ⁽¹⁸⁾ en Senegal (0,06%) y Camerún (4%), pueblos de África occidental de donde proviene una parte de los ancestros de la población de Palenque de San Basilio ⁽³¹⁾, proclive al aislamiento étnico. También son consistentes estos hallazgos con los de Friedrich et al. ⁽³²⁾ quienes estudiaron poblaciones brasileñas de indígenas (0,5-7,6%) y de mestizos (17,5%) ⁽³³⁾.
La frecuencia del genotipo CC-13910 se encontró elevada en los sujetos de los grupos étnicos estudiados. Esta elevación de frecuencia, del genotipo ancestral de hipolactasia, podría ser el resultado de la herencia natural de los antepasados en quienes posiblemente no obró la presión evolutiva (29). En cambio, las frecuencias del genotipo GG-22018 fueron nulas o muy bajas. El análisis de las frecuencias de estos dos genotipos permite inferir: si, en los grupos estudiados, el genotipo CC-13910 estuviera asociado con HPTA, como lo está en europeos, entonces el 90% de los afrodescendientes, el 95% de los indígenas y el 80% de los mestizos serían hipolactásicos. Asímismo, si en los grupos étnicos estudiados el genotipo GG-22018 estuviera asociado con HPTA, como lo está en Europeos, entonces el 23% de los indígenas, 0% (ninguno) de los afrodescendientes y 0% (ninguno) de los mestizos serían hipolactásicos. Sin embargo, estos datos resultan inconsistentes frente a las frecuencias fenotípicas reportadas en la literatura para esos grupos, como se muestra en la Tabla II ^(34-37).
Con respecto al SNP G/A-22018, todos los grupos mostraron una alta frecuencia del alelo dominante A*-22018, un indicador del fenotipo PL en poblaciones del norte de Europa ⁽¹³⁾, al tiempo que mostraron ausencia o baja frecuencia del genotipo ancestral europeo de HPTA, GG-22018. Estos datos son congruentes entre sí, pero no concuerdan con los datos encontrados al estudiar el SNP C/T-13910. Esta diferencia es consistente con la ausencia de desequilibrio de ligamiento detectada entre los dos SNPs analizados en este estudio. La ausencia de equilibrio de Hardy- Weinberg del SNP G/A-22018 en todos los grupos, podría deberse a la influencia de corrientes migratorias antiguas, las cuales originaron mezclas genéticas que ahora se manifiestan como diferencias en la distribución de los alelos de persistencia de lactasa en las poblaciones aquí estudiadas ⁽³⁸⁾.
Al comparar la distribución del SNP C/T-13910 en los tres grupos étnicos, se observa que la distribución en los mestizos tiende a reflejar el aporte que los afrodescendientes y los indígenas ejercieron en el mestizaje. A la luz de estos resultados ahora es comprensible que la baja frecuencia del alelo T*-13910 en mestizos y la moderada concordancia genotipo-fenotipo encontrada por los autores en un estudio anterior, no solo se deba a la menor influencia que ejercieron los europeos a nivel del Caribe Colombiano sino también a la baja frecuencia del alelo T*-13910 que presentan otros grupos componentes del mestizaje ⁽³⁷⁾.
En síntesis, en este estudio se ha encontrado que: (a) los SNPs C/T-13910 y G/A-22018 no están en desequilibrio de ligamiento en los grupos étnicos estudiados; (b) el SNP C/T-13910 sí está en equilibrio Hardy-Weinberg, pero el SNP G/A-22018 no lo está; (c) en las poblaciones aquí estudiadas, las frecuencias genotípicas de los SNPs analizados difieren de las del estudio de Enattah et al. ⁽¹³⁾, tomado como referente; (d) hubo significativa diferencia entre las distribuciones genotípicas de los grupos étnicos estudiados; (e) las distribuciones genotípicas halladas en este estudio no concuerdan con las distribuciones fenotípicas reportadas en estudios realizados por otros autores.
Los hallazgos de este estudio, aunados a los de un estudio anterior, realizado en mestizos colombianos no caribeños, en el cual se halló baja concordancia genotipo-fenotipo al examinar el SNP-13910 ⁽³⁷⁾, sugieren que la posibilidad de predecir PL/HPTA en los grupos étnicos estudiados, basándose en la genotipificación de los SNPs europeos, es escasa. Mirando hacia el futuro, este trabajo exploratorio anima a estudiar: la existencia de polimorfismos diferentes asociados con PL/HPTA, la distribución de SNPs identificados en la literatura como propios de poblaciones africanas y la asociación fenotipo/genotipo para SNPs diferentes. Por otro lado, los datos obtenidos podrán ser fuente de información valiosa para estudios genéticos relacionados con migración y evolución.
Ciertas condiciones socioculturales, propias de los asentamientos rurales de negros e indígenas del Caribe Colombiano, fueron fuente de limitaciones para el estudio. Las dificultades de accesibilidad, la desconfianza de los nativos y los riesgos que corrieron los investigadores fueron factores negativos para obtener la muestra y evaluar el estatus de PL/HPTA de los sujetos. Aún más, la comparación con frecuencias fenotípicas basadas en otros estudios podría no reflejar la distribución real de HPTA en la población estudiada.
En conclusión, el análisis de los SNPs LCT europeos, C/T-13910 y G/A-22018, muestra que las frecuencias alélicas y genotípicas difieren según el perfil étnico de los grupos estudiados y sugiere que la posibilidad de diagnóstico molecular de LP/HPTA, con base en esos SNPs, es escasa en la población caribeña colombiana.

CONFLICTO DE INTERÉS

Evelyn Mendoza, Lourdes Varela, José Villarreal, Marena Rodríguez, Enio Hernández, Carlos Silvera y Daniel Villanueva declaran que no existe conflicto de interés entre ellos ni entre las entidades a las cuales ellos están vinculados.

FINANCIACIÓN

Este trabajo fue financiado por la Universidad Libre y la Universidad del Norte, ambas localizadas en Barranquilla-Colombia.

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Recibido: 26 de marzo de 2014
Aceptado: 15 de agosto de 2014