BIOQUÍMICA CLÍNICA

Desempeño analítico de un método cromatográfico para la cuantificación de hemoglobina glicosilada*

Analytical performance of a chromatographic method for the quantitation of glycated hemoglobin

Desempenho analítico de um método cromatográfico para a quantificação da hemoglobina glicosilada

 

Juan Antonio Verna¹, Fernando Daniel Ventimiglia², Jorge José Bruno³, Liliana Elena D’Agostino⁴

¹ Especialista en Química Clínica.
² Doctor en Bioquímica.
³ Bioquímico.
⁴ Especialista en Inmunología.
* Laboratorio D’Agostino-Bruno. Calle 14 nº 280. La Plata. C.P. 1900. La Plata. Buenos Aires. Argentina.

CORRESPONDENCIA JUAN ANTONIO VERNA Calle 14 nº 280. La Plata C.P.: 1900. LA PLATA. Buenos Aires. Argentina. Teléfono: 0221-4254900, int. 71. E-mail: supervisión@dagostino-bruno.com.ar

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Resumen

La determinación de la hemoglobina glicosilada (HbA_1C) ha sido propuesta en el año 2010 por la American Diabetes Association (ADA) como criterio diagnóstico de diabetes mellitus, siendo fundamental para el control y seguimiento de la glucemia a largo plazo. En este contexto, el laboratorio debe garantizar el cumplimento de los requisitos internacionales de calidad de forma de asegurar que el cambio en el resultado de HbA1C entre dos determinaciones sucesivas de un paciente sean el reflejo de una variación clínica y no de una variación analítica. En este trabajo se evaluó el desempeño analítico de un método cromatográfico, procesando controles comerciales provistos por el fabricante. Se calcularon el coeficiente de variación total, sesgo, error total, valor de referencia para el cambio y el cambio clínico significativo para el punto crítico de 7,0%-NGSP. El método evaluado cumplió con todos los requisitos internacionales de calidad establecidos, lo que permitiría asignar el cambio de la concentración de HbA1C en dos determinaciones sucesivas de un paciente, como debido a una modificación en la condición clínica del mismo y no a la variabilidad analítica.

Palabras clave: Hemoglobina glicosilada; HbA_1C; Cromatografía; Diagnóstico de diabetes; Método; Desempeño analítico; Error total; Valor de referencia para el cambio; Cambio clínicamente significativo.

Summary

Measurement of glycated hemoglobin (HbA_1C) was proposed in 2010 by the American Diabetes Association (ADA) as diagnostic criteria for diabetes mellitus, being essential for control and monitoring of blood glucose in the follow-up. In this context, the laboratory must ensure compliance with international quality requirements so as to guarantee that the change in the result of HbA1C between two successive determinations of a patient shows a clinical variation and not an analytical variation. In this paper, the analytical performance of a chromatographic method was evaluated by processing control samples provided by the manufacturer. The coefficient of total variation, bias, total error, reference value for the change and significant clinical change to the critical point of 7.0% -NGSP were calculated. The method evaluated met all international quality requirements, which would measure the change in HbA1C concentration in two successive determinations of a patient, due to a change in clinical condition and not to the analytical variability.

Key words: Glycated hemoglobin; HbA_1C; Chromatography; Diabetes diagnosis; Method; Analytical performance; Total error; Change reference value; Clinically significant change.

Resumo

A determinação da hemoglobina glicada (HbA_1C) foi proposta em 2010 pela Associação Americana de Diabetes (ADA) como critério de diagnóstico de diabetes mellitus, sendo essencial para o controle e seguimento de glicemia no longo prazo. Nesse contexto, o laboratório deve garantir o cumprimento dos requisitos internacionais de qualidade, de modo a garantir que a mudança no resultado de HbA1C entre dois testes consecutivos para um paciente sejam o reflexo de uma variação clínica e não de uma variação analítica. Nesse trabalho, o desempenho analítico de um método cromatográfico foi avaliado através de controles comerciais fornecidos pelo fabricante. Foram calculados o coeficiente de variação total, viés, erro total, valor de referência para a mudança e a alteração clínica significativa para o ponto crítico 7,0% -NGSP. O método avaliado cumpriu com todas as exigências internacionais de qualidade estabelecidas, o que permitiria atribuir a mudança da concentração de HbA1C em duas determinações consecutivas de um paciente, como devido a uma alteração no estado clínico do mesmo e não à variabilidade analítica.

Palavras-chave: Hemoglobina glicada; HbA_1C; Cromatografia; Diagnóstico de diabetes; Método; Desempenho analítico; Erro total; Valor de referência para a mudança; Alteração clínica significativa.

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Introducción

La prevalencia global de diabetes mellitus (DM) se ha incrementado rápidamente en los últimos años, más aún, actualmente la patología es considerada una pandemia. En este contexto, la determinación de hemoglobina glicosilada (HbA1C) fue propuesta en el año 2010 por la American Diabetes Association (ADA) como criterio diagnóstico ⁽¹⁾ siendo fundamental para el control y seguimiento de la glucemia a largo plazo ^(2-4). Se debe remarcar que la determinación debe ser efectuada por métodos certificados por el National Glycohemoglobin Standarization Program (NGSP) y estandarizados en concordancia con las especificaciones del Diabetes Control and Complications Trial ⁽¹⁾⁽²⁾. El criterio diagnóstico mencionado establece que los valores de HbA1C deben ser superiores a 6,5%-NGSP y se fundamenta en el progreso alcanzado en los ensayos de cuantificación de HbA1C por la implementación del programa de estandarización llevado a cabo por el NGSP ⁽⁵⁾. La diversidad de métodos basados en distintos principios físico químicos disponibles en el mercado nacional, con la consecuente variabilidad en los resultados, ha determinado que este criterio no haya sido aceptado aún por la Sociedad Argentina de Diabetes ⁽⁶⁾.
El objetivo del laboratorio es garantizar resultados confiables para la salud del paciente. En el caso específico de la determinación de HbA1C es de relevancia asegurar exactitud y precisión en las mediciones para lograr un control glucémico superior. Se ha evidenciado que los pacientes con valores de concentración promedio de HbA1C de 7,0%-NGSP consiguen una considerable disminución de las complicaciones micro y macro vasculares ⁽²⁾⁽³⁾. Para evitar el agravamiento en estos pacientes durante el seguimiento se intenta reducir la concentración de HbA1C en 0,5 puntos porcentuales o más ⁽⁷⁾, por lo que las mediciones realizadas en el laboratorio deben cumplir con los requisitos de calidad establecidos de manera de asegurar que los cambios de concentración observados sean debidos exclusivamente a una modificación clínica en el estado de salud del paciente y no causados por la variabilidad analítica. El parámetro o estadístico que mejor describe el cambio entre dos mediciones sucesivas del mismo paciente se conoce como valor de referencia para el cambio (VRC%). El VRC% contiene en su formulación la variabilidad biológica intraindividual y la imprecisión analítica, por lo que asegurando el buen desempeño analítico las variaciones detectadas que superan dicho valor indicarían un cambio clínicamente significativo ⁽⁸⁾⁽⁹⁾.
A lo largo del tiempo, con el progreso de los métodos de medición, las especificaciones analíticas para la determinación de HbA1C han aumentado su exigencia: en el año 2007, el error total aceptable (ETa%) fue 15%, en el año 2012 fue de 7% y a partir del año 2013 se estableció en 6% ^(5)(7)(10). De la misma manera, las pautas para el diagnóstico y manejo de la diabetes desde el laboratorio, indican que el coeficiente de variación porcentual intralaboratorio (CV%) debe ser menor al 2,0% y entre laboratorios, menor de 3,5% ⁽¹¹⁾. La International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) ha desarrollado un método de referencia primario, basado en el clivaje de un hexapéptido terminal y cuantificación por espectrometría de masa o electroforesis capilar ⁽¹²⁾. Los métodos utilizados en el laboratorio clínico deben verificarse con el método de referencia; actualmente se dispone de diferentes métodos para medir la concentración de HbA1C, entre ellos la Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el cumplimiento de los estándares establecidos por los organismos internacionales (NGSP, GLAD Working Group) con el fin de comprobar que los resultados obtenidos por este método son clínicamente confiables.

Materiales y Métodos

Durante el mes de diciembre de 2014 se evaluaron controles provistos por el fabricante utilizando el sistema Variant II Hemoglobin A1c de Bio-Rad (EE.UU.) que utiliza el principio de HPLC e intercambio catiónico, y se encuentra certificado por el NGSP. En este sistema, las muestras son automáticamente diluidas e inyectadas en la columna cromatográfica la cual se encuentra dentro de un horno termostatizado que garantiza la estandarización de la temperatura de corrida. Mediante un gradiente de elución programado, la fuerza iónica creciente permite que las distintas fracciones de la hemoglobina sean separadas en base a sus interacciones iónicas con el material de la columna. Posteriormente, las fracciones separadas son cuantificadas mediante un fotómetro de filtro a una longitud de onda de 415 nm. Finalmente, un algoritmo gaussiano calcula el área del pico correspondiente a HbA1C y la transforma en unidades NGSP (%-NGSP).
Los controles y calibradores se conservaron y procesaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se procesaron dos niveles de control; normal y alto (Lyphocheck Diabetes Control Levels 1 y 2, lote nº 33870, fecha de vencimiento 31/12/2015). Los valores asignados para los materiales de control se presentan en la Tabla I.

Tabla I. Valores target asignados y rangos de HbA1C (%-NGSP) de los controles utilizados.

Como controles externos se utilizaron los provistos por el Programa de Evaluación Externa de la Calidad (PEEC) de la Fundación Bioquímica Argentina. Los datos fueron colectados y analizados mediante el software Statgraphics 4.1. El desempeño analítico del método se evaluó en el marco de la aplicación del protocolo EP15-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), mediante el procesamiento por triplicado de cada control durante cinco días. La linealidad del método se evaluó mediante regresión lineal. Se calcularon el CV%, la veracidad o sesgo % y el ET% para un nivel de confianza del 95% según a la expresión (13):

ET%= Sesgo% + (1,65 x CV% total)

A partir de la fórmula anterior y considerando las metas recomendadas de ETa% de 6% (año 2013) y de CV% de 2,0%, se calculó el sesgo% aceptable, siendo su valor estimado de ±2,7%. Mediante el cálculo de la imprecisión del método y el coeficiente de variación biológica intra-individuo (CVi%) que, según Rohlfing et al (14) para HbA1C es de 1%, se calculó el valor de referencia para el cambio (VRC%) según la fórmula ⁽⁸⁾⁽⁹⁾:

VRC% = 2 ^1/2 x 1,96 x [(CV%)² + (CVi%)²]^1/2

Finalmente se calculó el CCS que fue capaz de detectar el método en el punto crítico de 7,0%-NGSP, para compararlo con la variación considerada clínicamente significativa, de 0,5%-NGSP.

Resultados

El estudio de la linealidad del método para cuantificar HbA1C mediante regresión lineal, arrojó un r2 de 0,999, permitiendo verificar una linealidad óptima. La ecuación de la recta obtenida fue la siguiente:

y=0,9736 x + 0,0664

En la Figura 1 se presenta el gráfico de la linealidad. En la Tabla II se presentan los resultados del desempeño analítico obtenidos en las muestras control evaluadas. Como se observa en la Tabla II se obtuvo un óptimo desempeño ya que en ambos niveles el CV% fue menor al 2%, el sesgo% fue menor al sesgo% aceptable esperado (2,7%), y el ET% fue menor al ETa del 6% convenido para el año 2013.

Figura 1. Evaluación de la linealidad

Tabla II. Resultados obtenidos en el análisis de los controles

DE: desvío estándar, CV: coeficiente de variación, ET: error total, VRC; valor de referencia para el cambio, CCS: cambio clínicamente significativo.

Discusión y Conclusiones

En el seguimiento y control de la glucemia, los médicos sustentan sus decisiones terapéuticas basados en la concentración de HbA1C y en los cambios que se observan entre mediciones consecutivas. De esta manera, el laboratorio debe garantizar un desempeño analítico conforme con las normativas internacionales establecidas, de forma que el cambio que se observa sea debido a una variación en el estado de salud del paciente. El documento del año 2009 de las "Primeras Jornadas Conjuntas de Consenso del Laboratorio en Diabetes" ⁽⁶⁾ recomendaba como técnica de elección para la cuantificación de HbA1C a los métodos inmunoturbidimétricos, al mismo tiempo que desaconsejaba el uso los métodos basados en cromatografía de intercambio iónico, debido a los problemas de estandarización, particularmente la temperatura. El sistema cromatográfico evaluado en este trabajo facilita un estricto control de la temperatura, ya que la columna se encuentra en un horno termostatizado; el resto de las variables que intervienen en un método cromatográfico se encuentran adecuadamente estandarizadas por el software del instrumento.
La metodología analítica para la cuantificación de HbA1C evaluada en este trabajo demostró un desempeño analítico óptimo, cumpliendo los requerimientos internacionales, lo que permitiría no sólo un monitoreo adecuado de la glucemia, sino también el diagnóstico de los pacientes diabéticos. Debe destacarse que los ET% hallados para ambos niveles de control ensayados fueron menores al 3%, permitiendo alcanzar la meta del ETa% del 6% sugerido en el año 2013 y que la capacidad de detección del CCS, fue menor al 0,25% para el valor crítico de 7,0%-NGSP, en ambos controles. Los resultados obtenidos fundamentan el hecho que el cambio en la concentración de HbA1C se debería a una variación de la condición clínica del paciente y no a la variabilidad analítica del método, reflejado por el VRC% como se expresó más arriba ⁽⁸⁾⁽⁹⁾. El método cromatográfico evaluado en este trabajo constituye una alternativa a otros métodos que se encuentran disponibles en el mercado y que no logran alcanzar las metas analíticas establecidas ⁽¹⁵⁾.
Los resultados reportados por Unger et al ⁽¹⁵⁾, quienes evaluaron un método cromatográfico de intercambio catiónico manual, difieren de los encontrados en el presente trabajo al presentar valores de sesgo% y ET% más elevados, por lo que no cumplieron con el desempeño analítico considerado aceptable. Finalmente, los autores consideran que este trabajo puede ser un aporte a los laboratorios con el objetivo de garantizar la emisión de resultados de HbA1C de excelente calidad, en los cuales los médicos puedan basarse para la toma de decisiones de impacto clínico.

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Recibido: 19 de febrero de 2015
Aceptado: 6 de julio de 2015