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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.49 no.3 La Plata Sept. 2015

 

BIOLOGÍA MOLECULAR

Polimorfismo 1494del6 del gen de la timidilato sintasa en población de la región central de Venezuela

Thymidylate synthase gen polymorphism 1494del6 in a population from the central region of Venezuela

Polimorfismo 1494del6 do gene timidilato sintetase na população da região central da Venezuela

 

Cecilia Andreina Villegas Mendoza1a, Carlos José Gregorio Flores-Angulo2a, Yuselin Karina Mora Pineda1a, José Antonio Martínez3b, Teresa del Carmen Oropeza Araujo4b, Nancy Moreno5b

1 Licenciada en Bioanálisis.
2 Médico Cirujano.
3 MSc.
4 Especialista en Salud Pública.
5 Docteur.
a Maestría en Ciencias Biomédicas Universidad de Carabobo, Sede Aragua, Maracay, estado Aragua, Venezuela.
b Instituto de Investigaciones Biomédicas "Dr. Francisco J. Triana Alonso". Universidad de Carabobo, Sede Aragua (BIOMED-UC), Venezuela

CORRESPONDENCIA Dra. NANCY MORENO Sección de Polimorfismos Genómicos del Instituto de Investigaciones Biomédicas "Dr. Francisco J. Triana Alonso" Universidad de Carabobo Sede Aragua (BIOMED-UC). Final de la calle Cecilio Acosta, Las Delicias Maracay Estado Aragua, Venezuela Tel: 58-243-2420577 / 58-243-2425822 E-mail: nanmorja@hotmail.com


Resumen

La enzima Timidilato Sintasa (TS) codificada por el gen TYMS es inhibida por agentes quimioterapéuticos como 5-Fluorouracilo (5-FU) y Metotrexato (MTX). Varios estudios han postulado que existe una relación inversa entre los niveles de enzima y los beneficios terapéuticos de 5-FU y MTX. El gen TYMS presenta polimorfismos asociados con la expresión de TS; uno de ellos consiste en una inserción o deleción de 6 pb en la posición 1494 en 3’UTR (1494del6); la deleción se vincula con menor expresión enzimática. El objetivo del trabajo fue determinar el polimorfismo 1494del6 en 260 individuos sanos no consanguíneos de la región central de Venezuela. Luego de obtener el consentimiento informado, se tomó una muestra sanguínea para aislar ADN y amplificar mediante PCR una secuencia de 142/148 pb del gen TYMS. El producto fue digerido con Dra I y se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida 8%, determinándose los genotipos y se compararon con los obtenidos en otras poblaciones. Se encontraron tres genotipos: -6pb/-6pb (15,8%), +6pb/-6pb (45,4%) y +6pb/+6pb (38,8%). Este último ha sido asociado con respuesta deficiente al tratamiento con 5-FU y MTX. Esta investigación es un paso inicial en la generación de datos de importancia farmacogenética en relación con gen TYMS en población venezolana.

Palabras clave: Timidilato sintasa; Polimorfismo TYMS en 3’ UTR; 1494del6; Farmacogenética; Venezuela.

Summary

Thymidylate synthase enzyme (TS) codified by the TYMS gene is inhibited by chemotherapeutic agents such as 5-Fluoruacil (5-FU) and Methotrexate (MTX). Several studies have postulated the existence of an inverse relationship between enzyme levels and 5-FU and MTX therapeutic benefits. In the TYMS gene, there are polymorphisms associated with the TS expression, one of them consisting of an insertion (+6pb) or deletion (-6pb) of 6 bp at position 1494 in the 3’UTR region (1494del6); the deletion is associated with low levels of enzyme. The aim of this work was to determine the 1494del6 polymorphism of the TYMS gene in a sample of 260 no-consanguineous healthy individuals from the Central region of Venezuela. Informed consent was obtained and a blood sample was taken to isolate DNA and to amplify a sequence of 142/148 pb by PCR. The PCR product was digested with Dra I enzyme, the restriction patterns were checked by electrophoresis on 8% polyacrylamide gel, and genotypes were determined and compared with those obtained in other populations. Three genotypes were found, whose frequencies were: -6pb/-6pb (15,8%), +6pb/-6pb (45,4%) and +6pb/+6pb (38,8%), the latter being associated with deficient response to treatment with 5-FU and MTX. This research is an initial step in generating data of pharmacogenetics importance with reference to TYMS gene in a Venezuelan population.

Keywords: Thymidylate synthase; TYMS Polymorphism 3’ UTR; 1494del6; Pharmacogenetics; Venezuela.

Resumo

A enzima Timidilato Sintetase (TS) codificada pelo gene TYMS é inibida por agentes quimioterapêuticos como 5-fluorouracil (5-FU) e Metotrexato (MTX). Diversos estudos postularam que existe uma relação inversa entre os níveis da enzima e os benefícios terapêuticos do 5-FU e MTX. O gene TYMS apresenta polimorfismos associados com a expressão de TS, um deles consiste numa inserção ou deleção de 6 pb na posição 1494 em 3’UTR (1494del6); a deleção é vinculada a menor expressão enzimática. O objetivo do trabalho foi determinar o polimorfismo 1494del6, em 260 indivíduos saudáveis não consanguíneos da região central da Venezuela. Depois de obter o consentimento informado, foi tomada uma amostra sanguínea para isolar o DNA e amplificar mediante PCR uma sequencia de 142/148 pb do gene TYMS. O produto foi digerido com Dra I, foi realizada eletroforese em géis de poliacrilamida 8%, determinando-se os genótipos e comparando com os obtidos em outras populações. Os três genótipos achados foram: -6pb/-6pb (15,8%) +6pb/-6pb (45,4%) e +6pb/+6pb (38,8%), o ultimo foi associado a uma resposta deficiente ao tratamento com 5-FU y MTX. Este estudo é um passo inicial na geração de dados com importância farmacogenética, em relação ao gene TYMS na população venezuelana.

Palavras-chave: Timidilato sintetase; Polimorfismo TYMS em 3’ UTR; 1494del6; Farmacogenética; Venezuela.


 

Introducción

El 5-Fluorouracilo (5-FU) y el Metotrexato (MTX) son agentes quimioterapéuticos comúnmente utilizados en el tratamiento de diversos tipos de cáncer, cuyo mecanismo de acción está basado en la inhibición de la Timidilato Sintasa (TS) (1), enzima fundamental en el metabolismo del uracilo, la reparación del ADN y el balance de los cuatro nucleótidos requeridos para la síntesis del mismo. La función principal de TS es catalizar la conversión de 5-desoxiuridina monofosfato (dUMP) hasta 5-desoxitimidina monofosfato (dTMP), a través de un proceso que requiere de la participación de folato y cuyo producto es un precursor esencial para la síntesis de ADN durante la replicación celular (2)(3). La efectividad de estos fármacos depende de varios factores. Sin embargo, se ha determinado que la tasa de expresión de TS juega un rol importante en el tipo de respuesta farmacológica de cada individuo. En este sentido, varias publicaciones han reportado que existe una relación inversa entre el nivel intracelular de enzima y el beneficio terapéutico en pacientes tratados con fármacos inhibidores de TS (3-6).
La expresión de TS está modulada por varios polimorfismos en el gen TYMS que codifica esta enzima; uno de ellos: rs34743033 se encuentra en la región no traducible en el extremo 5’ (5’UTR), se conoce con el nombre de TSER (del inglés: Thymidilate Syntase Enhancer Region) y consiste en secuencias de 28 pb repetidas en tándem que actúan como un elemento cis activador (7-9). Las repeticiones más frecuentes son las formas alélicas de dos y tres repeticiones identificadas como 2R y 3R, respectivamente. En 3R se ha descrito, a su vez, un polimorfismo de un sólo nucleótido (G>C) en la posición 12 de la segunda repetición: rs2853542 (10)(11) lo que da lugar a tres formas alélicas: 2R, 3RC y 3RG. Otro de los polimorfismos identificados en este gen es rs16430, el cual consiste en la variación de una secuencia de 6 pb (TTAAAG) en la posición 1494 de la región no traducible en el extremo 3’ (3’UTR), recibe el nombre de 1494del6 (12) y cuya presencia o ausencia se identifica como inserción (+6pb o ins) y deleción (-6pb o del). Estas variantes alélicas están estrechamente relacionadas con el nivel de expresión de TS. Por ejemplo, se ha determinado que el alelo -6pb en 3’UTR está vinculado con inestabilidad del ARNm, niveles bajos del mismo y menor expresión enzimática (13). Dicha correlación fue demostrada por Lenz et al., (14) quien reportó que pacientes homocigotos para el alelo -6pb tienen una expresión de ARNm de la enzima TS 4,2 veces menor cuando se compara con aquellos que poseen la inserción. Luego Pullmann et al. (15) expusieron que la causa de la inestabilidad del ARNm se debía a que la ausencia de las 6 pb aumenta la afinidad entre éste y el factor regulador AUF1, una ribonucleoproteína que actúa como desestabilizador del ARNm. La distribución de los genotipos relacionados con este polimorfismo varía de acuerdo a la población; así, en una población china el genotipo +6pb/+6pb se encontró con frecuencia de 9,8% (16), mientras que en muestras poblacionales de Portugal y España se reportaron frecuencias de 37,3% (17) y 44,5% (18), respectivamente. Hasta el momento no existen datos publicados sobre la distribución de estos genotipos en población venezolana; no obstante, Hernández et al. (19) investigaron mediante métodos inmunohistoquímicos la expresión de TS en muestras de biopsias provenientes de 34 pacientes con cáncer de colon, quienes recibieron tratamiento con 5- FU y leucovorina; los pacientes en cuyos tumores se detectó una expresión baja de TS, mostraron una evolución más favorable y tuvieron una mayor probabilidad de sobrevida.
La importancia que tiene el polimorfismo TYMS en 3’UTR, en la predicción de la terapia de pacientes con cáncer tratados con 5-FU(7) (9) (20) y MTX (21) y como marcador de pronóstico en algunos tipos de cáncer (9) (14)(19) resalta la necesidad de generar conocimiento sobre la distribución de los genotipos de este polimorfismo en muestras de población venezolana, debido a que el cáncer constituye una de las causas más frecuentes de morbilidad y mortalidad en Venezuela (22). En este sentido, el objetivo del trabajo fue determinar el polimorfismo 1494del6 en 3’UTR del gen TYMS en una muestra de residentes de la Región Central de Venezuela y comparar estadísticamente los datos obtenidos con lo reportado en poblaciones de otros países como un paso previo al análisis de estos polimorfismos en pacientes con cáncer.

Materiales y Métodos

MUESTRA
La muestra estuvo integrada por 260 individuos aparentemente sanos, de ambos géneros, sin relación de parentesco por consanguinidad, mayores de 18 años, residentes de la región Central de Venezuela, a quienes se les tomó una muestra de 2 mL de sangre periférica en la zona del antebrazo. El proyecto para esta investigación fue revisado y aprobado por el Comité de Bioética del Instituto de Investigaciones Biomédicas "Dr. Francisco J. Triana Alonso" y los sujetos participantes firmaron el respectivo consentimiento informado para la realización del estudio.

AISLAMIENTO DE ADN Y GENOTIPIFICACIÓN
El ADN fue aislado mediante una modificación del método de Miller et al. (23). Su concentración y pureza en relación al contenido de proteínas fueron determinadas a través de mediciones espectrofotométricas a 260 y 280 nm; la integridad fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa teñido con SYBR Green y visualizado en un equipo de fotodocumentación marca BIORAD ® modelo Gel Doc™ XR, Hercules, CA, EE.UU. Para analizar el polimorfismo 1494del6 se amplificó una secuencia de 142/148 pb de la región 3’UTR del gen TYMS, previa optimización del ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) tomando como base lo reportado por Ulrich et al. (12). La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 μL que contenía: MgCl2 1 mM, una mezcla de los cuatro dNTPs 180 μM, oligonucleótidos cebadores 0,25 μM, enzima ADN polimerasa Taq (Go Taq Promega ) 0,70 U y 15 ng de ADN. El programa de amplificación constó de 30 ciclos con una pre-desnaturalización a 96 °C por 3 min, las etapas fueron: desnaturalización a 96 °C durante 30 s, la hibridación de los cebadores se llevó a cabo a 52 °C por 30 s, y la extensión ocurrió a 72 °C durante 30 s con una extensión final por 3 min. Las muestras fueron amplificadas en un termociclador marca BIO-RAD®, modelo C100™, Hércules, CA, EE.UU. Para determinar los distintos genotipos, los productos PCR fueron digeridos con la enzima Dra I (Promega ®) a 37 °C durante dos horas, y al finalizar el período de incubación se efectuó electroforesis en gel de poliacrilamida 8% revelado con sales de plata. Se tomó una fotografía en un equipo de fotodocumentación marca BIO-RAD® modelo Gel Doc™ XR, Hércules, CA, EE.UU. Posteriormente se analizaron los patrones de restricción y se asignaron los genotipos. Para cada genotipo se generaron fragmentos de restricción de tamaño diferente, así, para el genotipo (+6pb/+6pb) se obtuvieron dos fragmentos: 83 pb + 65 pb; en el genotipo (-6pb/-6pb) se obtuvo un fragmento de 142 pb y en los heterocigotos (+6pb/-6pb) tres fragmentos: 83 pb, 65 pb y 142 pb.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Luego de identificar los genotipos se determinaron las frecuencias genotípicas y alélicas. La distribución de genotipos fue comparada mediante la prueba de chi-cuadrado con las obtenidas en otros países en grupos de individuos referidos como sanos; las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas para valores de p<0,05. Se utilizó el programa H-W equilibrium calculator para investigar el equilibrio de Hardy-Weinberg (24).

Resultados

En la Figura 1 se muestra un ejemplo de los patrones de restricción obtenidos en 11 individuos. En el resto de la población analizada se obtuvieron perfiles similares.


Figura 1
. Electroforesis en gel de poliacrilamida 8%, para observar resultado de digestión de productos PCR con la enzima Dra I. Línea 1: Control Negativo de digestión, Líneas 2-12: Productos PCR 142/148 pb digeridos con Dra I. M: Marcador de tamaño molecular Phi X174 Hinf I. En las líneas 2,5,7 y 8 se observan dos bandas: 83 y 65 pb, lo que indica individuos homocigotos para la inserción. En las líneas 3,6,9-11 se observa una banda de 142 pb correspondiente a individuos homocigotos para la deleción, y en las líneas 4 y 12 se observa un patrón de tres bandas: 142, 83 y 65 pb, indicativas de individuos heterocigotos.

Se encontraron los tres genotipos posibles: 101 individuos (38,8%) resultaron homocigotos para la inserción (+6pb+6pb), 41 sujetos (15,8%) fueron homocigotos para la deleción (-6pb/-6pb) y 118 (45,4%) fueron heterocigotos (+6pb/-6pb) (Tabla I). El alelo +6pb, el cual se asocia con una mayor expresión de la enzima, se encontró en un 61,5%, mientras que -6pb se presentó en el 38,5% de los individuos analizados (Tabla I). Esta distribución está en equilibrio de Hardy-Weinberg (p=0,8953).

Tabla I. Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo 1494del6 en 3’UTR del gen TYMS.

En la Tabla II se muestra la comparación estadística de la distribución de las frecuencias de los genotipos de la población analizada en este estudio con muestras de población de individuos sanos de otros países.

Tabla II. Comparación de la distribución de los genotipos con muestras de otras poblaciones.

Discusión y Conclusiones

Cuando se compara la distribución de los genotipos obtenida en este estudio con las publicadas para muestras de población de otros países (16-18)(25-27), se observan diferencias significativas con muestras de las poblaciones de: China (p<0,0001) y México 1 (p=0,0385) mientras que no existen tales diferencias con las muestras poblacionales de España (p=0,5666), Italia (p=0,4304), Portugal (p=0,2452) y México 2 (p=0,1825) (Tabla II).
Este resultado guarda estrecha relación con el proceso de mestizaje que ha operado con el transcurrir del tiempo en la población venezolana, la cual inicialmente fue producto de una mezcla de pobladores originarios, colonos españoles y esclavos africanos, con una contribución posterior de inmigrantes principalmente de Italia y Portugal, razón que explica la semejanza encontrada entre los resultados del presente estudio y los reportados para estas poblaciones. Esta observación concuerda con los datos sobre la composición genética que adoptó Venezuela a partir de la época colonial, en la cual hubo una sustitución de los genes nativos por genes de origen europeo en su mayoría y africanos en
menor proporción, quedando muy disminuido el componente amerindio (28), por lo cual resulta interesante estudiar la distribución de estos polimorfismos tanto en poblaciones indígenas venezolanas, como en muestras diversas de población de otras localidades de Venezuela, en virtud que el grado de mestizaje es variable de acuerdo con las regiones (29).
La comparación de los datos obtenidos en el presente trabajo con dos muestras distintas de población mexicana revela que en el caso de la población identificada como México 1 existen diferencias significativas (p=0,0385) (26). Sin embargo, cuando se compara con la muestra de México 2 no se observan tales diferencias (p=0,1825) (27). Una posible causa de lo observado es el diferente grado de mestizaje que pueda existir entre las dos muestras; este es un ejemplo que resalta la importancia que tiene realizar este tipo de estudio en muestras poblacionales de diferentes regiones en países con población mestiza. La distribución genotípica del polimorfismo 1494del6 en 3’UTR del gen TYMS mostró que 38,8% de la población analizada en este estudio presenta el genotipo +6pb/+6pb (Tabla I), el cual, de acuerdo a lo reportado por Lu et al. (30), está asociado a una tasa de respuesta significativamente menor al tratamiento con 5-FU, en pacientes con cáncer de estómago; esta información es coincidente con la reportada por el grupo de Huang (31) al evaluar la sobrevida global en pacientes con cáncer de estómago tratados con la misma fluoropirimidina. Por otra parte, la influencia del alelo -6pb sobre la disminución del riesgo de muerte también ha sido evaluado en sujetos con cáncer colorrectal tratados con 5-FU, siendo mucho más evidente este efecto en sujetos homocigotos (-6pb/-6pb) (32)(33).
Asímismo, se ha demostrado utilizando métodos inmunohistoquímicos, un comportamiento similar en cuanto a la sobrevida total de sujetos con cáncer, lo cual ha sido observado en pacientes venezolanos con cáncer colorrectal. En relación a este aspecto Hernández et al. (19), reportaron que los pacientes en cuyos tumores había una expresión alta de TS tuvieron una sobrevida significativamente menor, comparados con aquellos pacientes que mostraron baja expresión de la enzima en sus tumores (p=0,004). Estos ejemplos pueden explicar en parte, que sólo entre el 20% y 30% de pacientes con cáncer colorrectal sean quienes respondan satisfactoriamente al tratamiento quimioterapéutico (34).
En relación al genotipo +6pb/-6pb éste mostró la frecuencia más alta (45,4%). En este caso es importante considerar que el genotipo heterocigoto es susceptible de sufrir modificación en las células del tumor, debido a que el gen TYMS se localiza en la región telomérica del brazo corto del cromosoma 18, zona que en células tumorales sufre frecuentes deleciones que ocasionan la pérdida de heterocigosidad en este gen (9), de tal forma que en aquellos pacientes cuyos tumores tengan el genotipo +6pb/-6pb, el mismo puede transformarse bien sea en +6pb/pérdida o en -6pb/pérdida. Esta situación podría incrementar el número de individuos con expresión baja de TS en sus tumores, como fue descrito en una investigación de Dotor et al(32), donde se observó pérdida de heterocigosidad en el 36,2% (17/47) de los individuos cuyos tumores exhibían el genotipo +6pb/-6pb. De esos 17 individuos, el 41,2% (7/17) perdieron la forma alélica +6pb en sus tumores y el genotipo quedó modificado a "-6pb/pérdida" y estos sujetos pasaron a formar parte del grupo con genotipo de baja expresión lo cual significó un beneficio, puesto que la presencia del alelo -6pb está vinculado a riesgo reducido de muerte (p=0,011) en individuos con este tipo de cáncer tratados con 5-FU (32). La información generada en esta investigación se refiere a población aparentemente sana; no obstante, los datos representan una base para iniciar investigaciones en el área de farmacogenética en pacientes con algunos tipos de cáncer, sobre todo aquellos cuyos tumores afectan el tracto gastrointestinal, mama, pulmón y neoplasias hematológicas, como la leucemia linfoblástica aguda. Por otra parte, estos resultados también constituyen un punto de partida para investigar asociaciones posibles entre estos polimorfismos y el riesgo para desarrollar algunos tipos de cáncer, situación que ha sido propuesta por otros investigadores principalmente para cáncer gástrico (35), colorrectal (16) y de mama (36) (37).
En conclusión, este trabajo aporta conocimiento sobre la distribución de genotipos en cuanto al polimorfismo 1494del6 en la región 3’UTR del gen TYMS en población de la región central de Venezuela; el genotipo +6pb/+6pb, el cual ha sido asociado a una repuesta deficiente al tratamiento con 5-FU y MTX, se encuentra en un porcentaje relativamente elevado de sujetos (38,8%). Estos conocimientos tienen importancia para estudios de farmacogenética debido a que el polimorfismo 1494del6 tiene valor como factor predictivo de la terapia de pacientes con cáncer tratados con 5-FU y MTX (7)(9)(14)(20)(21) y como marcador de pronóstico en algunos tipos de cáncer (9)(14)(19)(32).

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen a los voluntarios que participaron en este estudio. A los Dres. Flor Herrera, Heriberto Correia y Francisco Rodríguez del BIOMED-UC por su colaboración en cuanto a la utilización de espacios, equipos y algunos reactivos. A las integrantes de la Oficina de Administración del BIOMED-UC por el manejo administrativo del proyecto. A José Antonio Ares Noya por la traducción del resumen al idioma portugués y al Prof. Jesús Ernesto Lisboa M por la revisión del resumen en inglés.

CONFLICTO DE INTERÉS

Los autores declaran que no existe conflicto de interés entre ellos ni entre las entidades a las cuales ellos están vinculados.

FINANCIACIÓN

Este trabajo estuvo financiado por el Fondo Nacional de Ciencia Tecnología e Innovación (FONACIT) a través de los proyectos: 2012001248 y 2012002328 y algunos equipos por el Proyecto Misión Ciencia Nº 2008000911-1

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Recibido: 4 de abril de 2015
Aceptado: 6 de agosto de 2015

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