INMUNOLOGÍA

Alteración de la agregación eritrocitaria por larvas recién nacidas de Trichinella spiralis*

Alteration of the erythrocyte aggregation by newborn larvae of Trichinella spiralis

Alteração do agregação eritrocitária por larvas recém-nascidas da Trichinella spiralis

 

Patricia Ponce de León¹, Armando Fernandez², Liliana Racca³, María Delia Vasconi¹

¹ Doctora en Ciencias Biomédicas.
² Tesinista de la Licenciatura en Biotecnología.
³ Magister en Estadística Aplicada.
* Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.

CORRESPONDENCIA DRA. PATRICIA PONCE DE LEON Area Parasitologia Facultad de Ciencias Bioquimicas y Farmaceuticas Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Suipacha 531- 2000 ROSARIO, Argentina E-mail: tefu1958@hotmail.com

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Resumen

El objetivo del trabajo fue estudiar las alteraciones en la agregación eritrocitaria producidas por recién nacidas (LRN) de T. spiralis. Se usaron concentrados de larvas LRN incubados en partes iguales con glóbulos rojos (GR) Grupo O (GR Tratados) durante 2 horas, con y sin agitación controlada, tomando muestras al tiempo inicial, 60 y 120 minutos. Los Controles fueron incubados con igual volumen de solución salina. Se aplicó Análisis Digital de Imágenes para estudiar la distribución de los agregados eritrocitarios y calcular el valor de coeficiente de células aisladas (CCA) y la Técnica de Titulación de la Agregación para determinar el Título y el CexpST. Se utilizó ANOVA bifactorial para analizar el efecto de la agitación y del tiempo de incubación en los valores de CCA. Los resultados mostraron que el aumento del tiempo de tratamiento produjo la disminución de las células aisladas y los pequeños rouleaux, y el aumento de los agregados formados por 5 o más glóbulos, lo cual incrementó significativamente el valor de CCA. El análisis estadístico determinó que la agregación de los GR Tratados a los 60 minutos fue mayor que al tiempo 0, y a los 120 minutos mayor que a los otros dos tiempos. La Titulación de la agregación mostró la disminución del CexpST y del Título de los GR Tratados. Las metodologías empleadas no mostraron diferencias significativas en tratamientos con y sin agitación. Se concluye que la disminución de carga eritrocitaria producida por LRN podría provocar alteraciones hemorreológicas en el hospedador.

Palabras clave: Larvas recién nacidas; T. spiralis; Agregación eritrocitaria.

Summary

The aim of this paper was to study the alterations in the erythrocyte aggregation produced by newborn larvae (NL) of T. spiralis. Work was performed with NL concentrates, which were incubated with an equal volume of O Group RBC (Treated RBC) for 2 hours, with and without controlled agitation, taking samples at the initial time, at 60 and 120 minutes. RBC Controls were incubated with equal volume of saline solution. Digital Image Analysis was applied to study the distribution of erythrocyte aggregates and to calculate ICC values, and the Aggregation Titration Technique was used to determine the Title and TSexpC. Two-factor ANOVA was used to analyze the effect of agitation and incubation time on the ICC values. The results showed that at higher treatment time, there was a decrease of isolated cells and small rouleaux and an increase of the aggregates formed by 5 or more cells, with a significant increase of ICC values. Statistical analysis determined that Treated RBC aggregation at 60 minutes was higher than at initial time and that at 120 minutes it was higher than the other two times. Aggregation Titration showed a decrease in the Treated RBC Title and TSexpC. The methodologies employed showed no significant differences in treatments with and without agitation. It is concluded that the decrease in erythrocyte charge produced by NL could cause hemorrheologic alterations in the host.

Keywords: Newborn larvae; T. spiralis; Erythrocyte aggregation.

Resumo

O objetivo foi estudar as alterações na agregação de eritrócitos produzidas por larvas recém-nascidas (LRN) da T. spiralis. O trabalho foi feito com concentrados de LRN incubados em partes iguais com glóbulos vermelhos (GV) Grupo O (GV Tratados), durante 2 horas, com e sem agitação controlada, levando as amostras ao tempo inicial, 60 e 120 minutos. Os controles foram incubados com igual volume de solução salina. Análise Digital de Imagens foi aplicada para estudar a distribuição dos agregados de eritrócitos e calcular o valor do Quoficiente de Células Isoladas (QCI) e a Técnica de Titulação da Agregação para determinar o Título e CexpST. Para analisar o efeito da agitação e do tempo de incubação sobre os valores do QCI foi utilizada ANOVA bifatorial. Os resultados mostraram que o aumento do tempo de tratamento produziu a diminuição das células isoladas e os pequenos rouleaux, e o aumento dos agregados formados por 5 ou mais glóbulos, aumentando o valor de QCI significativamente. A análise estatística determinou que a agregação de GV Tratados aos 60 minutos foi maior que no tempo inicial e, aos 120 minutos era maior que durante os outros dois tempos. A Titulação da Agregação mostrou a diminuição do CexpST e do Título de GV Tratados. As metodologias usadas não mostraram diferenças significantes em tratamentos com e sem agitação. Conclui-se que a diminuição de carga de eritrócitos produzida por LRN poderia resultar em alterações hemorreológicas no hospedeiro.

Palavras-chave: Larvas recém-nascidas; T. spiralis; Agregação de eritrócitos.

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Introducción

La trichinellosis es una parasitosis zoonotica causada por Trichinella spp. de localizacion intestinal inicial y luego tisular, siendo spiralis la especie prevalente a nivel mundial. Esta parasitosis se adquiere a traves de la ingesta de carne cruda o mal cocida con larvas musculares de este nematodo. Cinco dias posteriores a la infeccion con las larvas musculares, los parasitos adultos, hembra y macho, invaden las celulas epiteliales donde copulan. Cada hembra produce aproximadamente 1500 larvas vivas en un periodo de 2-5 semanas, aunque la cantidad es variable segun la especie de Trichinella y el hospedador. Estas larvas recien nacidas (LRN) pasan al torrente sanguineo y al sistema linfatico, se diseminan en el cuerpo y pueden penetrar en cualquier celula, aunque solo pueden sobrevivir en las musculo esqueleticas. Actualmente se han identificado mas de 100 especies de mamiferos, aves y reptiles como hospedadores definitivos de este parasito, la mayor parte son silvestres; sin embargo, algunos animales tales como cerdos, caballos, perros, gatos y roedores estan involucrados en el ciclo domestico de la enfermedad, por lo que son de particular importancia en la trichinellosis humana ⁽¹⁾.
Las celulas mas abundantes en la sangre son los eritrocitos, cuya funcion primordial es el transporte de oxigeno y dioxido de carbono, pero tambien, tanto por sus propiedades mecanicas como por su abundancia, son los principales determinantes del comportamiento reologico de la sangre ⁽²⁾. La tendencia de los eritrocitos a asociarse cara con cara, formando las denominadas “pilas de monedas”, fenomeno que tambien se denomina agregacion, depende del balance entre los factores que favorecen y los que dificultan su aparicion. Entre los inhibidores de la agregacion debe mencionarse en primer lugar, la repulsion electrostatica entre los globulos, que es causada por la carga negativa distribuida sobre la membrana del eritrocito ⁽²⁾. El acido sialico es el principal responsable de la carga eritrocitaria y su disminucion tiene consecuencias hemorreologicas y hemodinamicas que son fundamentales en el desarrollo de distintas patologias humanas ⁽³⁾. La disminucion de acido sialico en la membrana favorece la agregacion eritrocitaria, la formacion de rouleaux, la disminucion del flujo sanguineo y el aumento de la viscosidad de la sangre, lo que se traduce en una mayor interaccion entre los eritrocitos y el endotelio vascular ^(2-5). La agregacion de los eritrocitos juega un papel importante en la microcirculacion y su estudio es particularmente relevante en diabetes, ateroesclerosis, hipertension arterial y otras vasculopatias ^(6-10). En experiencias previas, aplicando el metodo de Polibrene, se ha comunicado que el contacto de los eritrocitos con larvas de T. spiralis produce la disminucion de acido sialico globular, indicando que el parasito puede captarlo y alterar la agregacion eritrocitaria ⁽¹¹⁾.
Si se considera que las LRN establecen un intimo contacto con los globulos rojos del hospedador durante su migracion por el torrente sanguineo, y podrian modificar el comportamiento reologico de la sangre, el objetivo fue estudiar las posibles alteraciones en la agregacion eritrocitaria producidas por este estadio de T. spiralis.

Materiales y Métodos

LARVAS RECIÉN NACIDAS DE T. SPIRALIS (LRN)
Se trabajo con ratones CBi infectados con T. spiralis, provistos por el Bioterio del Instituto de Genetica Experimental de la Facultad de Cs Medicas (UNR). Entre los 6 y 13 dias post-infeccion, se obtuvieron hembras gravidas del intestino delgado de los ratones por cirugia, las cuales fueron incubadas en 100 μL de medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino y 250 μg/ mL de gentamicina durante 18 horas a 37 oC en atmosfera de 5% de CO₂. Posteriormente las LRN fueron separadas de las hembras adultas y recolectadas en solucion fisiologica con formol. A las 24 horas se prepararon concentrados de LRN no viables, para lo cual se lavaron las larvas 3 veces por centrifugacion en solucion salina y se realizaron los recuentos, por duplicado, en microscopio optico (3000±500 larvas/ mL) ⁽¹²⁾. Los protocolos para la obtencion de LRN, asi como tambien de otros estadios parasitarios de T. spiralis, son utilizados en lineas de investigacion de las Facultades de Cs. Medicas y de Cs. Bioquimicas y Farmaceuticas (UNR), las cuales son aprobadas por los Comites de Bioetica de ambas instituciones.

GLÓBULOS ROJOS (GR) EN MEDIO SALINO
Se trabajo con suspensiones de eritrocitos frescos provenientes de dadores sanos Grupo O, previa separacion del plasma autologo.

TRATAMIENTO DE LOS ERITROCITOS
El tratamiento consistio en incubar 100 μL del sedimento globular con igual volumen del concentrado de LRN (GR Tratados). Los eritrocitos Controles fueron incubados de la misma manera con solucion fisiologica. Para evaluar el efecto de las LRN sobre la agregacion eritrocitaria se incubaron los GR Tratados y Controles desde un tiempo inicial (Tiempo 0) durante 2 horas, a 37 °C con y sin agitacion controlada. Se tomaron muestras de las suspensiones eritrocitarias al tiempo inicial (t=0), a los 60 y 120 minutos. Finalizado cada uno de los tiempos, los eritrocitos fueron lavados en solucion salina. Se realizaron 5 experiencias con globulos rojos Tratados y Controles, incubados simultaneamente con y sin agitacion controlada.

DISTRIBUCIÓN DE LOS AGREGADOS ERITROCITARIOS POR ANÁLISIS DIGITAL DE IMÁGENES ^(13-16)
Los GR Tratados y Controles fueron suspendidos en plasma autologo al 0,13% y mantenidos en reposo en un portaobjeto concavo durante 5 minutos para permitir la agregacion. Las imagenes de las diferentes poblaciones de agregados para cada muestra, fueron obtenidas por triplicado con una camara digital Mikova DCM500 (USB2.0) incorporada a un microscopio optico (objetivo: 40X). Se determino la distribucion del tamano de los agregados eritrocitarios y se calculo el valor del Coeficiente de celulas aisladas (CCA) definido como la diferencia entre el numero de celulas individuales iniciales (Control) y finales (Tratados) en relacion al numero de celulas aisladas observado antes del tratamiento. Cuando el valor de CCA es igual a 0 indica que no hubo variacion en el numero de celulas aisladas por accion del tratamiento, y cuando es igual a 1 senala la ausencia de celulas aisladas (agregacion total).

MÉTODO DE TITULACIÓN DE LA AGREGACIÓN POR POLIBRENE ⁽¹⁷⁾
El metodo se aplico simultaneamente en los eritrocitos no tratados (Control) y en los mismos eritrocitos incubados con los concentrados larvales, durante 120 minutos con y sin agitacion controlada, para lo cual se prepararon suspensiones globulares al 20%, a partir de los sedimentos. Primeramente se diluyo el Polibrene (diluciones seriadas progresivas en solucion salina: Puro, 1/2; .;……1/128) y a continuacion, se mezclo 10 mL de la suspension globular al 20% con 10 μL de cada una de las diluciones del Polibrene. Se mezclo con varilla de vidrio y se homogeinizo por movimientos circulares de la placa de vidrio durante 1 minuto. En esta etapa se produjo la agregacion entre los eritrocitos con carga negativa y el polication Polibrene. Se evaluo la carga anionica de los GR Tratados y Controles, por Titulacion de la Agregacion, considerando el Titulo, a la ultima dilucion del polication que presento agregacion. Se considero significativa una diferencia de Titulo ≥ a 2 diluciones entre los GR Control y GR Tratados. A los fines de comparar la agregacion de los globulos incubados con las LRN, con la del respectivo Control, se la semicuantifico con cruces (4+, 3+; 2+: 1+; +/-; -) y se asigno un Score a cada una segun Goudemand y Marsalet ⁽¹⁸⁾, de acuerdo a la siguiente escala:

Este coeficientes es igual a 1 cuando no hay diferencia entre el Score Total del Control y de los globulos Tratados (no hay modificacion de acido sialico por accion del parasito) y es igual a 0 cuando los eritrocitos Tratados no agregan con el Polibrene puro ni con ninguna de sus diluciones (el tratamiento con las LRN ocasiona la perdida total o casi completa del acido sialico del eritrocito, o sea que la captacion del mismo es maxima).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se aplico un ANOVA bifactorial a la variable transformada (logaritmo CCA) para estudiar la posible variacion en el numero de celulas aisladas por accion del parasito, medida por medio del coeficiente de celulas aisladas (CCA), por efecto de la agitacion durante el tratamiento (con y sin) y el tiempo de incubacion (0, 60 y 120 minutos) ⁽¹⁹⁾.

Resultados

Los resultados mostraron que al tiempo inicial no hubo variacion significativa en el porcentaje de celulas aisladas del Control y de los eritrocitos incubados con las LRN, pero al aumentar el tiempo de tratamiento, las celulas aisladas de las suspensiones globulares incubadas con el parasito disminuyeron en relacion al Control, lo que se tradujo en el aumento significativo de los valores de CCA (p<0.0001). El analisis estadistico determino que la agregacion de los GR Tratados a los 60 minutos fue mayor que al tiempo 0, asi como tambien que a los 120 minutos fue mayor que a los otros dos tiempos, sin que se observasen, en ninguno de los casos, diferencias significativas en tratamientos con y sin agitacion controlada (Fig. 1). La Tabla I muestra los valores de CCA obtenidos en cada tiempo de incubacion con y sin agitacion controlada.

Figura 1. Intervalos de confianza del 95% del promedio según Tukey.

Tabla I. Valores de CCA para cada tiempo de tratamiento.

El estudio de la distribucion de tamano de los agregados eritrocitarios formados permitio observar que a mayor tiempo de incubacion de los eritrocitos con las LRN, disminuyo el porcentaje de celulas aisladas y el de rouleaux formados por 2 o 3 celulas, a la vez que aumento la formacion de agregados globulares compuestos por 5 o mas celulas, formando en algunos casos AMAS (redes eritrocitarias de gran tamano). Las Figuras 2, 3 y 4) corresponden a imagenes de la muestra Control y de los mismos GR incubados con las LRN durante 1 y 2 horas.

Figura 2. GR Control (400 X).

Figura 3. GR incubados con LRN 60 minutos (400 X).

Figura 4. GR incubados con LRN 120 minutos (400 X).

La tecnica de Titulacion de la agregacion por Polibrene mostro que en 2 de las experiencias hubo una disminucion significativa de Titulo entre los GR Control y Tratados (≥ 2 diluciones), pero en las 5 repeticiones realizadas el Score Total de agregacion de los eritrocitos incubados con LRN fue marcadamente inferior al de los Controles correspondientes, lo que se reflejo en la disminucion del CexpST. No se observaron diferencias en los valores obtenidos del coeficiente ni en los de Score Total de Agregacion entre los tratamientos con o sin agitacion. La media y desviacion estandar del CexpST fue 0,282±0,086, indicando que la carga anionica disminuyo significativamente en los eritrocitos incubados con LRN, por lo que la cantidad de agregado formado en los GR Tratados fue menor que en los GR Control. En todas las experiencias se observo que los Controles no modificaron el Titulo ni el Score Total de agregacion en las incubaciones con y sin agitacion, mostrando que la agitacion no es responsable de la alteracion de carga. Los resultados se muestran en la Tabla II.

Tabla II. Resultados del Método de Titulación de la Agregación por Polibrene.

Discusión y Conclusiones

A pesar de la alta prevalencia global de los helmintos intestinales en humanos, y del dano economico causado por estos en animales de interes productivo, el conocimiento de la relacion hospedador-parasito, es aun incompleto. La susceptibilidad a las infecciones parasitarias esta determinada por una ecuacion compleja, resultante de la interaccion del ambiente, el hospedador y el parasito ⁽²⁰⁾. La trichinellosis constituye una de las principales zoonosis de America latina y no solo representa un problema para la salud humana, sino tambien para la salud animal, ocasionando una merma economica en terminos de productividad ⁽²¹⁾.
Las larvas infectantes de este nematodo son ingeridas en carne cruda o mal cocida y se liberan en intestino delgado donde sufren 4 mudas de cuticula hasta convertirse en parasitos adultos. La copula ocurre con los nematodos embebidos en la mucosa intestinal y las hembras ovoviviparas liberan LRN aproximadamente a los 7 dias de la infeccion, durante semanas, hasta que son expulsadas ⁽¹⁾ o hasta que la respuesta inmune del hospedador afecte su viabilidad como fue comunicado por Uribarren Berrueta ⁽²²⁾. Las LRN pasan a torrente sanguineo y sistema linfatico y se diseminan en el cuerpo, ubicandose finalmente en los musculos estriados de mayor actividad y oxigenacion, tales como los masticatorios, diafragma, intercostales, oculares y miembros superiores e inferiores ⁽²²⁾. Excepto el breve lapso en el que las larvas infectantes se liberan de las fibras musculares por efecto de las enzimas proteoliticas en el estomago del hospedador, el unico periodo en el que T. spiralis se encuentra fuera de las celulas, es la etapa de migracion de las LRN hacia los musculos estriados ⁽²³⁾, periodo en el cual establece un intimo contacto con los eritrocitos de su hospedador. El acido sialico es un monosacarido excepcional, resultante de la condensacion de una molecula de acido piruvico con otra de manosamina, que posee mayor numero de atomos de carbono que todos los otros monosacaridos. Asimismo, es un acido onico, motivo por el que su molecula presenta una marcada polaridad ⁽²⁴⁾. La presencia del acido sialico en la superficie del eritrocito determina la carga negativa, y su disminucion tiene consecuencias hemorreologicas y hemodinamicas ⁽³⁾, ya que su remocion promueve la agregacion eritrocitaria, la formacion de rouleaux, la disminucion del flujo sanguineo y el aumento de la viscosidad de la sangre ⁽²⁵⁾. Anosa y Kaneko han comunicado que la disminucion del acido sialico globular tambien altera la superficie del eritrocito, modificandola antigenica y bioquimicamente, lo que produce un incremento de la fagocitosis hepatica de los globulos ⁽²⁶⁾.
El Analisis Digital de Imagenes mostro que los eritrocitos incubados con LRN, presentaban una disminucion del porcentaje de las celulas aisladas y un aumento del tamano de los agregados formados, en relacion a los Controles correspondientes, indicando la perdida de acido sialico globular, en concordancia con los resultados obtenidos en investigaciones previas ⁽²⁷⁾. El analisis estadistico concluyo que la agregacion en los GR Tratados fue mayor con el aumento del tiempo de incubacion. El Metodo de Titulacion de la agregacion por Polibrene, tambien evidencio la alteracion en la carga anionica de los eritrocitos incubados con LRN. La disminucion del acido sialico globular se reflejo, en todas las experiencias, en la disminucion del Score Total de Agregacion de los GR Tratados en relacion al de los Controles, asi como tambien en 2/5 repeticiones se observo la disminucion significativa del Titulo de agregacion por Polibrene. Si bien era de esperar que la agitacion controlada durante la incubacion aumentara el contacto entre los eritrocitos y las LRN, e influyera en los resultados obtenidos, no se observaron diferencias en los tratamientos con o sin agitacion, con ninguna de las dos metodologias empleadas. La obtencion de los mismos valores de Score Total de Agregacion y Titulo de los Controles con/ sin agitacion durante la incubacion, permitio comprobar que la perdida de acido sialico no se debia a destruccion globular por efecto de la agitacion, y que era ocasionada por el contacto con las LRN.
Los resultados obtenidos concluyen que el tratamiento de los globulos rojos con las LRN de T. spiralis produce la alteracion de la carga eritrocitaria. La disminucion de acido sialico globular observada in vitro, podria en la infeccion in vivo producir alteraciones hemorreologicas en el hospedador que se podrian relacionar con la trombosis comunicada en algunos pacientes con triquinosis ^(28-30), asi como tambien producir la modificacion superficial del eritrocito y aumentar su fagocitosis en higado, contribuyendo al estado de anemia reportado en esta infeccion ^(31)(32).

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Recibido: 15 de septiembre de 2015
Aceptado: 30 de octubre de 2015