HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

“Disfibrinogenemia Jujuy”, alteración asociada a trastornos hemorrágicos

“Dysfibrinogenemia Jujuy”, associated to bleeding Disorders

“Disfibrinogenemia Jujuy”, alteração associada a distúrbios hemorrágicos

 

Ana María Lauricella¹, Katja Sittinger², Christof Geisen², Lucía Clelia Kordich¹

¹ Doctora en Química. Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.
² Doctor en Medicina. German Red Cross Blood Centre, Institute of Transfusion Medicine and Immunohematology, Goethe University, Frankfurt, Germany.

CORRESPONDENCIA DRA. ANA MARÍA LAURICELLA Dpto. Química Biológica Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Pabellón II, piso 4°, Ciudad Universitaria, Güiraldes 2160 (C1428EHA), CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina. Teléfono/Fax: +54 11 4576 3342. E-mail: amlauri@qb.fcen.uba.ar.

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Resumen

El objetivo del presente trabajo fue estudiar a una joven paciente con manifestaciones hemorrágicas, caracterizar su fibrina plasmática e identificar la posible alteración molecular del fibrinógeno de la paciente y sus familiares directos. Se diagnosticó una disfibrinogenemia en la paciente, su madre y el medio-hermano, ambos asintomáticos. En estos individuos, la formación y lisis de la fibrina plasmática difirieron de los controles. La fase lag prolongada indicó la liberación lenta y defectuosa de los fibrinopéptidos; la pendiente menor que la del control sugirió una polimerización dificultada. La DOMax inferior mostró una fibrina compuesta por fibras delgadas. La fibrinolisis inducida por estreptoquinasa resultó más rápida que la correspondiente control. La secuenciación del ADN reveló una deleción homocigota que condujo a la ausencia de la glicina 14 de la cadena Aa del fibrinógeno (AaGly14del según nomenclatura de http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen). La madre y el medio hermano resultaron heterocigotas para la misma mutación. Esta alteración no descripta previamente, que se ha denominado fibrinógeno Jujuy, podría no interaccionar correctamente con el sitio activo de la trombina, provocando que los fibrinopéptidos se hidrolicen y liberen lentamente, originando fibras de fibrina más delgadas y degradables que las del control. Este mecanismo explicaría el sangrado moderado de la paciente.

Palabras clave: Disfibrinogenemia; Ensayos de coagulación; Fibrinoformación; Fibrinolisis.

Summary

The aim of this work was to study a young female with moderate bleeding symptoms, to characterize the plasma fibrin and to identify the possible molecular alteration in the fibrinogen of the patient and her family. A dysfibrinogenemia was diagnosed in the patient, the mother and the half-brother, both the latter asymptomatic. Kinetic parameters obtained from fibrin formation and lysis assays of the patient’s plasma samples were significantly different compared to the ones obtained with control plasma. A prolonged lag phase  indicated slow and defective fibrinopeptide releases, whereas a minor slope suggested an impaired fibrin assembly. A lower ODMax revealed a fibrin network composed of thinner fibers. Fibrinolysis induced by streptokinase resulted faster than control. DNA sequencing showed a homozygous deletion leading to AaGly14del (according to http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen). The mother and the half-brother resulted heterozygous for the same mutation. This previously undescribed alteration was named fibrinogen Jujuy. The mutate fibrinogen might not be correctly fixed to the active site of thrombin resulting in slow cleavage and release of fibrinopeptides, rendering thinner fibers, more susceptible to lysis than control. This mechanism may explain the moderate bleeding symptoms of the patient.

Key words: Dysfibrinogenemia; Coagulation tests; Fibrin formation; Fibrin lysability.

Resumo

O objetivo do presente trabalho foi estudar uma jovem paciente com manifestações hemorrágicas, caracterizar sua fibrina plasmática e identificar a possível alteração molecular do fibrinogênio da paciente e seus familiares diretos. Foi diagnosticada uma disfibrinogenemia na paciente, sua mãe e o meio-irmão, ambos assintomáticos. Nestes indivíduos, a formação e lise da fibrina plasmática diferiram dos controles. A fase lag prolongada indicou a liberação lenta e defeituosa dos fibrinopeptídeos; a pendente menor que a do controle sugeriu uma polimerização dificultada. A DOMax inferior mostrou uma fibrina composta por fibras delgadas. A fibrinólise induzida por estreptoquinase resultou mais rápida que a correspondente controle. A sequenciação do DNA revelou uma deleção homozigótica que conduziu à ausência da glicina 14 da cadeia Aa do fibrinogênio (AaGly14del conforme nomenclatura de http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen). A mãe e o meio irmão resultaram heterozigotos para a mesma mutação. Esta alteração não descrita previamente, que denominamos fibrinogênio Jujuy, poderia não interagir corretamente com o sítio ativo da trombina, provocando que os fibrinopeptídeos se hidrolisem e liberem lentamente, originando fibras de fibrina mais finas e degradáveis que as do controle. Este mecanismo explicaria o sangramento moderado da paciente.

Palavras-chave: Disfibrinogenemia; Ensaios de coagulação; Fibrinoformação; Fibrinólise.

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Introducción

La disfibrinogenemia es un trastorno de la coagulación causado por la biosíntesis alterada de la molécula de fibrinógeno que funciona anormalmente. El fibrinógeno juega un rol importante en la coagulación sanguínea, la fibrinolisis, la angiogénesis y otros numerosos procesos biológicos. Es una glicoproteína plasmática hexamérica grande (PM 340 kDa) de síntesis hepática; cada hemimolécula está formada por tres diferentes cadenas polipeptídicas (Aa, Bâ y ã) unidas entre sí por puentes disulfuro ⁽¹⁾. Tres genes codifican cada una de las cadenas del fibrinógeno; aunque están separados, los tres genes se encuentran reunidos dentro de la región del cromosoma humano 4q28-q31. A nivel molecular, los defectos del fibrinógeno son usualmente causados por deleciones, mutaciones puntuales o alteraciones que conducen a la proteína truncada ⁽²⁾⁽³⁾. Modificaciones en algunos de estos genes, excepcionalmente en dos de ellos en forma simultánea, pueden conducir a cambios moleculares del fibrinógeno y alterar el resultado de los procesos en los que interviene, ya sea variaciones en la interacción con enzimas como trombina, plasmina o factor XIIIa con el fibrinógeno modificado, o puede originar fibrina cuya funcionalidad y lisabilidad resulte diferente, siendo capaz de desencadenar eventos hemorrágicos o trombóticos. En la mayoría de los casos la disfibrinogenemia es un desorden autosómico dominante ⁽⁴⁾, cuya prevalencia es similar en hombres y mujeres ⁽⁵⁾. Las diferentes dis- fibrinogenemias reportadas han sido registradas y organizadas en la base de datos www.geht.org/databaseang/ fibrinogen. En la misma 975 anormalidades moleculares han sido individualizadas con sus características clínicas esenciales: 526 en Aa que incluyen 146 mutaciones en Aa16, 115 en Bâ y 334 en ã ⁽⁶⁾.
La disfibrinogenemia es diagnosticada por la prolongación de ensayos globales de coagulación –siendo generalmente mayor la del tiempo de protrombina (PT) que la del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT)– y por discrepancia entre los niveles de fibrinógeno determinados por métodos coagulables e inmunológicos ⁽⁷⁾. Desde 1994 se ha propuesto que la relación entre actividad funcional y antigénica inferior a 0,7 fuera considerada arbitrariamente como una posible disfibrinogenemia congénita ⁽⁸⁾. Las pruebas específicas que evalúan la actividad coagulante del fi- brinógeno son el tiempo de trombina (TT) y el tiempo de reptilasa (TR), siendo este último de mayor sensibilidad cuando la alteración se encuentra en la cadena Aá. El diagnóstico específico requiere demostrar la secuencia aminoacídica anormal o la caracterización del defecto funcional. El estudio cinético de la formación de la fibrina permite detectar ausencia o demora en la liberación de los fibrinopéptidos FPA y FPB, variación en la velocidad de polimerización y/o del grosor de las fibras de fibrina. Estudios diferentes han aportado información valiosa acerca de la relación entre los síntomas, estructura molecular, función y riesgos clínicos asociados al fibrinógeno alterado. Además, estos estudios contribuyen al entendimiento de la polimerización y del proceso lítico que ocurre con el fibrinógeno normal ⁽³⁾⁽⁷⁾.
El fenotipo clínico de los pacientes con disfibrinogenemia hereditaria es ampliamente heterogéneo; pueden sufrir episodios de sangrado, complicaciones tromboembólicas, incluso ambas variantes en el mismo paciente, abortos espontáneos, cicatrización defectuosa, entre otros desórdenes ⁽⁹⁾. Sin embargo, la mayoría de los casos son hallazgos de laboratorio en sujetos asintomáticos o son detectados a través de estudios familiares de pacientes diagnosticados. Es importante detectar portadores asintomáticos ya que, ante factores de riesgo o situaciones que pongan en peligro el delicado equilibrio del sistema hemostático, tienen probabilidad incrementada de desarrollar eventos cardiovasculares o de sangrado mayor respecto a individuos sin esta alteración. Recientemente, en un trabajo multicéntrico ⁽¹⁰⁾ sobre disfibrinogenemias congénitas con 9 años de seguimiento, se ha reportado que el 58% de los pacientes fueron detectados incidentalmente, el 10,9% han experimentado sangrado mayor y el 13,9% eventos trombóticos, avalando estadísticas anteriores ^(11)(12). El 19,8% de los embarazos de este grupo de pacientes resultaron en abortos espontáneos y el 21,4% desarrolló hemorragia post-parto; este último correlacionó con el fenotipo de sangrado identi- ficado previamente ⁽¹⁰⁾. Los mismos autores estudiaron la vinculación entre las propiedades del coágulo de fibrina con el fenotipo o genotipo de los pacientes ⁽¹³⁾. La fibrina de todos los pacientes resultó más desorganizada que la fibrina control. En los individuos que sufrieron sangrado, la fibrina resultó más permeable que la de pacientes asintomáticos o con antecedentes trombóticos. Además, pacientes con historia de trombosis presentaron prolongación en el tiempo de lisis del coágulo.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar a una joven paciente con manifestaciones hemorrágicas por pruebas de coagulación y evaluar la formación y lisabilidad de coágulos de fibrina plasmática de la paciente y sus familiares directos. La subsiguiente secuenciación del ADN permitió identificar la alteración en la molécula de fibrinógeno.

Materiales y Métodos

INDIVIDUOS ESTUDIADOS
La paciente es una joven caucásica que a los 25 años de edad ya había presentado antecedentes de sangrado moderado, caracterizado por menorragia, hemorragia después de una extracción dentaria y hematomas ante golpes menores. Sin embargo, ella nunca sufrió heridas importantes ni cirugías que desafiaran severamente su función hemostática. Otros miembros de la familia no han manifestado episodios hemorrágicos. La madre de la paciente tuvo cuatro embarazos normales sin sangrado postparto; los hermanos (por parte de madre) estudiados no registraron heridas relevantes ni historia quirúrgica alguna. La paciente y sus familiares aportaron el consentimiento informado de acuerdo a la declaración de Helsinski.

REACTIVOS Y EQUIPOS
Los reactivos para los ensayos globales de coagulación (TP, APTT, TT), TR, determinación de fibrinógeno coagulable, cuantificación de factores de coagulación y de plasminógeno, fueron de Diagnostica Stago (Asnieressur- Seine, Francia). Los niveles plasmáticos de fibrinógeno antigénico fueron determinados por inmunodifusión radial (Diffuplate Biocientífica, Buenos Aires, Argentina). ADP, adrenalina y ácido araquidónico utilizados para los ensayos de agregación plaquetaria fueron de Helena Laboratories (Beaumont, TX, EE.UU.); la trombina de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) y la estreptoquinasa de Sanofi (Paris, Francia). El resto de los reactivos empleados fueron de grado analítico. Se utilizó un coagulómetro semiautomático STart 4 (Diagnostica Stago, Asnieres-sur-Seine, Francia) y un agregómetro Chronolog (Havertown, Pennsylvania, EE.UU.). Para evaluar el ADN se utilizó un secuenciador automático (ABI Prism 3100, Applied Biosystems, Alemania).

ENSAYOS CINÉTICOS DE FIBRINOFORMACIÓN
Plasma citratado (depletado de plaquetas) de la paciente y sus familiares fueron coagulados por agregado de trombina (concentración final 0,05 IU/mL) y cloruro de calcio (20 mmol/L); como control se utilizó pool de plasma normal. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado. La formación de la fibrina se evaluó por estudios cinéticos midiendo la densidad óptica a 405 nm (DO 405nm) en función del tiempo en un lector de microplaca (Bio Tek EL 808, Winooski, Vermont, EE.UU.). Las curvas sigmoideas fueron caracterizadas por la fase lag (tiempo transcurrido desde el agregado de trombina y cloruro de calcio hasta el inicio de la coagulación) que evalúa la hidrólisis y liberación de los fibrinopéptidos; la pendiente de la etapa lineal, que representa la velocidad de polimerización y la densidad óptica correspondiente a la red de fibrina resultante (DO máxima) se asocia con el grosor de las fibras de la fibrina ^(14)(15).

ENSAYOS CINÉTICOS DE FIBRINOLISIS
Los geles de fibrina obtenidos como se describió anteriormente fueron estabilizados (2 h a temperatura ac La lisis fue inducida por el agregado de estreptoquinasa (70 µL de 0,7 U/µL) por encima de los geles de fibrina con el objeto de activar al plasminógeno plasmático presente en el gel. La DO 405nm fue registrada cada minuto y se obtuvo el tiempo de lisis completo (tiempo transcurrido entre el agregado del activador y el primer registro de la DO mínima) ⁽¹⁴⁾. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado.

ESTUDIO GENÉTICO
El material genómico de la paciente y los miembros de su familia fue aislado de sangre entera anticoagulada con EDTA, por lisis hipotónica de las células sanguíneas y subsecuente tratamiento con proteinasa K ⁽¹⁶⁾. La secuenciación completa de los exones y la unión entre los intrones y exones de los tres genes del fibrinógeno fue realizada en un secuenciador automático ⁽¹⁷⁾.

MÉTODOS ESTADÍSTICOS
Los ensayos de formación y lisis de la fibrina fueron realizados por cuadruplicado. Los resultados se expresan como promedio ± desvío estándar y fueron evaluados estadísticamente por el test de Student. Los valores de p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados

Los resultados de las pruebas globales de coagulación y la cuantificación del fibrinógeno se muestran en la Tabla I. Los estudios plasmáticos de la paciente mostraron que los tiempos de coagulación de las pruebas realizadas resultaron considerablemente prolongados. Los ensayos utilizando la mezcla 1:1 del plasma de la paciente y pool de plasma normal resultaron dentro de los valores de referencia, descartando así la presencia de inhibidor. Estos resultados, sumado a la discrepancia entre el nivel de fibrinógeno plasmático determinado por el método funcional y por el immunológico, permitieron detectar la disfibrinogenemia ⁽⁷⁾; por lo tanto, se decidió evaluar a otros miembros de la familia. Resultados discordantes, similares a los de la paciente, fueron obtenidos únicamente en su madre y su medio-hermano (Tabla I). Las pruebas globales de ambos individuos cuando se utilizó mezcla de corrección paciente:normal (1:1) resultaron normales. Los estudios de agregación plaquetaria y la cuantificación de los factores de coagulación y del plasminógeno resultaron dentro de los valores de referencia en todos los individuos estudiados. Los análisis de la medio-hermana no mostraron alteración alguna.

Tabla I. Resultados de las pruebas de coagulación.

En el ensayo de fibrinoformación de la paciente, los parámetros de las curvas sigmoideas obtenidas resultaron significativamente alterados con respecto a los del control (Tabla II).

Tabla II. Parámetros de las curvas cinéticas de formación y lisis de la fibrina. Fibrinformación de plasma coagulado con trombina (0,05 IU/mL) y cloruro de calcio (20 mmol/L). Lisis activada por estreptoquinasa (70 µL de 0,7 U/mL) sobre la superficie del coágulo de fibrina.

La fase lag prolongada evidencia que la liberación de los fibrinopéptidos fue lenta y defectuosa, mientras que la menor pendiente muestra un proceso de polimerización dificultado. Por otra parte, la densidad óptica final disminuida sugiere que la red de fibrina de la paciente estaba compuesta por fibras delgadas dentro de una estructura abierta, interpretación avalada por trabajos de Weisel ⁽¹⁸⁾. En los miembros de la familia con pruebas de coagulación prolongados, los parámetros de las curvas también resultaron moderadamente alterados (Tabla II). Los tiempos de lisis de la fibrina de los individuos afectados resultaron significativamente menores que los controles, indicando que la fibrina del fibrinógeno alterado se degrada con mayor facilidad. La secuenciación de los genes del fibrinógeno de la paciente reveló una deleción homocigota de los nucleótidos en el exón 2 del gen del FGA, que condujo a la pérdida del aminoácido glicina en la posición 14 de la cadena A del fibrinógeno (AaGly14del de acuerdo con la base de datos de las variaciones del fibrinógeno http://www.geht.org/databaseang/fibrinogen) o de la posición 33 c.96_98delAGG, p.Gly33del (nomenclatura con la Human Genome Variation Society, http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/). La madre y el hermano son heterocigotas para la misma mutación, mientras que la hermana no presentó alteraciones en el gen estudiado. El padre no estuvo disponible para el estudio.

Discusión y Conclusiones

Las disfibrinogenemias congénitas son alteraciones poco frecuentes, la mayoría de ellas heterocigotas y asintomáticas. Sólo pocos pacientes son homocigotas. Usualmente, el defecto molecular es causado por una mutación puntual en el genoma que resulta en la substitución de un único aminoácido en el fibrinógeno. Este hecho puede alterar la liberación de los fibrinopéptidos u otras funciones claves para la polimerización o la interacción con proteínas como el factor XIII, interfiriendo el desarrollo normal del mecanismo de coagulación y por lo tanto, afectando la estructura y lisis de la fibrina. En la paciente estudiada, los resultados prolongados de las pruebas globales (que corrigieron con plasma normal) y los niveles bajos de fibrinógeno funcional con niveles antigénicos normales, avalan el diagnóstico de disfibrinogenemia. Como se mostró en la Tabla I, su madre y su medio-hermano, ambos asintomáticos, fueron diagnosticados con la misma alteración. Los ensayos de fibrinoformación y lisis de la paciente, su madre y hermano resultaron significativamente alterados con respecto a los del control. De ellos surge que la liberación de los fibrinopéptidos fue lenta y defectuosa. Además, la fibrina polimerizó con dificultad, originando fibras delgadas dentro de una estructura abierta, que resultó fácilmente digerible ⁽¹⁸⁾. La densidad óptica máxima de la fibrina refleja las alteraciones de su estructura con una sensibilidad semejante a la determinación de la relación masa/largo de las fibras, tradicionalmente calculada utilizando aproximaciones geométricas ⁽¹⁹⁾. Según Weisel, la estructura y función de las redes de fibrina está modulada por factores congénitos y adquiridos que regulan al sistema hemostático. Las características de las redes de fibrina son determinantes de la actividad y el transporte de componentes fibrinolíticos dentro y a través de la red, afectando la velocidad de fibrinolisis y por consiguiente, la permanencia del coágulo en el vaso sanguíneo ⁽²⁰⁾.
Los estudios genéticos de la paciente mostraron una deleción homocigota en el gen que codifica para la cadena A del fibrinógeno y origina una proteína que carece del aminoácido glicina en la posición 14 (Aa- Gly14del). A esta variante del fibrinógeno, que no ha sido previamente descripta en la base de datos internacional, se la ha denominado “fibrinógeno Jujuy”. El aminoácido AaGly14 es parte del segmento del fibrinopéptido A, el cual forma puentes salinos y uniones puente de hidrógeno con aminoácidos específicos de la trombina. Los residuos Aa 6-18 del fibrinógeno son insertados dentro del bolsillo del sitio activo de la trombina y forma puentes de hidrógeno intermoleculares, particularmente entre la glicina 14 del fibrinógeno y la glicina 216 de la trombina ^(21-23); esta unión es necesaria para lograr la correcta conformación de la trombina que permita hidrolizar la unión Arg16-Gly17 del fibrinógeno. A partir de los resultados obtenidos con el plasma de la paciente, la ausencia de Gly14 en la cadena Aa del fibrinógeno alteraría el correcto posicionamiento de la unión Arg16-Gly17 en el sitio activo de la trombina, provocando que la hidrólisis se produzca más lentamente que la de la unión peptídica del fibrinógeno normal. En la evaluación posanalítica de los estudios moleculares de este caso y ante un nuevo interrogatorio, la madre manifiesta cosanguinidad con el progenitor de la paciente.
La presencia de la mutación heterocigota en la madre y el hermano explican las alteraciones leves mostradas en los estudios realizados. A pesar de que la madre es asintomática y desafió su coagulación con cuatro embarazos normales sin sangrado posparto, la formación y lisis de la fibrina in vitro resultó moderadamente defectuosa. Por lo tanto, el genotipo heteroacordecigota de esta disfibrinogenemia parece estar fisiológicamente equilibrado. Han sido descriptas numerosas mutaciones en el fragmento Aa 1-16; la mayoría de ellas fueron asociadas a manifestaciones hemorrágicas, afectando la liberación de los fibrinopéptidos y la polimerización de la fibrina ^(24)(25). En particular, la mutación AaGly13Glu en una mujer con pérdidas de embarazos recurrentes ha sido asociada con la polimerización y lisis defectuosa ⁽²⁶⁾. Un escenario similar podría esperarse si la paciente homocigota con fibrinógeno Jujuy estuviera embarazada. Por lo tanto, en esa situación, sería recomendable adoptar medidas terapéuticas preventivas durante la gestación. Si bien las pruebas fenotípicas de coagulación orientan al diagnóstico de disfibrinogenemia, el presente estudio de secuenciación y caracterización de la fibrina contribuye al entendimiento de las manifestaciones hemorrágicas. A pesar de que la frecuencia de las disfibrinogenemias es baja, es necesario el diagnóstico adecuado como alerta ante posibles complicaciones en situaciones futuras.
Los resultados del presente trabajo permiten concluir que la ausencia de la glicina 14 en la cadena Aa del fibrinógeno Jujuy alteraría la correcta interacción con el sitio activo de la trombina, enlenteciendo la hidrólisis de la unión Arg16-Gly17 y la liberación de los fibrinopéptidos, provocando la polimerización defectuosa de la fibrina de estructura abierta, compuesta por fibras delgadas, fáciles de lisar. Estas implicancias permitirían explicar las manifestaciones hemorrágicas de la paciente portadora de fibrinógeno Jujuy.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue subsidiado por la Universidad de Buenos Aires (UBACyT 2014/20020130100741BA), Argentina.

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Recibido: 13 de abril de 2016.
Aceptado: 28 de junio de 2016.