BIOLOGÍA MOLECULAR

La agregación de TDP-43 como posible blanco terapéutico contra la Esclerosis Lateral Amiotrófica*

TDP-43 aggregation as a possible therapeutic target for Amyotrophic Lateral Sclerosis

Agregação de TDP-43 como um possível alvo terapêutico para a Esclerose Lateral Amiotrófica

 

Lucia Cragnaz¹, Valentina Romano¹, Francisco Ernesto Baralle²

¹ Doctor en Ciencia.
² Médico, Doctor en Química.
* ICGEB – International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Padriciano 99, 34149 Trieste, Italy.

CORRESPONDENCIA Dr. FRANCISCO ERNESTO BARALLE ICGEB – International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Padriciano 99, 34149 TRIESTE, Italy E-mail: baralle@icgeb.org

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Resumen

Los agregados de TDP-43 representan una de las característica histopatológicas más importantes de varias enfermedades neurodegenerativas, entre las que se incluye la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA). TDP-43 está localizada principalmente en el núcleo. Sin embargo, los pacientes afectados por ELA presentan agregados de TDP-43 en el citoplasma de las neuronas comprometidas, con lo que se despoja al núcleo de TDP-43 funcional. Aún se desconoce si la degeneración causada por la agregación de TDP-43 es debida a una toxicidad intrínseca de los agregados o a la pérdida de función de TDP-43 como consecuencia del vaciamiento del núcleo. Varias investigaciones, incluidas las de estos autores, indican que la pérdida de función es el factor fundamental responsable de la neurodegeneración observada en presencia de inclusiones de TDP-43. Por otro lado, aún no existen tratamientos efectivos para la ELA. Por lo tanto, es de crucial importancia conocer las bases moleculares que conllevan al desarrollo de la enfermedad, con el objetivo de encontrar posibles estrategias terapéuticas. Para ello, estos autores han desarrollado un modelo celular capaz de imitar la agregación de TDP-43 y sus consecuencias. Finalmente, se ha utilizado este modelo para analizar el efecto de diferentes compuestos capaces de degradar los agregados de TDP-43 y se ha demostrado que esta podría ser una estrategia terapéutica válida para la ELA.

Palabras clave: Neurodegeneración; Esclerosis lateral amiotrófica; TDP-43; Agregado; Modelo celular; Posible terapia.

Summary

TDP-43 inclusions are important histopathological features of various neurodegenerative disorders, including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). TDP-43 is mainly a nuclear protein, but it shuffles from the nucleus to the cytoplasm. In patients’ brains, TDP-43 is retained in the cytoplasm of the affected motorneurons to form insoluble aggregates, which results in TDP-43 nuclear clearance. There is still no consensus whether TDP-43-mediated neurodegeneration results from a gain or loss of function of the protein or a combination of both. The work from several laboratories, including this, points towards a strong loss of function component. On the other hand, there is no effective treatment or cure for ALS. Thus, there is obviously a need to find new therapeutic strategies for ALS. In order to gain new insights into the molecular mechanism of the disease, and with the aim of looking for new methodologies that can revert it, a cellular model of TDP-43 aggregation that can mimic the phenotypic consequences found in ALS patients has been developed. Finally, this model was used to search for compounds that can dissolve these aggregates, and it was shown that the clearance of TDP-43 aggregates could be a therapeutic strategy for ALS.

Key words: Neurodegeneration; Amyotrophic lateral sclerosis; TDP-43; Aggregate; Cellular model; Possible therapies.

Resumo

Os agregados proteicos TDP-43 são características histopatológicas importantes de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS). A proteína TDP-43 se localiza principalmente no núcleo, porém nos cérebros de indivíduos afetados, a proteína TDP-43 fica retida no citoplasma dos neurônios motores, o que leva a formação de agregados insolúveis, resultando em deposição nuclear. Ainda não existe um consenso se a neurodegeneração mediada por TDP43 é causada por ganho ou perda da função da proteína ou uma combinação de ambos. O trabalho de muitos laboratórios, bem como este trabalho, apontam para uma forte perda da função da proteína. Por outro lado, não existe um tratamento efetivo ou cura para a ALS. Portanto, existe uma grande necessidade de identificar novos tratamentos para a ALS. Para entender o mecanismo molecular da doença, e com o objetivo de identificar novas metodologias para reverter a doença, desenvolvemos o modelo celular de agregados de TDP-43, o qual mimetiza as consequências fenotípicas encontradas em pacientes com ALS. Por fim, utilizamos esse modelo para identificar compostos que podem dissolver os agregados, e demonstramos que a liberação de inclusões de TDP-43 poderiam ser usados como tratamentos para a ALS.

Palavras-chave: Neurodegeneração; Esclerose Lateral Amiotrófica; TDP-43; Agregado; Modelo celular; Possíveis tratamentos.

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Introducción

Las enfermedades neurodegenerativas están caracterizadas por la presencia de agregados compuestos por una o más proteínas neuronales en el cerebro de los individuos afectados. Si bien cada enfermedad neurodegenerativa es diferente (en algunos casos el movimiento se ve afectado y no así la memoria, mientras que en otros casos la memoria se destruye y el movimiento se preserva) un denominador común es justamente la acumulación de proteínas mal plegadas en el sistema nervioso de los pacientes. Este proceso aberrante desencadena la degeneración de las neuronas involucradas ⁽¹⁾. Sin embargo, aún no se conoce la exacta relación entre los agregados de proteínas neuronales normalmente solubles y la patología de estas enfermedades ⁽²⁾.

Esclerosis Lateral Amiotrófica

En particular, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal de progresión veloz que involucra la degeneración de las motoneuronas del cortex motor y de la médula espinal ⁽³⁾. La enfermedad fue documentada por primera vez en 1869 por el neurólogo francés Jean-Martin Charcot ⁽⁴⁾.
La palabra "amiotrófica" deriva del griego. "A" significa no, "mio" se refiere al músculo y "trófica" significa sustento. Cuando el músculo no recibe estímulos se atrofia y pierde su capacidad de contracción. El término esclerosis lateral indica que los tractos corticoespinales anteriores y laterales se endurecen debido a la degeneración de las motoneuronas en estas áreas del sistema nervioso ⁽⁵⁾.
Los primeros síntomas de la ELA incluyen debilidad muscular, especialmente de las extremidades, y degeneración de las capacidades de lenguaje, deglución y respiración. Estos síntomas se agravan durante la progresión de la enfermedad, generando la pérdida total de tono muscular durante la etapa final, lo cual deriva en la parálisis de las extremidades. Generalmente los individuos afectados mueren por fallo respiratorio debido a la falta de inervación de los músculos respiratorios.
La mayoría de los casos de ELA (90-95%) son esporádicos, mientras que sólo el 5-10% de los casos presentan una herencia familiar debido a mutaciones genéticas ⁽⁶⁾. Independientemente de la presencia o no de mutaciones, estas dos variantes son indistinguibles desde un punto de vista sintomático, lo cual sugiere una patogénesis común. A pesar de la heterogeneidad que presenta la enfermedad, una característica patológica consistente a nivel molecular es la presencia de agregados proteicos en las neuronas afectadas ⁽⁷⁾.
A pesar de que la ELA es la enfermedad neuromuscular más común, y que fue descripta por primera vez hace más de 150 años, la ausencia de biomarcadores específicos (a excepción de las pocas mutaciones descriptas correspondientes al 5-10% de los casos) hace que su diagnóstico sea extremadamente difícil. Además, es importante señalar que la única droga disponible en el mercado para el tratamiento de esta enfermedad es el Riluzol que fue aprobado por la FDA hace más de 20 años ⁽⁸⁾, y que puede incrementar la sobrevivencia de los pacientes de solo 3 a 5 meses ^(9).
En 2006, un estudio identificó que el componente principal de los agregados proteicos presentes en pacientes con ELA es la proteína TDP-43 ⁽¹⁰⁾. Los agregados de TDP-43 están presentes en la mayoría de los casos de ELA, con y sin mutaciones en el gen TARDBP que codifica la proteína TDP-43. Esporádicamente, agregados de TDP-43 se han encontrado en las neuronas de los pacientes afectados por otras enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer, el Parkinson y la demencia de los cuerpos de Lewy ⁽¹¹⁾. Es fundamental, por lo tanto, establecer la relación que tienen estos agregados con la neurodegeneración. Algunas investigaciones indican que los agregados podrían ser tóxicos por sí mismos, mientras que otros estudios indican que los agregados podrían ser nocivos al causar la pérdida de función de la proteína agregada ⁽²⁾. Sin embargo, establecer la causa exacta es extremadamente difícil, dada la gran cantidad de procesos celulares que son regulados por TDP-43, y que pueden estar afectados cuando la proteína se encuentra en estado insoluble ⁽¹²⁾. Conocer la bioquímica detrás de la agregación de TDP-43 es importante para entender no sólo la patología sino también para identificar posibles marcadores bioquímicos para diagnóstico y seguimiento de la enfermedad. Con este objetivo, han sido creado numerosos modelos in vitro e in vivo. La mayoría de estos modelos recapitulan algunas características descriptas en los pacientes afectados de ELA, aunque no todas ⁽¹³⁾. Además de ser importantes para estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la enfermedad, el desarrollo de modelos es crucial para evaluar posibles estrategias terapéuticas.

Características bioquímicas de TDP-43

TDP-43 es una proteína perteneciente a la familia de las ribonucleoproteínas heterogéneas nucleares (hnRNPs) y que posee un alto grado de conservación entre especies ⁽¹⁴⁾. Su identificación como miembro de la familia de las hnRNPs y su rol fundamental en la regulación del splicing y de otros procesos relacionados al metabolismo del ARN fueron estudiados en este laboratorio en las últimas dos décadas ^(12)(15-17). Los roles fundamentales de TDP-43 incluyen, entre otras funciones, la regulación del splicing alternativo, la estabilidad del ARN, el procesamiento de micro ARN, y el transporte y traducción del ARN. Además, es una proteína con marcada tendencia a perder su conformación estable y formar agregados que en el steady state son degradados por mecanismos celulares específicos de reciclaje de proteínas (proteosoma y autofagia).
A nivel estructural TDP-43 está compuesta por 414 nucleótidos; contiene dos dominios funcionales de unión a ARN (RRM por su siglas en inglés), una señal de localización nuclear (SLN) en el dominio N-terminal de la molécula y una señal de exportación nuclear (SEN) dentro del RRM2; ambas secuencias permiten el transporte entre el núcleo y el citoplasma ⁽¹⁸⁾. La porción restante de la proteína está compuesta por el extremo C-terminal. Numerosos estudios han demostrado que esta región es responsable de la propensión intrínseca que posee TDP-43 a formar agregados ⁽¹⁹⁾. En particular, se ha reportado la presencia de una región rica en aminoácidos asparagina y glutamina (Q/N) dentro del extremo C-terminal, con características similares a las proteínas priónicas ⁽²⁰⁾.
Los priones son proteínas con conformaciones defectuosas capaces de inducir un cambio conformacional en la proteína nativa, y como consecuencia formar agregados proteicos aberrantes. Esta característica de los priones se conoce como seeding reaction, es decir, reacción de siembra, y es responsable de la propagación de la enfermedad a partir de uno o varios sitios de origen ⁽²¹⁾. Estudios in vitro han demostrado que la introducción de agregados de TDP-43 en células neuronales desencadena la agregación de la proteína endógena, confirmando la capacidad de estos agregados de propagarse y de actuar como sumidero de la proteína endógena ^(22)(23). Es por esta característica que TDP-43 es considerada una proteína prion-like. Es importante destacar que el concepto de prion-like difiere del concepto de prion debido a que las proteínas prion-like no son consideradas infecciosas ⁽²⁴⁾.
Basados en estas observaciones, los autores han desarrollado un nuevo modelo celular de agregación de TDP-43 basado en la secuencia Q/N. Este modelo y sus variantes son usados para múltiples propósitos:

• Estudiar el efecto de la agregación de TDP-43 en la fisiología celular.
• Estudiar cómo revertir los defectos del metabolismo causados por la agregación.
• Desarrollar un marcador que permita detectar TDP-43 agregada en estadios pre-sintomáticos de la enfermedad.

Materiales y Métodos

CULTIVO CELULAR
La línea celular utilizada en este estudio fue desarrollada utilizando la tecnología Flp-In (Invitrogen, nr. cat. K6010-01) y las células T-rex-293 (Invitrogen, nr. cat. R710- 07). El medio de cultivo utilizado fue el DMEM (Gibco, nr. cat. 10566016), y la tetraciclina fue utilizada a una concentración final de 1 μg/mL (Sigma, nr. cat. 87128) para inducir la expresión de la proteína transgénica.

INMUNOHISTOQUÍMICA
Las células fueron inducidas con tetraciclina por 24 horas y fueron procesadas, como se describió previamente ⁽²⁷⁾. Los siguiente anticuerpos fueron utilizados: anti-flag (1:200), anti-TDP-43 (1:200), anti-mouse- AlexaFluor 594 (1:500) y anti-rabbit-AlexaFluor 488 (1:500). TO-PRO3 fue utilizado como tinción nuclear.

AISLAMIENTO DE ARN
Las células fueron coleccionadas por centrifugación a 1000 rpm por 5 min. El pellet fue resuspendido en 500 μL de TRIzol (Invitrogen, nr. cat. 15596-026). Luego, 100 μL de cloroformo fueron agregados a cada muestra, y seguidamente de 15 min de incubación a temperatura ambiente, las muestras fueron centrifugadas nuevamente durante 15 min a velocidad máxima. La fase superior que contenía el ARN fue transferida a un nuevo tubo y el ARN fue precipitado con isopropanol. Luego de 10 min de incubación, las muestras fueron nuevamente centrifugadas a máxima velocidad por 10 min. Finalmente, el pellet de ARN fue lavado con etanol 70%, y resuspendido en agua.

RT-PCR
Para sintetizar la primera hebra del ADNc se utilizaron las condiciones indicadas por el fabricante de la enzima retrotranscriptasa M-MLV (Invitrogen, nr. cat. M1701). Brevemente, se tomó 1 μg de ARN total, y se utilizaron 2,5 mM de Random Primers (Pharmacia, nr. cat. 27-2166-01). Luego se procedió a la desnaturalización del ARN por 3 min a 70 °C. Trascurrido el tiempo de incubación, se agregaron 6 μL de buffer 5X, 1 μL de DTT 0,1 M, 3 μL de dNTPs y 0,5 μL de retrotranscriptasa M-MLV y se incubó 1 hora a 37 °C.
Finalmente se realizó una PCR utilizando como templado el ADNc. Para ello se utilizaron los primers específicos de POLDIP3 (Sentido: 5’gcttaatgccagaccgggagttgga3’, Antisentido: 5’tcatcttcatccaggtcatataaatt3’). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 °C 5 min, 95 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 1 min, 72 °C 7 min, los pasos 2 a 5 repetidos por 35 veces. Para separar los productos de PCR se realizó la electroforesis en gel de agarosa al 2%.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Y WESTERN BLOT
La separación de las proteínas totales fue realizada por electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%. Las proteínas fueron seguidamente transferidas a una membrana de nitrocelulosa, que fue incubada con los siguientes anticuerpos: anti-GFP (1:1000), anti-tubulina (1:4000), anti-rabbit-HRP (1:2000), anti-mouse-HRP (1:2000).

Resultados

GENERACIÓN DE UN MODELO CELULAR DE AGREGACIÓN DE TDP-43
El modelo celular de agregación de TDP-43 que se ha desarrollado se basa en la secuencia prion-like (Q/N) de 30 aminoácidos de TDP-43 identificada en este laboratorio ⁽²⁰⁾ (Fig. 1).

Figura 1. Representación esquemática de la estructura de TDP-43. La proteína se divide en dominio N- y C-terminal y contiene dos dominios funcionales de unión a ARN (RRM1 y RRM2). Dentro del extremo N-terminal se ubica la secuencia de localización nuclear (SLN). Dentro del RRM2 se encuentra la secuencia de exportación nuclear (SEN). Además, es importante señalar la región Q/N rica en aminoácidos asparagina y glutamina presente en el extremo C-terminal.

Como se ha demostrado en trabajos precedentes, la inducción eficiente de agregados se obtiene si la secuencia Q/N es repetida 12 veces (12xQ/N) ^(25-27). Por lo tanto, se creó una línea celular estable en la cual una única copia del constructo 12xQ/N fue introducido en el genoma de células HEK 293. La expresión del transgen se obtiene por inducción con tetraciclina, y de esta manera la expresión del 12xQ/N produce agregados que secuestran la TDP-43 endógena, generando una reducción de la TDP-43 nuclear (Fig. 2).

Figura 2. Inmunohistoquímica de células HEK 293 en presencia (Panel B) o ausencia (Panel A) de tetraciclina (Tet). La inducción con tetraciclina provoca la expresión del transgen 12xQ/N (rojo) que de esta manera forma agregados capaces de capturar la TDP-43 endógena (verde). Los núcleos se evidencian en azul. Los asteriscos indican núcleos en los cuales la reducción de TDP-43 es total.

Como consecuencia de la relocalización citoplasmática de la TDP-43 endógena, y siendo que esta proteína es mayoritariamente nuclear en condiciones normales, se genera una pérdida de función que puede ser detectada por la desregulación del splicing alternativo del exón 3 del POLDIP3. POLDIP3 es un gen cuyo ARNm experimenta splicing alternativo, proceso que es regulado por TDP-43. Como consecuencia, existen dos isoformas a nivel de ARNm; una incluye el exón 3 (variante-1) y la otra no lo incluye (variante-2). Cuando TDP-43 está presente, la variante-1 prevalece, en cambio cuando la proteína no está presente, o no es funcional, la cantidad de variante-2 aumenta respecto a la variante-1. Como puede ser apreciado en la Figura 3, la desregulación del splicing alternativo generada por la agregación del TDP-43 es comparable al resultado obtenido por el silenciamiento de la proteína, indicando que en ambos casos la pérdida de función de TDP-43 genera mayoritariamente la variante-2 del ARN de POLDIP3.

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 2% que permite observar el patrón de splicing alternativo de POLDIP3. Cuando TDP-43 está presente (línea 1 y 3) prevalece la variante-1 que incluye el exón 3. En cambio cuando TDP-43 es silenciada, o no es funcional (líneas 2 y 4 respectivamente) prevalece la variante-2, que no incluye el exón 3. siTDP-43: silenciamiento de la TDP-43 endógena, Tet: tetraciclina, E: exón, M: marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA ladder Promega.

IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS QUE LOGREN REVERTIR LOS DEFECTOS GENERADOS POR LA AGREGACIÓN DE TDP-43
Como ya se ha mencionado previamente, actualmente existe un único medicamento aprobado por la FDA para el tratamiento de la ELA. Sin embargo, la eficacia de este fármaco es modesta, ya que prolongaría solamente 3 meses la vida de los pacientes ⁽⁹⁾. Indudablemente, existe una fuerte necesidad de desarrollar nuevos potenciales tratamientos para esta enfermedad mortal. Basados en estos conceptos, se ha decidido utilizar nuestro modelo celular para identificar compuestos que puedan revertir los defectos moleculares causados como consecuencia de la agregación de TDP-43. Diversas investigaciones indican que la acumulación de TDP- 43 en las neuronas de los pacientes es debida a la falla de los sistemas celulares de reciclaje de proteínas defectuosas ^(28)(29), llevado a cabo principalmente por la autofagia y el proteosoma. Por lo tanto, se decidió investigar la posibilidad de utilizar fármacos que puedan inducir la degradación de los agregados de TDP-43 como una potencial estrategia terapéutica para tratar la ELA. De esta manera, al eliminar los agregados que actúan como sumidero de la proteína endógena, la nueva TDP- 43 que es sintetizada no se agregaría y estaría disponible para cumplir su función. Entre los fármacos utilizados se han encontrado varios capaces de degradar los agregados (Fig. 4) y que son capaces de restituir la funcionalidad de la TDP-43 a nivel molecular, medida por la inclusión del exón 3 del POLDIP3 (Fig. 5), que como ya se expuso anteriormente es un target conocido cuyo splicing alternativo está regulado por TDP-43.

Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida 12% que permite distinguir la cantidad de proteína total de 12xQ/N antes y después del tratamiento con el compuesto TCAD102. La tubulina fue utilizada como control de carga. Tet: tetraciclina.

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 2% que permite observar el patrón de splicing alternativo de POLDIP3. Cuando TDP-43 está presente (línea 1) prevalece la variante-1 que incluye el exón 3. En cambio, cuando TDP-43 no es funcional, debido a que se encuentra agregada (línea 2), prevalece la variante-2, que no incluye el exón 3. Por otro lado, esta situación puede ser revertida a través de tratamiento con TCAD102, uno de los fármacos capaces de degradar los agregados (línea 3). Tet: tetraciclina, E: exón, M: marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA ladder Promega.

Discusión y Conclusiones

El modelo desarrollado en este laboratorio es la base para el desarrollo de estrategias terapéuticas y diagnósticas. En particular, como ya se ha mencionado, este modelo está siendo utilizado en un screening global de moléculas simples capaces de estimular la eliminación de los agregados y la restauración de la función de TDP-43.
A su vez, el modelo está siendo empleado para desarrollar estrategias de terapia génica. En este caso, el objetivo es encontrar una molécula de TDP-43 funcional que no sea secuestrada por los agregados. Algunos mutantes de la región C-terminal han sido desarrollados y utilizados con resultados prometedores.
Finalmente, es importante señalar que una de las dificultades más importantes en el manejo clínico de la ELA es la falta de un diagnóstico precoz. A este respecto, sería útil concentrarse en el diseño de moléculas que puedan servir como tracers para detectar los agregados de TDP-43. El paso inicial es identificar este tipo de moléculas en nuestro modelo celular. Obviamente esto deberá ser desarrollado para obtener tracers capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y llegar a las neuronas que presentan los agregados de TDP-43 en los pacientes afectados por ELA.

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Recibido: 12 de julio de 2016
Aceptado: 23 de septiembre de 2016