HEMOSTASIA Y TROMBOSIS

Reacciones de N-homocisteinilación asociadas a hiperhomocisteinemia

N-homocysteinylation reactions related to hyperhomocysteinemia

Reações de N-homocisteinilação associadas a hiper-homocisteinemia

 

Valeria Genoud^1a, Irene Quintana^2a

¹ Doctora de la UBA. Área Química Biológica.
² Doctora de la UBA. Área Ciencias Químicas.
^a Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

CORRESPONDENCIA Dra. IRENE QUINTANA Int. Güiraldes 2160, Pabellón II, 4º piso, Ciudad Universitaria C1428EGA- CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina E-mail: iquin@qb.fcen.uba.ar  

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Resumen

Numerosas evidencias clínicas avalan la asociación entre concentración plasmática elevada de homocisteína (hiperhomocisteinemia) y las enfermedades vasculares oclusivas, tales como la aterosclerosis y la trombosis. La homocisteína reducida (Hcy) y su éster cíclico homocisteína-tiolactona (HTL) serían los principales responsables de los efectos nocivos asociados a la hiperhomocisteinemia. Tanto la Hcy como la HTL pueden interactuar espontáneamente con proteínas, a través de reacciones de S y N-homocisteinilación, respectivamente. Ambos procesos provocan alteraciones proteicas post-traduccionales, e inducen cambios estructurales y funcionales a nivel molecular. En los últimos años ha cobrado interés el conocimiento acerca de la HTL y las consecuencias de concentraciones elevadas de este metabolito sobre la salud humana. En las reacciones de N-homocisteinilación, el grupo carbonilo de la HTL se une al grupo ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, con lo que se generan grupos sulfhidrilo libres, susceptibles de participar en reacciones redox. Las proteínas N-homocisteiniladas pueden sufrir plegamiento incorrecto de la molécula y daño oxidativo, y en consecuencia se inducen efectos citotóxicos e inmunogénicos. Se ha establecido que la conversión metabólica de la Hcy en HTL y la N-homocisteinilación de proteínas es uno de los mecanismos involucrados en el desarrollo de patologías asociadas con la hiperhomocisteinemia, tales como las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas.

Palabras clave: Hiperhomocisteinemia; Homocisteína-tiolactona; N-homocisteinilación; Enfermedad vascular oclusiva.

Summary

Increased plasma homocysteine levels (hyperhomocysteinemia) are associated with occlusive vascular diseases, such as atherosclerosis and thrombosis. Reduced homocysteine (Hcy) and its cyclic ester, homocysteine thiolactone (HTL) would be involved in the detrimental effects associated to hyperhomocysteinemia. These two species, Hcy and HTL can spontaneously react with proteins, through S and N-homocysteinylation process, respectively. Both reactions produce post-translational protein changes, impairing structural and functional features. In recent years, interest has been developed in HTL and its effects on human health. N-homocysteinylation is the reaction between the carboxyl group of HTL and ε-amino group of lysine residues, rendering free sulfhydryl groups able to participate in redox reactions. N-homocysteinylated proteins are prone to misfolding and oxidative damage, inducing cytotoxic and immunogenic effects. Metabolic conversion of Hcy to HTL as well as protein N-homocysteinylation is one of the mechanisms underlying the development of pathologies associated to hyperhomocysteinemia, such as cardiovascular and neurodegenerative diseases.

Key words: Hyperhomocysteinemia; Homocysteine-thiolactone; N-homocysteinylation; Occlusive vascular disease.

Resumo

Numerosas evidências clínicas garantem a associação entre concentração plasmática elevada de homocisteína (hiper-homocisteinemia) e as doenças vasculares oclusivas, tais como a aterosclerose e a trombose. A homocisteína reduzida (Hcy) e seu éster cíclico homocisteína tiolactona (HTL) seriam os principais responsáveis pelos efeitos nocivos associados à hiper-homocisteinemia. Tanto a Hcy quanto a HTL podem interagir espontaneamente com proteínas, através de reações de S e N-homocisteinilação, respectivamente. Ambos os processos provocam alterações proteicas pós-traducionais, induzindo alterações estruturais e funcionais em nível molecular. Nos últimos anos, cobrou interesse o conhecimento acerca da HTL e as consequências de concentrações elevadas deste metabólito sobre a saúde humana. Nas reações de N-homocisteinilação, o grupo carbonila da HTL se une ao grupo ε-amino dos resíduos lisina das proteínas, gerando grupos sulfidrila livres, suscetíveis de participar em reações redox. As proteínas N-homocisteiniladas podem sofrer dobramento incorreto da molécula e dano oxidativo, induzindo efeitos citotóxicos e imunogênicos. Estabeleceu-se que a conversão metabólica da Hcy em HTL e a N-homocisteinilação de proteínas é um dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento de patologias associadas com a hiper-homocisteinemia, tais como as doenças cardiovasculares e neurodegenerativas.

Palavras-chave: Hiper-homocisteinemia; Homocisteína tiolactona; N-homocisteinilação; Doença vascular oclusiva.

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Homocisteína

Los niveles elevados de homocisteína (Hcy) en plasma constituyen un factor de riesgo independiente para la enfermedad vascular oclusiva, tanto a nivel arterial como venoso ^(1-4). La Hcy es un aminoácido que no forma parte de las proteínas y es un producto intermediario del metabolismo de la metionina. La Hcy puede metabolizarse por la vía irreversible de la transulfuración o por dos vías alternativas de remetilación (Fig. 1).

Figura 1. Metabolismo de la homocisteína.
SAM: S-adenosil metionina; SAH: S-adenosil homocisteína; THF: tetrahidrofolato; MT: metil transferasa; MTHFR: metilentetrahidrofolato reductasa.

Homocisteinemia

La actividad de las enzimas involucradas en el metabolismo de la metionina, principalmente metilentetrahidrofolato-reductasa y cistationin-β-sintetasa, y los niveles de ácido fólico y de las vitaminas B12, B6 y B2 son factores preponderantes en la regulación de la concentración de Hcy ⁽⁵⁾. Por lo tanto, alteraciones genéticas y/o adquiridas en los componentes mencionados pueden provocar un desbalance metabólico e incrementar la concentración intracelular de Hcy hasta niveles potencialmente tóxicos. Con el fin de evitar daños celulares, el aminoácido es exportado fuera de la célula, alcanzando la circulación sanguínea (6). Finalmente, las células hepáticas y renales son las principales responsables de captar la mayor proporción de Hcy circulante para llevar a cabo su eliminación, ya sea por un camino catabólico y/o por remetilación.
La Hcy, aminoácido de 4 átomos de carbono, presenta un grupo sulfhidrilo o tiol en su molécula, el que puede interactuar con otros grupos tiol. Así, en sangre, el alto contenido de oxígeno induce la oxidación del aminoácido generando distintos compuestos disulfuros. Además, la Hcy puede intervenir en reacciones de intercambio con otros compuestos azufrados a través de puentes disulfuro.
Como resultante de estos procesos, aproximadamente el 80% de la Hcy está ligada covalentemente a proteínas plasmáticas, un poco menos del 20% se une a tioles de bajo peso molecular y el resto circula como Hcy reducida y como homocisteína-tiolactona (HTL). Si bien existen equilibrios entre las diversas estructuras, la sumatoria de las mismas es constante y representa a la Hcy total en sangre, homocisteinemia ⁽⁷⁾.

Hiperhomocisteinemia

Diversos factores genéticos, nutricionales y otros tales como el sexo, la edad, ciertas drogas y patologías son condicionantes de los niveles de Hcy plasmática ⁽⁸⁾. La acción directa o indirecta de algunos de estos determinantes puede inducir un incremento en la concentración normal de Hcy, hiperhomocisteinemia. A partir de la asociación entre los niveles de homocisteinemia y la presencia de enfermedad aterotrombótica, reportada por un número muy importante de estudios clínicos y epidemiológicos, se han propuesto los valores de referencia para homocisteinemia. Inicialmente, se ha considerado como rango normal entre 5 y 15 μM ⁽⁹⁾. Sin embargo, diversos trabajos han mostrado que niveles de Hcy mayores a 12 μM o aún a 10 μM presentan una fuerte relación con la enfermedad vascular arterial y venosa ⁽¹⁰⁾.
Con el fin de evaluar las implicancias clínicas de la hiperhomocisteinemia, en los últimos años se llevaron a cabo más de 500 estudios transversales, caso-control y de cohorte prospectivos, con distintos criterios de diseño. Entre las evidencias reportadas se pueden mencionar: enfermedad vascular oclusiva, enfermedades neurológicas y complicaciones obstétricas. La hiperhomocisteinemia induciría efectos protrombóticos, ya que se ha descripto que la Hcy favorece la activación plaquetaria ^(11)(12) y de componentes del sistema de coagulación ^(13-15). Además, se observó alteración de las funciones antitrombóticas del endotelio, de los inhibidores fisiológicos y del sistema fibrinolítico ^(16)(17). De esta manera, se induciría la conversión de un fenotipo anticoagulante en uno procoagulante ⁽¹⁸⁾.

Homocisteína-tiolactona

En el inicio de las investigaciones se consideró a la Hcy libre o reducida como única especie responsable de la acción tóxica de la hiperhomocisteinemia. Sin embargo, más recientemente, se ha reportado que el éster cíclico, homocisteína-tiolactona, también estaría involucrado en los efectos nocivos observados.
La Hcy es un aminoácido que no forma parte de las proteínas pero, por su semejanza estructural con la metionina, ingresa al primer paso de la biosíntesis de proteínas y allí es convertida a HTL por un mecanismo de edición mediado por la metionil-ARNt-sintetasa (error-editing). De esta manera se evita que la Hcy forme parte de la nueva proteína sintetizada y es liberada al citoplasma como HTL. Este mecanismo altamente conservado es común a todos los organismos vivos, incluyendo bacterias, levaduras, plantas, ratones y seres humanos ⁽¹⁹⁾.
La Hcy libre y su éster cíclico son moléculas altamente reactivas, capaces de interactuar de manera espontánea, no enzimática, con proteínas y otros compuestos biológicos. La mayor parte de la Hcy se encuentra unida a proteínas a través de puentes disulfuro con los residuos cisteína de las mismas. Esta reacción de las proteínas con Hcy se denomina S-homocisteinilación. Por otra parte, el grupo carbonilo de la HTL forma una unión amida irreversible con el grupo ε-amino de los residuos lisina de las proteínas, generando aductos, en una reacción denominada N-homocisteinilación. En este proceso se generan grupos sulfhidrilo con alta reactividad para interactuar con distintas moléculas biológicas (Figura 2). Ambos tipos de reacciones producen modificaciones proteicas que provocan cambios estructurales y funcionales a nivel molecular.

Figura 2. Reacciones de S-homocisteinilación y N-homocisteinilación.

La Figura 3 muestra la interrelación entre Hcy, HTL y proteínas. La HTL puede reaccionar post-traduccionalmente con las proteínas recientemente sintetizadas dentro de la célula. También puede actuar fuera de la misma, N-homocisteinilando a las proteínas del plasma. Sin embargo, debido a que la HTL es sintetizada intracelularmente, los niveles plasmáticos son significativamente menores que los alcanzados en algunos compartimientos de la célula. Por lo tanto, es altamente probable que la N-homocisteinilación ocurra durante la síntesis de la proteína, más que durante su circulación en el plasma ⁽²⁰⁾. Dentro de la célula la HTL es hidrolizada y convertida nuevamente en Hcy por acción de la enzima bleomicina hidrolasa (Blmh); extracelularmente esta reacción es catalizada por la paraoxonasa 1 (Pon1). La hidrólisis enzimática de la HTL a Hcy facilita su eliminación por las vías clásicas de remetilación y transulfuración. Además, las proteínas N-homocisteiniladas sufren degradación proteolítica dando lugar a los péptidos lisina N-homocisteinilados.

Figura 3. Metabolismo de HTL.
Blmh: Bleomicina hidrolasa; Pon1: Paraoxonasa 1; MetRS: metionil ARNt sintetasa.

Proteínas N-homocisteiniladas

La incorporación de HTL a los grupos ε-amino de los residuos de lisina de las proteínas genera un grupo sufhidrilo libre, susceptible de participar en reacciones redox que podrían generar nuevos puentes disulfuro ⁽²¹⁾. En particular, las proteínas N-homocisteiniladas pueden sufrir daño oxidativo y agregación, provocando efectos citotóxicos e inmunogénicos ⁽²²⁾.
Las proteínas son N-homocisteiniladas proporcionalmente a su concentración plasmática, siendo el número de lisinas el mayor determinante de la reactividad ante la HTL. Esta correlación se cumple para proteínas relativamente pequeñas (hasta 698 aminoácidos), pero en aquellas de alto peso molecular la velocidad de reacción sería significativamente menor como consecuencia de la disminución en la exposición de los sitios lisina al medio. Otro determinante del nivel de N-homocisteinilación es la vida media de la proteína y por ende, el tiempo de exposición de la misma a la HTL. Se ha reportado que algunas proteínas purificadas a partir de plasma humano normal se encuentran N-homocisteiniladas en diferentes proporciones, confirmando que la homocisteinilación ocurre in vivo ⁽²³⁾.
La determinación de la concentración de HTL y de proteínas N-homocisteiniladas en plasma se realiza mediante distintas metodologías: cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía gaseosa con espectrometría de masa, electroforesis capilar y métodos enzimáticos, entre otros ^(24-26). Los estudios más relevantes han reportado, en condiciones normales, las siguientes concentraciones plasmáticas: 12 μM (Hcy total); 0,25 μM (Hcy reducida); 10 μM (Hcy unida a proteínas); 2 μM (homo y heterodímeros de Hcy); 3 nM (HTL) y 0,5 μM (HTL unida a proteínas) ⁽²⁴⁾. En individuos sanos las proteínas N-homocisteiniladas constituyen menos de 12,7% de la Hcy total y los péptidos lisina N-homocisteinilados menos de 1,2%. En condiciones de hiperhomocisteinemia estos valores aumentan y en particular, los niveles elevados del péptido lisina N-homocisteinilado son considerados como posible marcador de infarto agudo de miocardio ⁽²⁷⁾.
Además, la acumulación de proteínas N-homocisteiniladas conduce a una respuesta autoinmune como consecuencia de la generación de nuevos auto-antígenos. Se ha reportado que los niveles de los auto-anticuerpos generados, al igual que la concentración de Hcy plasmática, están significativamente aumentados en pacientes con enfermedad arterial coronaria y accidente cerebrovascular. Estos auto-anticuerpos se unirían a las proteínas N-homocisteiniladas en diversos tejidos, provocando los efectos nocivos asociados a la hiperhomocisteinemia ^(28-30).
Está claramente establecido que los cambios estructurales producidos por acción de HTL sobre las proteínas pueden provocar un plegamiento incorrecto de las mismas y la formación de agregados amiloides tóxicos. Se ha reportado que la modificación proteica inducida por N-homocisteinilación sería uno de los mecanismos responsables de la condición neurodegenerativa ⁽³¹⁾.
Un estudio reciente ha demostrado que tanto la HTL como las proteínas N-homocisteiniladas modulan la expresión de numerosos genes involucrados en la homeostasis vascular. Algunas de las vías moleculares afectadas incluyen modificaciones en la organización de la cromatina y sus histonas, contribuyendo a la disfunción endotelial y al proceso aterotrombótico. Además, la N-homocisteinilación interfiere en el metabolismo de lípidos y de aminoácidos azufrados, así como en el proceso de coagulación ⁽³²⁾.
La N-homocisteinilación de proteínas es un mecanismo de modificación no enzimática, similar a la alteración producida por glucosa, por productos de peroxidación lipídica y por ciertas drogas como aspirina y penicilina. Estos cambios en las proteínas presentan dos aspectos en común: el sitio de reacción es un residuo lisina y la modificación producida está asociada con diversas patologías tales como enfermedad cardiovascular, Alzheimer, diabetes y alergia o intolerancia a drogas ^(33)(34).
Las consecuencias de la N-homocisteinilación, a nivel estructural y funcional, de diversas proteínas han sido ampliamente estudiadas. Se ha demostrado que la albúmina, la hemoglobina y la gammaglobulina contienen micromoles de HTL por mol de proteína; mientras que el fibrinógeno, LDL, HDL, transferrina y antitripsina se unen a cantidades del orden de nanomoles (35). En particular, la mayoría de los trabajos se han focalizado en la albúmina y el fibrinógeno, como blancos directos de la acción de la HTL.
En estudios in vitro se ha demostrado, por diversas técnicas electroforéticas, que la albúmina N-homocisteinilada incrementa la carga neta negativa de la proteína ya que la HTL reacciona con los residuos lisina cargados positivamente, modificando la estructura de la molécula ^(36)(37). Se han identificado siete residuos lisinas como blancos de acción de la HTL (Lys 4, Lys 12, Lys 137, Lys159, Lys 205, Lys 212 y Lys 525) de los cuales el predominante es la Lys 525 ^(38)(39).
Está claramente establecido que las moléculas de albúmina alteradas por mutaciones o por acción de distintas sustancias que hayan generado nuevos sulfhidrilos libres, pueden unirse a sí mismas y ser susceptibles de agregación y de daño oxidativo. De manera similar, la albúmina N-homocisteinilada estaría expuesta a estas alteraciones. Por otro lado, se ha demostrado que la albúmina modificada es capaz de formar protrofibrillas tóxicas símil amiloides, responsables en parte, de la asociación entre la hiperhomocisteinemia y enfermedades neurodegenerativas ^(40)(41).
El fibrinógeno, otra de las proteínas afectadas por la HTL, interviene en variados procesos biológicos. La función principal del fibrinógeno es su conversión a fibrina por acción de trombina, enzima clave del sistema de coagulación. Los residuos lisina del fibrinógeno son fundamentales en la unión de componentes del sistema fibrinolítico, tales como plasminógeno y activador tisular del plasminógeno, a la red de fibrina. Se ha demostrado que coágulos obtenidos a partir de plasma N-homocisteinilado generan redes de estructura más compacta, densa y ramificada, menos permeables y más resistentes a la lisis que la fibrina control. Esta disminución de la fibrinolisis, que conlleva a un aumento en el riesgo de eventos trombóticos, también ha sido descripta a partir de fibrinógeno purificado ^(20)(42). Por lo tanto, la N-homocisteinilación del fibrinógeno contribuye a generar el fenotipo procoagulante asociado a la hiperhomocisteinemia. Además, se ha mostrado que el fibrinógeno N-homocisteinilado interactúa con las placas β-amiloides en los vasos sanguíneos del cerebro, contribuyendo al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer ⁽⁴³⁾.
En conclusión, se ha propuesto la "hipótesis de la HTL" que establece que la conversión metabólica de la Hcy en HTL, seguida de la modificación no enzimática de las proteínas, es uno de los mecanismos subyacentes que contribuye al desarrollo de patologías asociadas con la hiperhomocisteinemia, tales como las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas ⁽⁴⁴⁾.

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Recibido: 5 de agosto de 2016
Aceptado: 26 de agosto de 2016