INMUNOLOGÍA

Captación de ácido siálico por larvas musculares de Trichinella spiralis durante incubación in vitro

Sialic acid capture by Trichinella spiralis muscle larvae during incubation in vitro

Captação de ácido siálico por larvas musculares de Trichinella spiralis durante a incubação in vitro

 

Patricia Ponce de León¹, Gabriel López Murúa²

¹ Doctora en Ciencias Biomédicas.
² Bioquímico.
Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.

CORRESPONDENCIA Dra. PATRICIA PONCE DE LEÓNÁrea Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario Suipacha 531 2000 ROSARIO, Argentina E-mail: tefu1958@hotmail.com

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Resumen

Se ha comunicado que los eritrocitos (GR) incubados in vitro con larvas infectantes (LM) de T. spiralis presentan mayor agregación que los GR Controles incubados con solución salina, lo que indica que el parásito capta el ácido siálico globular. El objetivo del trabajo fue estudiar la captación de ácido siálico por LM durante incubación in vitro. Se incubaron 30, 60, 90 y 180 larvas con 30 mL del sedimento de GR en 1 mL de solución salina durante 24 y 48 h (37 °C). Se aplicó el Método de Agregación por Polibrene y se calculó Tïtulo, Score Total y CexpCASP. Los resultados mostraron una disminución significativa de estos 3 valores en relación al Control, excepto en el cultivo con 30 LM donde solo se observó un descenso moderado del Score Total y CexpCASP. La captación fue máxima a las 24 h, sin diferencias con los valores obtenidos a las 48 h. Posteriormente se incubaron 60 LM durante 1, 2 y 3 h. Se observó que no hubo captación de ácido siálico en la primera hora de incubación y que fue moderada a las 3 h. La experiencia demostró la captación de ácido siálico globular por las LM in vitro, lo que sugiere que podrían secuestrarlo del miocito con el objeto de evadir y/o interferir la respuesta inmune a los fines de asegurar su permanencia en el hospedador.

Palabras clave: Larvas musculares de T. spiralis; Captación ácido siálico in vitro.

Summary

It has been reported that erythrocytes (RBC) incubated with infective larvae of T. spiralis (ML) exhibit higher aggregation than Control RBC incubated with saline solution, indicating that the parasite captures erythrocyte sialic acid. The objective of this work was to study sialic acid capture by ML during in vitro incubation. A total of 30, 60, 90 and 180 larvae were incubated with 30 mL of GR sediment in 1 mL of saline solution for 24 to 48 hours (37 °C). Aggregation by Polybrene Method was used, and Titre, Total Score and CexpCASP were calculated. The results showed a significant decrease of these three values compared to Control except in the culture with 30 ML where only a moderate decrease of Total Score and CexpCASP were observed. The capture was maximal at 24 hours, with no difference with the values obtained at 48 hours. Then, 60 ML were incubated for 1, 2 and 3 hours. It was noted that ML did no capture sialic acid in the first hour of incubation and the capture was moderate at 3 hours. The experience showed globular sialic acid capture by ML in vitro, suggesting that they could sequester it from the myocyte in order to evade and/or interfere with the immune response for the purposes of assuring their permanence in the host.

Key words: Muscle larvae T. spiralis; Sialic acid capture in vitro.

Resumo

Foi informado que os eritrócitos (GV) incubados in vitro com larvas infetantes (LM) da T. spiralis apresentam maior agregação que os GV Controles incubados com solução salina, indicando que o parasita capta o ácido siálico globular. O objetivo do trabalho foi estudar a captação de ácido siálico por LM durante a incubação in vitro. Foram incubadas 30 , 60 , 90 e 180 larvas com 30 μL do sedimento de GV em 1 mL de solução salina durante 24 a 48 horas (37 °C). Foi aplicado o Método de Agregação por Polibrene e se calculou o Título, Pontuação Total e CexpCASP. Os resultados mostraram uma diminuição significativa desses três valores em relação ao Controle, exceto na cultura com 30 LM, onde foi observada apenas uma redução moderada da Pontuação Total e CexpCASP. A captação foi máxima às 24 horas, sem diferença com os valores obtidos às 48 horas. Posteriormente 60 LM foram incubadas durante 1, 2 e 3 horas. Observou-se que não houve captação alguma de ácido siálico na primeira hora de incubação e que foi moderada às 3 horas. A experiência mostrou captação de ácido siálico globular pelas LM in vitro, sugerindo que poderiam sequestrá-lo do miócito visando a evadir e/ou interferir a resposta imune, para garantir sua permanência no hospedeiro.

Palavras-chave: Larvas musculares T. spiralis; Captação ácido siálico in Vitro.

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Introducción

La trichinellosis es una parasitosis zoonótica y de distribución mundial, causada por Trichinella spp., el cual tiene una localización inicial intestinal y luego tisular.
El parásito presenta características especiales ya que es el nematodo de menor tamaño que parasita al humano y que solo requiere de un hospedador. Además, la forma infectiva es la larva 1 (L1), a diferencia de la mayoría de los nematodos, cuya forma infectiva es la L3 ⁽¹⁾⁽²).
Trichinella spp. se transmite de un animal a otro, o al humano, a través de la ingesta de tejido muscular crudo o mal cocido con larvas viables o vivas de Trichinella. Se contemplan ciclos de vida doméstico y silvestre. En ambos, el humano adquiere la infección por ingesta de carne cruda o mal cocida, de cualquier animal parasitado con larvas L1. Aunque los animales silvestres son los principales reservorios, ya que mantienen la mayor biomasa de parásitos, la infección en el humano, a nivel global, se adquiere de manera mucho más frecuente por ingesta de carne de cerdo, cruda o mal cocida.
Las larvas ingeridas se liberan en intestino delgado y allí sufren 4 mudas de cutícula hasta convertirse en parásitos adultos. La cópula ocurre con los nematodos embebidos en la mucosa intestinal y las hembras ovovivíparas liberan larvas recién nacidas aproximadamente a los 7 días de la infección, las cuales pasan al torrente sanguíneo y sistema linfático y se diseminan en el cuerpo, ubicándose finalmente en los músculos estriados de mayor actividad, donde se enquistan ⁽¹⁾.
En la actualidad se reconoce la existencia de más de 50 estructuras de ácidos siálicos que se sitúan en el extremo de las moléculas de las que forman parte ⁽⁴⁾. Presentan importantes funciones biológicas, por lo que se dedujo que algunas funciones de los glucoconjugados están determinadas, al menos parcialmente, por la participación de los ácidos siálicos en su composición ⁽⁴⁾. Su estudio ha permitido considerar que tendrían un papel importante en la interacción parásito-hospedador, pues a pesar de que los mecanismos celulares de muchos procesos infecciosos no se conocen con exactitud, se ha comunicado que involucrarían a los glucoconjugados de superficie de ambos ⁽⁵⁾.
En experiencias previas, realizadas in vitro y utilizando eritrocitos para el estudio de la desialización, se ha comunicado que las larvas musculares (LM) de T. spiralis alteran la agregación eritrocitaria ^(6-9). El objetivo de este trabajo fue estudiar la captación de ácido siálico por LM durante incubación in vitro.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

Larvas Musculares (LM): T. spiralis fue donada por el Laboratorio de Zoonosis, Laboratorio Central de la Red Provincial de Laboratorios, Dirección de Bioquímica y Farmacia (Santa Fe, Argentina) la cual se mantiene por pasaje en ratones CBi desde 2006. Esta cepa fue tipificada utilizando PCR múltiple (Departamento de Parasitología, Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud "Dr. Carlos Malbrán", Buenos Aires, Argentina).
Las larvas infectivas L1 utilizadas se obtuvieron por digestión artificial con pepsina y ácido clorhídrico de la masa muscular de ratones infectados de la colonia CBi-IGE del Instituto de Genética Experimental de la Facultad de Ciencias Médicas UNR. Este trabajo se realizó bajo las normas de bioseguridad adecuadas en el bioterio y laboratorio, con la aprobación del Comité de Bioética de las Facultades de Ciencias Médicas y de Bioquímica (UNR) para el procesamiento de muestras y manejo de los animales de experimentación.
Las larvas fueron contadas microscópicamente por duplicado y se preparó un concentrado larval en solución fisiológica, con una cantidad aproximada de 6000±100 larvas/mL ([CLM]).
Glóbulos rojos en medio salino (GR): Se trabajó con suspensiones de eritrocitos frescos Grupo O, lavados 3 veces en solución salina.

MÉTODOS

Incubación de los GR
Primera experiencia: Se prepararon 5 tubos de tapa a rosca con 1 mL de solución fisiológica. A todos se les agregaron 30 mL del sedimento globular. En 4 de ellos se adicionaron 30 mL de LM y los 2 restantes fueron utilizados como Controles.
A partir de [CLM] se hicieron diluciones en solución salina a los fines de obtener en los 30 mL adicionados, una cantidad aproximada de 180 y 90 larvas, con las que se sembraron 2 tubos con cada una de ellas (Total: 4 tubos).
Se prepararon 2 baterías de tubos, compuestas por un Control y los 2 Tubos sembrados con las distintas cantidades de LM. Una de las baterías fue incubada 24 h y la otra 48 h, a 37 °C en atmósfera de CO2.
Segunda experiencia: a los fines de observar cómo la cantidad de larvas musculares afectaba la agregación eritrocitaria, se repitió la experiencia incubando los eritrocitos con 60 y 30 larvas, de la misma manera a la descrita anteriormente.
Método de Polibrene Modificado en placa de vidrio ⁽¹¹⁾: Finalizado el tiempo de incubación, los GR incubados con las larvas y los Controles, fueron lavados en solución salina y se prepararon a partir de cada uno de los sedimentos, suspensiones al 20%.
El método se aplicó simultáneamente en el Control y en los mismos eritrocitos incubados con cada una de las distintas cantidades de LM. Se colocaron, en una placa de vidrio 1 gota de la suspensión eritrocitaria y 1 gota de Polibrene. Se mezcló con varilla de vidrio y se homogeneizó por movimientos circulares de la placa durante 1 minuto, hasta que se produjo la agregación entre los eritrocitos con carga negativa y el policatión Polibrene.
Se evaluó la carga aniónica del Control y de los GR incubados con las LM, considerando el Título, a la última dilución del policatión que presentó agregación. Se consideró significativa una diferencia de Título ≥2 diluciones entre ambos ⁽¹²⁾.
A los fines de comparar la agregación de los glóbulos incubados con LM, en relación a la del respectivo Control, se la semicuantificó con cruces (4+, 3+; 2+: 1+; +/-; -) y se asignó un score a cada una según Goudemand y Marsalet (13), de acuerdo con la siguiente escala:

4+ 10 1+ 2
3+ 8 +/ - 1 (agregación apenas visible)
2+ 5 - 0 (sin agregación)

Se determinó el Coeficiente experimental de captación de ácido siálico por el parásito usando el método de Polibrene (CexpCASP) como el cociente entre el score Total de la agregación (ST) de los eritrocitos incubados con las LM y el score de la agregación de los eritrocitos Control ⁽¹²⁾.

Resultados

PRIMERA EXPERIENCIA
Los resultados mostraron que la incubación de los eritrocitos con 90 y 180 LM durante 24 h, produjo una disminución significativa de Título (≥2 diluciones) y de ST de los GR Control, lo que se tradujo en valores muy bajos del CexpCASP (0,16 y 0,07 respectivamente). La incubación por 48 h presentó los mismos valores que a las 24 h, indicando que no hubo modificación en la captación de ácido siálico. Los GR Control presentaron el mismo Título y ST en ambos tiempos, indicando que la carga aniónica globular no se alteró con la incubación.

SEGUNDA EXPERIENCIA
De la misma manera a la observada en la experiencia anterior, las 48 h de incubación no modificaron los valores de Título, ST y CexpCASP de los GR en contacto con LM obtenidos a las 24 h, así como tampoco se modificaron los del Control.
En los tubos incubados con 60 larvas hubo una disminución significativa de Título y de ST, con un CexpCASP de 0,24. En la incubación con 30 larvas, si bien no modificó el Título en relación al Control, el ST fue menor y el valor del coeficiente presentó una disminución moderada (0,69).
Los resultados se observan en la Tabla I.

Tabla I. Valores de Título, score Total y CexpCASP.

En base a los resultados obtenidos se seleccionó la menor cantidad de larvas que produjo in vitro una diferencia significativa del Título de los GR Control y se procedió a realizar una tercera experiencia.

TERCERA EXPERIENCIA
Siguiendo el protocolo descrito, se adicionaron 60 larvas a 3 tubos que fueron incubados durante 1, 2 y 3 h, respectivamente.
Los resultados mostraron que en la primera hora de incubación se mantuvo el Título y el valor del ST de los GR Control (CexpCASP= 0,91), a las 2 h el Título tampoco se modificó aunque el ST presentó una leve disminución (CexpCASP= 0,80), y a las 3 h el Título descendió en una dilución (disminución no significativa), mientras que el ST fue moderadamente menor al del Control (CexpCASP= 0,64) (Tabla I).

Discusión y Conclusiones

A pesar de la alta prevalencia global de los helmintos intestinales en humanos, y del daño económico causado por estos en animales de interés productivo, el conocimiento de la relación hospedador-parásito es aún incompleto. Una clave para entender las infecciones parasitarias es el estudio de las interacciones que se establecen entre los dos organismos involucrados: el hospedador y el parásito ⁽¹⁴⁾.
La infección producida por el nematodo T. spiralis es un problema mundial porque constituye una de las principales zoonosis de América latina. En Argentina se la considera una enfermedad endémica con picos epidémicos, incluida dentro de las enfermedades alimentarias de notificación médica obligatoria por ley nacional ⁽¹⁵⁾.
El complejo ciclo evolutivo de T. spiralis incluye la migración de las larvas recién nacidas por el torrente circulatorio hasta su enquistamiento en músculo. El miocito, rico en residuos sializados, se desarrolla como "célula nodriza", una estructura funcional diferente de cualquier otra célula de mamíferos, la cual pierde sus características de célula muscular estriada, adquiere una cápsula de colágeno, evidencia un alto grado de angiogénesis y modifica la actividad de sus organelas ⁽³⁾. Si se considera que este complejo larva-célula nodriza modula de alguna manera la respuesta inmune del hospedador y puede permanecer viable durante años o eventualmente, sufrir calcificación, se podría especular que las larvas musculares podrían captar el ácido siálico del miocito.
El ácido siálico es el principal responsable de la carga eritrocitaria, pero debido a sus múltiples funciones, actualmente se reconoce su importancia biológica y su participación en la respuesta inmune ^(4)(16).
En experiencias previas, siempre realizadas in vitro, se ha comunicado que las larvas musculares (LM) de T. spiralis captan el ácido siálico y alteran la agregación eritrocitaria ^(6-9). Los resultados de este trabajo muestran que las LM secuestran este glucoconjugado durante la incubación in vitro.
Los eritrocitos en contacto con 60, 90 y 180 larvas durante 24 h, presentaron una disminución significativa del Título y una marcada disminución del ST, que fue menor a mayor cantidad de LM utilizadas en la incubación.
CexpCASP tiene un valor entre 0 y 1, siendo igual a 1 cuando no hay modificación de acido siálico por acción de las larvas e igual a 0 cuando los eritrocitos incubados con el parásito no agregan con el Polibrene puro ni con ninguna de sus diluciones (el contacto con el parásito ocasiona la pérdida total o casi completa del ácido siálico globular, o sea que la captación del mismo es máxima) ⁽¹²⁾. En las experiencias realizadas se observó que los valores del coeficiente al incubar con 60, 90 y 180
larvas durante 24 h, fueron muy pequeños (0.24, 0.16 y 0.07 respectivamente), indicando una gran pérdida de ácido siálico globular.
La incubación con 30 larvas no modificó el Tïtulo de los eritrocitos Control, aunque el ST y el CexpCASP presentaron una disminución moderada.
En las dos experiencias realizadas se observó que la agregación eritrocitaria se alteró a las 24 h, pero que los valores se mantuvieron iguales a las 48 h de incubación, por lo que se dedujo que la captación máxima de ácido siálico por las LM se alcanzó a las 24 h en las condiciones experimentales utilizadas.
En la tercera experiencia se incubaron los glóbulos rojos con 60 larvas, pues fue la menor cantidad que produjo una disminución significativa de Título del Control. Los resultados mostraron que a la hora de incubación con larvas musculares in vitro, no hay captación de ácido siálico, la cual recién comenzaría a presentar un aumento moderado a partir de las 3 h de incubación.
La experiencia demostró la captación de ácido siálico globular por las LM de T. spiralis durante incubación in vitro, sugiriendo que podrían secuestrarlo del miocito con el objeto de evadir y/o interferir la respuesta inmune a los fines de asegurar su permanencia en el hospedador.

Referencias bibliográficas

1. Pozio E, Hoberg E, La Rosa G, Zarlenga DS. Molecular taxonomy, phylogeny and biogeography of nematodes belonging to the Trichinella genus. Infect Gen Evol 2009; 9 (4): 606-16.         [ Links ]

2. Pozio E. Searching for Trichinella: not all pigs are created equal. Trends Parasitol 2014; 30 (1): 4-11.         [ Links ]

3. Uribarren Berrueta T. Trichinelosis o triquinelosis, 2015. Disponible en: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/trichinelosis.html. Fecha de acceso: 15 de marzo de 2016.         [ Links ]

4. Cabezas JA. Acides sialiques: Leur Signification Biochimique. Le Pharm Biol 1961; 2: 9-19.         [ Links ]

5. Buscaglia C. Trans-sialidasa de Tripanosoma cruzi: un blanco potencial para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Rev Hosp Mat Inf Ramón Sardá 2002; 21 (1): 24-7.         [ Links ]

6. Ponce de León P, López Murúa G, Bertorini G, Vasconi MD, Riquelme B. Efecto biorreológico de Trichinella spiralis sobre la agregación eritrocitaria mediante el Análisis Digital de Imágenes. Ciencia y Tecnología 1ª ed. Rosario: UNR Editora; 2013. p. 452-4.         [ Links ]

7. López Murúa G, Racca L, Ponce de León P. Efecto de Trichinella spiralis sobre la cinética de agregación eritrocitaria. Ciencia y Tecnología. 1ª ed. Rosario: UNR Editora; 2014. p. 61-3.         [ Links ]

8. López Murúa G, Racca L, Ponce de León P. Estudio de la cinética de captación de ácido siálico por larvas musculares de Trichinella spiralis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2015; 49 (2): 267-72.         [ Links ]

9. Ponce de León P, López Murúa G, Racca L. Estudio del efecto de Trichinella spiralis sobre la desialización aplicando el Método de Polibrene. Acta Bioquím Clín Latinoam 2015; 49 (3): 347-52.         [ Links ]

10. Luebke R. Nematodes as host resistance models for detection of immunotoxicity. Methods 2007; 41: 38.         [ Links ]

11. Lin M. A safe, simple and efficient cross matching using the slide polybrene method. Transfusion Today 2006; 66: 28.         [ Links ]

12. Ponce de León P, Racca L, Menendez M, Biondi C, Valverde J. Acción de Ascaris lumbricoides sobre la carga aniónica de eritrocitos y eritrocitos desializados. Acta Bioq Clín Latinoam 2012; 46 (2): 247-56.         [ Links ]

13. Goudemand M, Marsalet ID. Elements d´immuno-hématologie. 3a ed. Paris: Flammarion; 1974.         [ Links ]

14. Atías A. Parasitología Médica. 3° ed. Santiago: Publicaciones Técnicas Mediterráneo Ltd, 2007.         [ Links ]

15. Ribicich M, Gamble HR, Rosa A, Bolpe J, Franco A. Trichinellosis in Argentina: an historical review. Vet Parasitol 2005; 132 (1-2): 137-42.         [ Links ]

16. Cabezas Fernández del Campo JA. Influencia de la sialilación y de la "pegilación" de la molécula de ciertos medicamentos en su actividad. An R Acad Nac Farm 2008; 74 (3): 409-29.         [ Links ]

Recibido: 16 de marzo de 2016
Aceptado: 17 de abril de 2016