MICROBIOLOGÍA

Distribución de genes de adhesión y regulación de biofilm en Staphylococcus aureus

Distribution of adhesion and biofilm regulation genes in Staphylococcus aureus

Distribuição dos genes de adesão e regulação de biofilme em Staphylococcus aureus

 

Sofía Francisca Cruz Martínez¹, Gabriela Tapia Pastrana², Carlos Alberto Castañón Sánchez³

¹ Químico Biólogo. Facultad de Medicina y Cirugía. Universidad Autónoma Benito Juárez de Oaxaca.
² Dra. en Ciencias en Biología Celular. Investigadora en Ciencias Médicas. Laboratorio de Investigación Biomédica. Hospital Regional de Alta Especialidad de Oaxaca.
³ Maestro en Ciencias en Biomedicina Molecular. Investigador en Ciencias Médicas. Laboratorio de Investigación Biomédica. Hospital Regional de Alta Especialidad de Oaxaca, México.

CORRESPONDENCIA CARLOS ALBERTO CASTAÑÓN SÁNCHEZ Hospital Regional de Alta Especialidad de Oaxaca Laboratorio de Investigación Biomédica Calle Aldama S/N, San Bartolo Coyotepec OAXACA, México. C.P. 71256. Teléfono (52) 951 501 80 80 extensión 1230. E-mail: carlos.ctn@gmail.com 

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Resumen

La formación de biofilms es un importante factor de virulencia que contribuye en la cronicidad de los procesos infecciosos producidos por Staphylococcus aureus. Las proteínas presentes en su superficie pueden promover la formación de biofilm. En este estudio se comparó la distribución de genes que codifican para proteínas de adhesión asociadas con la formación de biofilm en cepas resistentes (MRSA) y sensibles a meticilina (MSSA). Al analizar un total de 106 aislados obtenidos de muestras sólidas y líquidas recuperados de un hospital de México, se determinó que la formación de biofilm está asociada de manera significativa a cepas MRSA (83%). Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se buscó la presencia de nueve genes de adhesinas (eno, ebps, fnbA, fnbB, fib, clfA, clfB, bbp, y cna) y dos de regulación del biofilm (icaA, icaD). Los resultados mostraron que los genes icaA, icaD, eno, ebps, clfA, clfB se amplificaron en todas las cepas mientras que los genes fnbA, fnbB, fib, y bbp tuvieron una distribución variable. Los datos obtenidos muestran por primera vez que la presencia del gen cna se encuentra asociada a cepas MSSA y no productoras de biofilm (p<0,05).

Palabras clave: Staphylococcus aureus; Biofilm; Resistencia a meticilina; Gen cna; Adhesión.

Summary

Biofilm formation is an important virulence factor that contributes to the chronicity of the infectious processes caused by Staphylococcus aureus. The proteins on the surface of this bacterium can promote the formation of a biofilm. The distribution of genes encoding adhesion proteins associated with biofilm formation in methicillin-sensitive (MSSA) and methicillin-resistant (MRSA) strains was compared in this study. The analysis of a total of 106 isolates obtained from solid and liquid samples collected from a hospital in Mexico showed that biofilm formation was significantly associated with MRSA strains (83%). The presence of nine adhesine genes (eno, ebps, fnbA, fnbB, fib, clfA, clfB, bbp, cna) and two biofilm regulatory genes (icaA, icaD) was looked for by polymerase chain reaction (PCR). The results evidenced that icaA, icaD, eno, ebps, clfA, and clfB genes were amplified from all strains, while fnbA, fnbB, fib, and bbp genes were non-uniformly distributed among them. Notably, the results showed for the first time that the presence of the cna gene is associated with biofilm non-producing MSSA strains (p<0.05).

Key words: Staphylococcus aureus; Biofilm; Methicillin-resistant; cna gene; Adhesion.

Resumo

A formação de biofilmes é um fator de virulência importante que contribui para a cronicidade dos processos infecciosos produzidos por Staphylococcus aureus. As proteínas presentes em superfície podem promover a formação de biofilme. Neste estudo, comparou-se a distribuição de genes que codificam para proteínas de adesão associadas com a formação de biofilmes em cepas resistentes (MRSA) e sensíveis à meticilina (MSSA). A análise de um total de 106 isolados obtidos a partir de amostras sólidas e líquidas coletadas em um hospital no México mostrou que a formação de biofilme é associada significativamente a cepas MRSA (83%). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para verificar a presença de nove genes de adesinas (eno, ebps, fnbA, fnbB, fib, clfA, clfB, bbp, cna) e dois genes reguladores do biofilme (icaA, icaD). Os resultados mostraram que os genes icaA, icaD, eno, ebps, clfA, clfB foram amplificados em todas as cepas, enquanto que os genes fnbA, fnbB, fib, e bbp tiveram uma distribuição variável. Os dados obtidos mostram pela primeira vez que a presença do gene cna está associada a cepas MSSA e não produtoras de biofilme (p<0,05).

Palavras-chave: Staphylococcus aureus; Biofilme; Resistente à meticilina; Gene cna; Adesão.

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Introducción

Los biofilms son comunidades microbianas cuyas células se encuentran adheridas a un sustrato, a una interfase o unidas entre sí, las cuales permanecen inmersas en una matriz polimérica extracelular y exhiben un fenotipo alterado respecto al crecimiento, la expresión génica y la producción de proteínas ⁽¹⁾. Al adoptar el modo de vida sésil, las bacterias que forman el biofilm poseen numerosas ventajas respecto a las células planctónicas ⁽²⁾, concentrando nutrientes, limitando las estrategias de eliminación activadas por el hospedero y tolerando altas concentraciones de antibióticos ⁽³⁾.
La formación del biofilm es un proceso que ocurre en tres principales etapas: (i) unión inicial a una superficie, (ii) maduración del biofilm, y (iii) dispersión ^{(4) (5)}. La adherencia inicial es un proceso mediado por proteínas de superficie referidas como componentes de superficie microbiana que reconocen moléculas adhesivas de matriz (MSCRAMMs, por sus siglas en inglés) ⁽⁶⁾. Durante un proceso infeccioso, estas adhesinas juegan un papel importante en la unión a proteínas del hospedero como fibrinógeno, fibronectina y colágeno. Se ha descrito que las proteínas de superficie de Staphylococcus aureus, un importante patógeno asociado a infecciones nosocomiales, son factores de virulencia esenciales para la adherencia y la formación de biofilms ⁽⁷⁾.
Una vez que el proceso de adherencia ha culminado, S. aureus inicia su acumulación en múltiples capas. Este proceso está asociado a la producción del polisacárido de adherencia intercelular (PIA, por sus siglas en inglés) ⁽⁸⁾, identificado inicialmente en S. epidermidis ⁽⁹⁾, y descrito como un componente clave en el desarrollo del biofilm. La síntesis de PIA es mediada por el locus icaADBC, siendo icaA e icaD quienes ejercen un papel principal en la síntesis del exopolisacárido ⁽¹⁰⁾. Recientemente se describió que aislados clínicos de S. aureus sensibles a meticilina (MSSA) forman biofilm predominantemente de manera dependiente de PIA ⁽¹¹⁾. Mientras que en cepas resistentes a meticilina (MRSA), las proteínas de superficie bacteriana y el ADN extracelular juegan un papel importante en el desarrollo del biofilm de manera independiente de PIA ^{(12) (13)}.
En este trabajo se investigó la distribución de genes que codifican para MSCRAMMs y los involucrados en la síntesis de PIA en aislados clínicos de S. aureus en el contexto de formación de biofilm en cepas MRSA y MSSA.

Materiales y Métodos

CEPAS CLÍNICAS
El presente estudio cuenta con la aprobación de los comités de investigación y ética del Hospital Regional de Alta Especialidad de Oaxaca (HRAEO), México. Se analizaron 106 cepas no duplicadas de S. aureus obtenidas de diferentes muestras que incluyen heridas, biopsias, abscesos, expectoraciones, lavado broncoalveolar, sangre y orina, procesadas en el Laboratorio de Microbiología del HRAEO, desde abril de 2014 a marzo de 2015. Las cepas se caracterizaron mediante la fermentación de manitol, tinción de Gram, las pruebas de catalasa, coagulasa, la presencia de hemólisis en agar sangre después de 24 h de incubación a 37 °C y la utilización del sistema automatizado Vitek 2 XL (BioMérieux). Adicionalmente, se amplificó mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) un fragmento de 370 bp correspondiente a la secuencia del gen ribosomal 16S de S. aureus ⁽¹⁴⁾. Las muestras se preservaron en caldo Luria-Bertani con glicerol al 20% a -70 °C.

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS RESISTENTES A METICILINA
Se emplearon tarjetas AST-GP67 en el equipo automatizado VITEK 2 XL, el cual se basa en las guías del CLSI que establecen como puntos de corte para cepas sensibles a oxacilina concentraciones ≤2 μg/mL y ≥4 μg/mL para las cepas resistentes ⁽¹⁵⁾. Para las pruebas de difusión en disco, se realizó una suspensión bacteriana equivalente a 0,5 McFarland y se inoculó en placas de agar Mueller Hinton (BD) empleando discos con 30 μg de cefoxitina (BBL). Las placas se incubaron durante 18 h a 35 °C. El punto de corte establecido por el CLSI para cepas sensibles es de ≥22 mm y para cepas resistentes de ≤21 mm ⁽¹⁵⁾. Se realizó la amplificación de un fragmento de 310 bp correspondiente al gen mecA, que codifica para la proteína PBP2a (Proteína de Unión a Penicilina 2a, por sus siglas en inglés) quien confiere la resistencia a meticilina ⁽¹⁴⁾. Como controles se incluyeron a las cepas de referencia MRSA ATCC 43300 y MSSA ATCC 29213.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La presencia de nueve genes de adherencia: eno, ebps, fnbA, fnbb, fib, clfA, clfB, bbp y cna y los genes de regulación de biofilm icaA, icaD en el genoma de los aislados, se determinó mediante PCR usando oligonucleótidos previamente descritos (Tabla I) ^(16-19). La identidad de los productos ha sido verificada mediante secuenciación ⁽²⁰⁾. Se realizaron cultivos de 18 h en caldo soya tripticasa (TSB) a 37 °C en agitación a 150 rpm y se centrifugó 1 mL del cultivo a 7500 rpm durante 5 min. Las bacterias se lavaron dos veces con agua libre de DNasas (Corning cellgro) y el ADN se extrajo mediante el equipo DNeasy (Qiagen) bajo las recomendaciones del fabricante. La calidad del ADN se verificó mediante espectrofotometría (Eppendorf BioPhotometer plus) y por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. La mezcla de reacción se realizó en un volumen final de 50 μL que contenía 1 μL de ADN templado, 25 μL de Master Mix (Bioline), 100 pMol de oligonucleótidos y agua libre de nucleasas. La PCR se realizó en un termociclador (Eppendorf Mastercycler nexus) con un paso inicial de desnaturalización de 10 min a 95 °C, seguido de 25 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C y 1 min a 72 °C, y una extensión final de 1 min a 72 °C. Los productos amplificados se detectaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se tiñó con bromuro de etidio y los amplicones se visualizaron en un transiluminador de luz UV (Benchop UVP).

Tabla I. Genes blanco y cebadores usados en este estudio.

ENSAYO DE FORMACIÓN DE BIOFILM
Para cuantificar la capacidad de producción de biofilm se realizó un ensayo en placas de poliestireno como se ha descrito ⁽²¹⁾, con algunas modificaciones. Brevemente, a partir de un cultivo de 18 h se realizó una dilución en caldo TSB suplementado con glucosa al 0,25% (Meyer) hasta obtener una densidad óptica de 0,1 (OD600) y se transfirieron 200 μL en placas de poliestireno de 96 pozos (Corning Costar) y se incubaron durante 24 h a 37° C. Las placas se lavaron tres veces con 200 μL de buffer de fosfatos (PBS) pH 7,4 (Life Technologies). Las placas se dejaron secar y las células adheridas a la superficie se tiñeron con 100 μL de cristal violeta al 0,1% (Hycell) durante 5 min. El exceso de colorante se lavó tres veces con PBS y la placa se dejó secar al aire y el colorante se solubilizó con 100 μL de etanol al 70%. Finalmente, la absorbancia de cada eluído se determinó a 600 nm en un espectrofotómetro (Imark, Bio-Rad). La cepa de referencia de S. epidermidis ATCC 12228 se empleó como control negativo ya que es reconocida como no formadora de biofilm. El valor de 0,5 (OD600) que corresponde al promedio del control negativo más tres desviaciones estándar, se seleccionó como el punto de corte para diferenciar a las cepas formadoras de biofilm ⁽²²⁾. Adicionalmente, se incluyó a la cepa de referencia de S. aureus ATCC 33591 como control positivo para la formación de biofilm (23). Todas las cepas se analizaron por octuplicado y se realizaron tres experimentos independientes.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis estadístico se realizó usando la prueba de Chi cuadrado y t de Student mediante la utilización del programa SPSS versión 20,0 (IBM Corp). Los valores de p menores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

AISLADOS CLÍNICOS
De los 106 aislados analizados, 19 (18%) provienen de muestras líquidas, de las cuales 5 (4,7%) corresponden a líquidos corporales (3 líquidos de diálisis, 1 líquido sinovial y 1 líquido de ascitis), 7 (6,6%) a muestras de orina y 7 (6,6%) a hemocultivos. Las 87 cepas restantes se aislaron de muestras agrupadas como sólidas: 5 (4,7%) se recuperaron de abscesos, 2 (1,8%) de exudados, 29 (27,3%) de heridas, 4 (3,7%) a partir de biopsias y 47 (44,3%) de vías respiratorias bajas (secreciones bronquiales).

DISTRIBUCIÓN DE CEPAS MRSA
Los aislados se dividieron en dos grupos: MRSA y MSSA, con base en la resistencia o sensibilidad a meticilina determinada por microdilución en caldo, Kirby- Bauer o la amplificación del gen mecA (Figura 1). De los 106 aislados, 30 (28,3%) se clasificaron como resistentes a meticilina y 76 (71,7%) como cepas sensibles a meticilina, respectivamente (Tabla II).

Figura 1. Identificación de cepas MRSA y MSSA por PCR. Electroforesis en gel de agarosa (2%) que muestra la amplificación de un fragmento de 310 bp que corresponde al gen mecA en cepas MRSA. (+): S. aureus MRSA ATCC 43300, (-): S. aureus MSSA ATCC 29213, MRSA: cepa clínica resistente a meticilina, MSSA: cepa clínica sensible a meticilina, C: control sin ADN. Como control de especie se amplificó un fragmento de 370 bp del gen ribosomal 16S de S. aureus.

Tabla II. Producción de biofilm en cepas sensibles y resistentes a meticilina.

FORMACIÓN DE BIOFILM
La producción del biofilm se evaluó en las clonas MRSA y MSSA por el método de placas de microtitulación. El 50% (53/106) de los aislados se identificaron como formadores de biofilm. Entre las cepas MSSA, el 28% (27/76) formaron biofilm. Interesantemente, el 83% (25/30) de los aislados MRSA se identificaron como formadores de biofilm con un valor de p<0,05 (Tabla II).
Al analizar los aislados clínicos formadores de biofilm recuperados de muestras sólidas (50,6%), se observó una proporción similar a las cepas no formadoras de biofilm aisladas también de muestras sólidas (49,4%). Un comportamiento similar se observó en las cepas recuperadas a partir de muestras líquidas, grupo en el que se identificó que el 47,4% formaron biofilm y el 52,6% restante correspondió a cepas no formadoras de biofilm (Tabla III).

Tabla III. Formación de biofilm y agrupación respecto al tipo de muestra.

DISTRIBUCIÓN DE GENES DE ADHESIÓN Y REGULACIÓN DE BIOFILM
Se detectaron mediante PCR nueve genes que codifican para proteínas involucradas en la adhesión y dos genes relacionados con la regulación de la formación de biofilm (Figura 2). Como se muestra en la Tabla IV, los genes icaA, icaD, eno, ebps, clfA y clfB, se amplificaron en todos los aislados clínicos. El gen fib no se amplificó en un aislado y el gen fnbA no se detectó en dos aislados. La amplificación de bbp se identificó solo en cinco aislados clínicos. Las cepas positivas para fnbB corresponden al 20,8% (22/106) y para el gen cna al 34% (36/106). Las diferencias en los genes fnbB y bbp no mostraron ser significativas en ambos grupos. Cuando se analizó la distribución de los genes estudiados con respecto a la resistencia a meticilina se observó que el gen cna es poco frecuente en las cepas MRSA con respecto a las cepas MSSA (p<0,05). Adicionalmente, se observó que la distribución del gen cna es significativamente más baja en los aislados clínicos formadores de biofilm, en comparación con los aislados no formadores de biofilm (Tabla V). Interesantemente, se identificó que el 71,4% (20/35) de las cepas MSSA que presentan el gen cna no forman biofilm.

Figura 2. Amplificación por PCR de genes de regulación de biofilm y de genes de adhesinas. Electroforesis en gel de agarosa (2%) que muestra los amplicones de los genes icaA 188 bp, icaD 198 bp, eno 301 bp, ebps 180 bp, fnbA 128 bp, fnbB 523 bp, fib 405 bp, clfA 288 bp, clfB 203 bp, bbp 574 bp, y cna 192 bp. M: marcador de pares de bases.

Tabla IV. Distribución de genes de adhesión y regulación de biofilm en cepas MRSA y MSSA.

 

Tabla V. Distribución de genes de adhesión y regulación asociados con la formación de biofilm.

Discusión y Conclusiones

S. aureus es un importante patógeno oportunista que puede causar infecciones de la piel, tejidos blandos y enfermedades invasivas como endocarditis, neumonía y osteomielitis ⁽⁶⁾. La capacidad para formar biofilm confiere ventajas de sobrevivencia para la bacteria, al limitar la acción de antimicrobianos y el contacto con células del sistema inmune ⁽⁷⁾. Se ha descrito que las cepas MRSA y MSSA producen biofilm por diferentes mecanismos. Sin embargo, se ha documentado que la resistencia a antibióticos beta-lactámicos parece ser relevante en el fenotipo biofilm. La escisión del elemento SCCmec de la cepa hospitalaria MRSA BH1CC se asoció con la disminución en la formación de biofilm ⁽²⁴⁾. En este trabajo se observó que el 83% de las cepas MRSA forman biofilm en comparación con el 37% de las cepas MSSA formadoras de biofilm. Los resultados otenidos son consistentes con reportes previos que muestran la relación entre la formación del biofilm y la resistencia a meticilina en cepas hospitalarias ⁽²⁵⁾.
Recientemente se reportó que aislados hospitalarios de Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli y S. aureus, recuperados a partir de muestras provenientes de sitios no fluidos como tejidos, hueso y tracto respiratorio, mostraron una alta proporción de cepas biofilm positivas al ser comparadas con aquellas recuperadas a partir de fluidos como orina o sangre ⁽²⁶⁾. Contrario a los hallazgos descritos anteriormente, las cepas analizadas en este estudio mostraron un comportamiento similar, tanto en muestras sólidas como en muestras líquidas.
Las cepas clínicas MSSA forman biofilm de manera dependiente del operón icaADCB y la producción de PIA, mientras que en las cepas MRSA la formación del biofilm es independiente de PIA ⁽¹³⁾. Sin embargo, se ha descrito que el locus ica es una característica predominante de cepas clínicas de S. aureus ⁽²⁷⁾. Cuando se analiza la distribución de los genes icaA e icaD se observa la amplificación en las 106 cepas de S. aureus. Adicionalmente, se analizó la prevalencia de nueve genes MSCRAMMS. Los genes eno, ebps, clfA y clfB se amplificaron en el 100% de los aislados y los genes fib y fnbA se encontraron ampliamente distribuidos, en el 98,1% y 99,1% respectivamente, y el gen bbp se amplificó en el 4,7% de las cepas, todos los datos en concordancia con un reporte previo ⁽²⁰⁾. Sin embargo, Szczuka et al., mostraron que de las 80 cepas MRSA analizadas, ninguna presentó los genes fnbA y bbp. En este estudio, al analizar la distribución del gen fnbB respecto a la resistencia a meticilina, se observó que el 10% de las cepas MRSA presentan el gen, contrario al 50% reportado por otros autores ^{(8) (20)}.
Interesantemente, se identificó que el gen cna está presente en el 46% de las cepas MSSA y en el 3% de las cepas MRSA, con significancia estadística. Adicionalmente, se observó que el gen cna se asoció a cepas no formadoras de biofilm. Recientemente, se realizó en análisis del transcriptoma de la cepa MSSA ATCC 25923 bajo tratamiento con ácido ursólico, una droga que inhibe la formación del biofilm. Los resultados obtenidos mostraron la disminución de la expresión de cna en condiciones inhibitorias de biofilm. Los datos sugieren que el producto del gen cna puede contribuir en la formación del biofilm en cepas MSSA ⁽²⁸⁾.
Los resultados obtenidos indican por vez primera que las cepas MRSA presentan una baja distribución del gen cna, en comparación con las cepas MSSA. Las discrepancias con los datos publicados por otros grupos, pueden deberse a diferencias en la distribución geográfica de las cepas analizadas. Posteriores estudios deberán ser enfocados en determinar los niveles de expresión del gen cna con la finalidad de validar el papel funcional de la proteína CNA en el establecimiento del biofilm en cepas MSSA.

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Recibido: 16 de agosto de 2015
Aceptado: 18 de marzo de 2016