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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957On-line version ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.51 no.3 La Plata Sept. 2017

 

HEMATOLOGÍA

Técnicas convencionales aplicadas al diagnóstico de las hemoglobinopatías*

Conventional techniques applied to the diagnosis of hemoglobinopathies

Técnicas convencionais aplicadas ao diagnóstico das hemoglobinopatias

 

Beatriz Erramouspe1,a, Silvia Judith Eandi Eberle1,b

1 Bioquímica.
a Laboratorio de Hematología. U. A. Dr. César Milstein, La Rioja 951. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.
b Servicio de Hematología Oncológica. Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan. Combate de Los Pozos 1881. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina.
* Subcomisión de Eritropatías, Sociedad Argentina de Hematología.

CORRESPONDENCIA Bioq. BEATRIZ ERRAMOUSPE E-mail: berramouspe@hotmail.com.ar


Resumen

Las hemoglobinopatías son trastornos hereditarios debidos a una gran variedad de defectos que afectan a los genes de globina. El diagnóstico de las hemoglobinopatías resulta de una combinación de estudios clínicos, pruebas de laboratorio y estudio familiar. Las herramientas básicas incluyen hemograma, hemoglobina e índices eritrocitarios (VCM, HCM), morfología de los eritrocitos, recuento de reticulocitos y perfil de hierro. Las determinaciones complementarias son electroforesis de hemoglobina que permite separar las diferentes variantes de acuerdo con su carga eléctrica, cuantificación de hemoglobina A2 (HbA2), Fetal (Hb F), pruebas de solubilidad hemoglobínica y falciformación. Otras técnicas se basan en propiedades fisicoquímicas como la estabilidad de la hemoglobina para detección de variantes inestables. En la práctica las pruebas más útiles son las que permiten detectar la presencia de hemoglobinopatías, como ocurre con la hemoglobina S dejando para laboratorios especializados aquellos procedimientos para identificar la mutación. La correcta detección de los portadores de las diferentes hemoglobinopatías tiene como finalidad dar un consejo genético adecuado sobre la forma de herencia, el riesgo de tener hijos afectados con las formas graves de la enfermedad y evitar tratamientos innecesarios. El diagnóstico molecular se reserva para la alfa talasemia, para cuadros con genotipos complejos, estudios prenatales o epidemiológicos.

Palabras clave: Hemoglobinopatías; Variantes estructurales; Hemoglobina A2; Hemoglobina S; Talasemia.

Abstract

Hemoglobinopathies are hereditary syndromes determined by a large variety of globin gene defects. Hemoglobinopathy diagnosis results from the combination of clinical orientation, laboratory tests and family studies. Basic tools include complete blood cell count, red blood cell count, hemoglobin quantification and red cell indices (MCV, MCH), blood film examination, reticulocyte count and iron status. Complementary determinations are hemoglobin electrophoresis, which enables the separation of the different hemoglobin variants according to their electrical charge, A2, and Fetal hemoglobin quantification, hemoglobin solubility and sickling test for Hb S diagnosis. Other techniques are based on physicochemical properties such as stability of hemoglobin for detection of unstable variants. In practice, the most useful tests are those that enable the detection of hemoglobinopathies, such as hemoglobin S, and the identification of the genetic defects is referred to specialized laboratories. The correct detection of the carriers of the different hemoglobinopathies is intended to give adequate genetic advice on the form of inheritance and the risk of having affected children with the severe forms of the disease and to avoid unnecessary treatments. Molecular diagnosis is reserved to a thalassemia complex genotypes, prenatal o epidemiological studies.

Keywords: Hemoglobinopathies; Structural variants; Hemoglobin A2; Hemoglobin S; Thalassemia.

Resumo

As hemoglobinopatias são distúrbios hereditários resultantes de uma grande variedade de defeitos que afetam os genes de globina. O diagnóstico das hemoglobinopatias decorre de uma combinação de estudos clínicos, provas de laboratório e estudo familiar. As ferramentas básicas incluem hemograma, hemoglobina e índices eritrocitários (VCM, HCM), morfologia dos eritrócitos, contagem de reticulócitos e perfil de ferro. As determinações complementares são eletroforese de hemoglobina que permite separar as diferentes variantes, de acordo com sua carga elétrica, quantificação de hemoglobina A2 (HbA2), Fetal (Hb F), provas de solubilidade hemoglobínica e falciformação. Outras técnicas baseiam-se em propriedades fisicoquímicas como a estabilidade da hemoglobina para detecção de variantes instáveis. Na prática, as provas mais úteis são as que permitem detectar a presença de hemoglobinopatias, como acontece com a hemoglobina S deixando para laboratórios especializados aqueles procedimentos para identificar a mutação. Detectar corretamente os portadores das diferentes hemoglobinopatías visa a dar um conselho genético adequado sobre a forma de herança, o risco de ter filhos afetados com as formas graves da doença e evitar tratamentos desnecessários. O diagnóstico molecular se reserva para a alfa talassemia, para quadros com genótipos complexos, estudos pré-natais ou epidemiológicos.

Palavras-chave: Hemoglobinopatias; Variantes estruturais; Hemoglobina A2; Hemoglobina S; Talassemia.


 

Introducción

Las hemoglobinopatías son trastornos hereditarios debidos a una gran variedad de defectos que afectan a los genes de globina. El defecto genético puede afectar la síntesis en forma cualitativa, alterando la estructura primaria de la cadena de globina o en forma cuantitativa produciendo menor cantidad de cadenas cuya estructura es normal (1). Los cuadros clínicos pueden corresponder a:

1. hemoglobinopatías estructurales con alteración de la estructura primaria de alguna cadena de globina cuya síntesis es normal. Ej.: Hb S, C, D, etc.
2. Síndromes talasémicos con síntesis disminuida de una cadena de globina estructuralmente normal. Ej.: a β, δ, δβ talasemia
3. Hemoglobinopatías talasémicas que presentan los dos defectos, síntesis disminuida de una cadena de globina estructuralmente anormal. Ej.: Hb Lepore, la más frecuente en nuestro medio.

La hemoglobina (Hb) es la proteína más abundante del eritrocito, es un heterodímero doble constituido por dos cadenas a y dos cadenas no a. Las hemoglobinas normales del adulto son: Hb A (a2 b2), Hb A2 (a2 d2) y Hb F (a2 g2) (2). Como las cadenas a son comunes para las Hbs fetales y adultas, las anormalidades que alteran la síntesis o estructura de dichas cadenas pueden afectar tanto al feto como al adulto, mientras que las alteraciones de las cadenas bsólo se evidencian después de varios meses de vida, coincidiendo con la disminución de síntesis de cadenas g. La síntesis de cadenas dcomienza al final del segundo trimestre de gestación y alcanza su proporción normal al año de vida.
Los síndromes talasémicos figuran entre los trastornos hereditarios más comunes y aunque prevalecen en poblaciones de la cuenca del Mediterráneo, del SE asiático y África, pueden encontrarse en diferentes grupos poblacionales. En Argentina constituyen la forma más frecuente de hemoglobinopatías, lo cual se explica teniendo en cuenta el alto aporte inmigratorio de países de la cuenca del Mediterráneo. La inmigración asiática está introduciendo también nuevos patrones.
Para el estudio de las hemoglobinopatías se debe tener en cuenta no sólo el cuadro clínico y la edad de presentación, sino también los antecedentes familiares y la procedencia geográfica, tanto del paciente como de sus antecesores.
Desde el laboratorio se parte de estudios básicos que se realizan al paciente y su familia procesando paralelamente un control normal. Se recomienda evitar la realización de estas pruebas en un paciente recientemente transfundido, dado que puede conducir a errores diagnósticos.
- Hemograma, valores e índices eritrocitarios
- Morfología de hematíes con observación exhaustiva del frotis de sangre periférica.
- Recuento de reticulocitos
- Cuerpos de Heinz
- Perfil de hierro
- Parámetros de hemólisis, LDH, haptoglobina, bilirrubina total y directa, etc.

Los reticulocitos son glóbulos rojos jóvenes que tienen restos de ácido ribonucleico (ARN) ribosomal que reaccionan con ciertos colorantes básicos como el azul brillante de cresilo o el nuevo azul de metileno para formar gránulos o filamentos azules. Se utiliza sangre con EDTA de extracción reciente incubando dos partes de sangre y una parte de azul brillante de cresilo a 37 °C.
El recuento manual de reticulocitos presenta variabilidad de resultados y es operador-dependiente. Estos inconvenientes son más marcados especialmente para valores bajos. Empleando sistemas de recuento automatizado se puede obviar esta situación. Muchos de los analizadores hematológicos emplean el mismo principio que el método manual y utilizan colorantes básicos supravitales que precipitan y tiñen el ARN y pueden ser reconocidos por absorción o dispersión lumínica. Otros utilizan citofluorometría y cuantifican ARN por intensidad de fluorescencia. Además de brindar el número de reticulocitos en valor absoluto aportan la concentración de hemoglobina intrarreticulocitaria (Ret-He), CHr, como parámetros de utilidad clínica.

Cuerpos de Inclusión

La tinción supravital también se puede utilizar para la búsqueda de cuerpos de inclusión. Se observan luego de la incubación de dos partes de sangre y una parte de azul brillante de cresilo 1% entre 2 -24 h.
Los cuerpos de Heinz son el producto final de la degradación oxidativa de la hemoglobina. Se presentan como precipitados intracelulares y pueden aparecer como cuerpos únicos o múltiples. Pueden ser indicativos de intoxicación por drogas, presencia de hemoglobina inestable, etc.
La hemoglobina H (tetrámero de cadenas β) se desnaturaliza en presencia de azul brillante de cresilo formando cuerpos característicos redondeados (pelota de golf). Se encuentran en porcentaje variable en enfermedad por Hb H (5-50%). En portadores de alfa talasemias más leves los porcentajes suelen ser más bajos 1:1000 a 1:10.000/eritrocitos.
La evaluación de estos parámetros básicos orienta para proceder a realizar las pruebas específicas.

A. SINDROMES TALASÉMICOS
La β talasemia (β-tal) se caracteriza por una síntesis reducida o ausente de cadenas de β globina. Los heterocigotas (talasemia menor) presentan una anemia leve o ausente.

1. Descenso de hematocrito (Hto) y hemoglobina (Hb) con elevación de los eritrocitos y marcado descenso de índices eritrocitarios VCM y HCM
2.
Morfología eritrocitaria: anisocitosis, hipocromía, microcitos ovalocitos, punteado basófilo
3.
Perfil de hierro normal
4.
Electroforesis de hemoglobina a pH alcalino Hb A y A2 con cuantificación de Hb A2 aumentada.

La alfa talasemia (α-tal) presenta síntesis reducida o ausente de cadenas de αglobina. El portador de α-tal tiene generalmente valores e índices eritrocíticos ligeramente por debajo del límite inferior del rango de referencia, perfil de hierro normal y cuantificación de A2 dentro del rango normal. Se realiza una evaluación apropiada de laboratorio pero el diagnóstico preciso depende del estudio molecular.

1. Electroforesis de Hemoglobina
Las moléculas de hemoglobina en solución (HbA, HbA2, HbF y variantes) presentan diferente carga eléctrica a determinado pH según sus grupos ionizables y pueden ser separadas en función de su movilidad. Pueden utilizarse varios soportes y soluciones amortiguadoras con diferente pH según la conveniencia de cada caso (1) (2).

1.1 Electroforesis a pH alcalino
1.1.1 Muestra: Sangre anticoagulada con EDTA es lo más conveniente; también puede utilizarse sangre heparinizada. Lo ideal es sangre fresca y de lo contrario sangre conservada a 4 °C y procesada dentro de la semana; mayores tiempos de almacenamiento pueden llevar a desnaturalización de la hemoglobina y a la presencia de bandas poco definidas (2).

1.1.2 Fundamento
En la práctica diaria el soporte más empleado es el acetato de celulosa a pH 8,6. En medio alcalino la Hb se carga negativamente y migra hacia al ánodo (+). Es una técnica simple, rápida para la detección de las hemoglobinopatías más comunes. Las variantes estructurales que presentan una variación de carga eléctrica a pH alcalino se separan de la Hb A. Las
hemoglobinopatías inestables o con afinidad alterada por el O2 suelen no presentar fracciones anormales porque la mutación no altera la carga eléctrica y presentan igual migración que la HbA. Los hemolizados se preparan lavando los hematíes 3 veces con solución fisiológica para eliminar completamente leucocitos, plaquetas y proteínas plasmáticas. Los hematíes lavados se lisan con igual volumen de agua destilada y la mitad de volumen de tetracloruro de carbono (CCl4), dejándolos a 4 °C durante la noche. Se centrifuga 15 min a 3000 r.p.m, se separa el hemolizado de la capa de estroma y se ajusta la concentración de Hb entre 8-10 g/dL. Realizada la siembra se corre a voltaje constante de 250 mV el tiempo necesario para lograr una buena separación y se colorea con Rojo Ponceau S o Amido Schwartz.

1.1.3 Interpretación
La corrida electroforética de las distintas fracciones de hemoglobina normal sobre acetato de celulosa a pH alcalino permite la localización de tres fracciones bien diferenciadas. La fracción más rápida e intensamente coloreada corresponde a HbA, la segunda fracción corresponde a Hb A2 y una tercera no hemoglobínica, más cercana al punto de siembra, corresponde a la anhidrasa carbónica.
La cuantificación de Hb A2 se puede realizar por elución de la fracción electroforética por densitometría de la tira de acetato transparentizada, por micro columnas de DEAE-celulosa o por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (3) (4). La precisión y la exactitud de las mediciones de Hb A2 mediante densitometría de barrido de geles de electroforesis son pobres, especialmente cuando se compara con las técnicas de HPLC. El porcentaje de Hb A2 se encuentra aumentado en la β-tal menor. Los métodos convencionales para el estudio de las hemoglobinas basados en procedimientos electroforéticos y cromatográficos continúan siendo de utilidad para la detección de hemoglobinopatías estructurales y talasemias en áreas geográficas donde estas causas de anemia presentan cierto grado de prevalencia. A principios de la década de los ochenta se introdujo la HPLC para la separación y cuantificación automatizada de las fracciones hemoglobínicas normales (Hb A, Hb A2 y Hb F), así como también de posibles hemoglobinopatías. Se puede separar y cuantificar no sólo Hb A2 y Hb F, sino cualquier Hb variante (Hb S, C, D-Punjab, E u O-Arab) en la misma corrida. Es un método preciso, sin embargo, presenta algunas desventajas. Se requiere de personal entrenado en la técnica, analistas especializados en la interpretación de los cromatogramas, y además es una metodología de elevado costo. La representación esquemática de las movilidades relativas de algunas hemoglobinas anormales del cátodo al ánodo se muestra en la Fig. 1.


Fig. 1
. Representación esquemática de las movilidades relativas de algunas hemoglobinas anormales del cátodo al ánodo. 

1.2 Electroforesis a pH ácido 6,0-6,2 agar citrato
1.2.1 Fundamento
En el gel de agar intervienen otros factores además de la carga eléctrica, como interacciones fisicoquímicas entre el agar y la molécula de hemoglobina. El gel de agar permite separar fracciones de hemoglobina que a pH alcalino en acetato de celulosa migran en la misma posición como por ej.: S de D y C de E entre otras. La Hb F, al ser más soluble, es la más rápida y se separa bien de la HbA (2) (3).

1.3 Automatización en geles de agarosa
Los geles de agarosa a pH alcalino se utilizan para la separación de hemoglobinas A y Hb A2 y detección de las principales variantes estructurales de la hemoglobina (S, C, D, E, etc.). A pH ácido se utilizan para confirmar la identificación de variantes y en particular para diferenciar Hb S de Hb D y Hb C de Hb E. En cada caso, se deberían seguir las recomendaciones del fabricante.

1.4 Electroforesis capilar
1.4.1 Fundamento
La Electroforesis capilar es una técnica física de separación electrocinética que se desarrolla en un capilar de sílice sobre el que se aplica una diferencia de potencial muy elevada (9800 voltios) entre ambos extremos. En este sistema, las muestras diluidas con una solución buffer y hemolizante, son inyectadas en el ánodo por aspiración. Las diferentes fracciones de hemoglobina son detectadas y cuantificadas por fotometría y densidad óptica, convirtiéndose así en una imagen de migración. La imagen de migración, electroferograma, revela la posición de migración de cada hemoglobina en cada muestra en relación a la posición de la hemoglobina A y A2 que arbitrariamente se miden en el eje X entre 0 y 300 respectivamente. Diferentes picos en el electroferograma son asignados a 15 zonas (Z1 a Z15) y son cuantificados como porcentaje (Fig. 2).


Fig. 2
. Electroferograma en una muestra control comercial, mostrando la Hb A en la zona 9, la Hb F en la zona 7, la Hb S en la zona 5, Hb A2 en zona 3 y Hb C en zona 2.

Ventajas de la electroforesis capilar: es una técnica cuali-cuantitativa, posibilita una medida más exacta de cuantificar la Hb A2 en presencia de la Hb S y Hb D y la cuantificación de la Hb A2 en presencia de la Hb E.
Desventajas: carece de la capacidad de separar en forma completa la Hb A2 de la Hb C; requiere el agregado de un control para evaluar la posición de migración y zonas de una variante de hemoglobina cuando la Hb A o Hb A2 están ausentes.

2. Cuantificación de A2 por cromatografía en micro columna
2.1 Fundamento
Se basa en el intercambio iónico de grupos cargados de la celulosa con los grupos cargados de la molécula de hemoglobina. La mezcla de hemoglobinas presentes en el hemolizado son retenidas por la resina de intercambio aniónico (DEAE) celulosa. La Hb A2 se eluye de forma específica bajo condiciones estrictas de pH y fuerza iónica del buffer de elución. La cuantificación se hace por lectura espectrofotométrica a 415 nm.

2.2 Interpretación
El porcentaje de Hb A2 oscila entre 2,3-3,5% en individuos adultos normales. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus rangos de referencia. El punto de corte estándar en un heterocigota para β-tal es Hb A2 mayor a 3,5%. Valores de Hb A2 dentro del rango normal con índices eritrocitarios disminuidos pueden presentarse en rasgos talasémicos con baja expresividad o lo que es más probable, con coexistencia de ferropenia. En otros trastornos hereditarios como α-tal y δβ-tal, la Hb A2 no está elevada.
La cuantificación de Hb A2 presenta algunos inconvenientes en presencia de otras variantes como la Hb C y Hb S, ya que son eluídas juntas y en esas situaciones se informa porcentaje HbA2+HbC. Existen en el mercado equipos comerciales con buffers diferenciales que permiten cuantificar la Hb A2 y la Hb S (4) (8) (9).

3. Hemoglobina fetal
3.1 Fundamento
Para determinar la cantidad relativa de Hb F (α2γ2) son usados diferentes métodos basados en la resistencia que presenta a la desnaturalización alcalina. Se utiliza una base fuerte que desnaturaliza a las hemoglobinas presentes con excepción de la HbF. La desnaturalización se interrumpe con agregado de sulfato de amonio que disminuye el pH y provoca la precipitación de las hemoglobinas desnaturalizadas. Luego de filtrar se mide espectrofotométricamente la hemoglobina no desnaturalizada y la proporción de HbF se expresa como porcentaje del total de hemoglobina presente (2) (3) (5).
La técnica de Singer consiste en desnaturalización alcalina en un minuto. Es una técnica simple y rápida pero sobrestima valores bajos de HbF. La técnica de Betke convierte el hemolizado en cianmetahemoglobina y aumenta el tiempo de desnaturalización a 2 minutos. Otra metodología utilizada para la cuantificación de HbF es la inmunodifusión radial (IDR). Para niveles
de Hb F bajos a moderados (0,8-25%) son utilizadas las técnicas de desnaturalización alcalina. Niveles de Hb F mayores al 40% son determinados con mayor exactitud por HPLC.

B. HEMOGLOBINOPATÍAS ESTRUCTURALES

- Hemoglobinas S, C, D, E etc.
- Hemoglobinas inestables
- Hemoglobinas M
- Hemoglobinas con afinidad alterada por el O2

Dentro de las variantes estructurales, la Hb S (α2β2 β 6Glu →Val) es la más frecuente en nuestro medio. Los niveles de hemoglobina son normales en los heterocigotas, moderada a severamente disminuidos en los homocigotas y en grado variable en las asociaciones de Hb S con otras hemoglobinopatías. El volumen corpuscular medio (VCM) es normal o ligeramente elevado pero se encuentra disminuido en asociaciones de Hb S y β talasemia, que es la más frecuente en nuestro medio. Además del estudio inicial de laboratorio con hemograma, reticulocitos, cuerpos de Heinz, observación de la morfología eritrocitaria y electroforesis de hemoglobina en diferentes soportes y pH, se realizan:

- Cuantificación de Hb A2
-
Cuantificación de Hb F
-
Cuantificación de Hb anormal
-
Prueba de falciformación (sickling)
-
Prueba de solubilidad de la Hb S
-
Pruebas de estabilidad de la Hb (estabilidad térmica, prueba del isopropanol.

La electroforesis a pH alcalino permite separar hemoglobinas con distinta movilidad electroforética. La Hb S tiene una movilidad intermedia entre HbA y Hb A2. Otras variantes bastante frecuentes tienen a pH alcalino igual movilidad que la Hb S (Hb D, G Phil, Lepore, etc.). No permite separar Hb S de Hb D, ni Hb C de Hb E. La electroforesis en gel de agar citrato a pH ácido es una prueba complementaria que permite separar Hb S de D y Hb C de Hb E.
La solubilidad de la Hb está alterada, tanto en los síndromes con Hb S como en las hemoglobinopatías inestables, debido a la formación de polímeros de hemoglobina (Hb S) y a la desnaturalización de la hemoglobina, formando inclusiones insolubles en forma de cuerpos de Heinz en las hemoglobinas inestables.

4. Prueba de Falciformación
4.1 Fundamento
Las pruebas para la detección de Hb S se basan en la capacidad de dicha hemoglobina de formar polímeros de desoxi-HbS a bajas presiones de oxígeno que deforman al eritrocito adquiriendo la forma característica de hoz (drepanocito). La sangre del paciente se incuba con un agente reductor como el metabisulfito de sodio al 2% preparado en el momento de su uso. Partes iguales de metabisulfito de sodio al 2% y sangre extraída con cualquier anticoagulante se mezclan y se coloca una gota de la mezcla sobre un portaobjetos tapando con un cubreobjetos y sellando los bordes. Luego de 30 min -1 h de incubación a temperatura ambiente se examina al microscopio con objetivo 40X y se observa la formación o ausencia de drepanocitos. Ocasionalmente la prueba puede necesitar hasta 24 h para positivizarse. En ese caso el vidrio debe conservarse en caja de Petri.

4.1.1 Interpretación
La aparición de células falciformes indica presencia de Hb S, pero no permite diferenciar un estado heterocigota de homocigota o doble heterocigota. Otras hemoglobinas menos frecuentes tienen solubilidad reducida y prueba de falciformación positiva (Ej. Hb C-Harlem y Hb S –Travis) pero tienen diferente movilidad electroforética. Otras Hb de igual movilidad que Hb S (Hb D, Hb G) presentan el test de falciformación negativo. Falsos negativos se observan cuando hay bajo número de eritrocitos con Hb S y aumento de Hb Fetal. Las pruebas de drepanoformación inducida por metabisulfito de sodio y/o el descenso de solubilidad con ditionito de sodio (agente reductor) positivas son características de la mutación β 6Glu →Val (1).

5. Pruebas de estabilidad de la Hemoglobina
5.1 Fundamento
Las hemoglobinas inestables no siempre son evidenciables por técnicas electroforéticas. Esto se puede deber a variantes que sufren rápida desnaturalización o con carga eléctrica similar a la Hb A. Por tal motivo, el empleo de pruebas como desnaturalización térmica y estabilidad al isopropanol permiten evidenciar su presencia (2) (3) (6) (7).

5.1.1 Prueba de desnaturalización térmica
Cuando la hemoglobina en solución es sometida al calor, las fuerzas de Van der Waal´s se debilitan y la estabilidad de la molécula decrece. Bajo condiciones controladas las hemoglobinas inestables precipitan mientras las estables permanecen en solución.

5.1.2 Preparación del hemolizado fresco.
• Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución fisiológica. Mezclar una parte de eritrocitos lavados (200 μL) y una parte y media (300 μL) de agua destilada.
• Centrifugar y trabajar con el sobrenadante
• Colocar 2 tubos (paciente y control) con 1,8 mL de buffer Tris-HCl, pH 7,4 y añadir 200 μL de los hemolizados correspondientes.
• Incubar 2 hs a 50 °C y observar la eventual aparición de precipitado.
• Examinar los tubos a los 60, 90 y 120 minutos.

5.1.3 Interpretación
El precipitado se caracteriza por una floculación blanquecina generalmente intensa. La prueba se considera positiva solamente cuando dicho precipitado aparece en el hemolizado problema y no en el tubo control. Esta prueba es más sensible que el isopropanol pero menos especifica.

5.2 Prueba de la estabilidad al isopropanol. Prueba de Carrell y Kay (6).
Debido a su carácter intensamente apolar, el isopropanol debilita las uniones hidrofóbicas de Van der Waal's y la estabilidad de la molécula de hemoglobina disminuye (6).

5.2.1 Preparación del hemolizado fresco.
• Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución fisiológica. Mezclar una parte de eritrocitos lavados (200 μL) y una parte y media (300 μL) de agua destilada.
• Centrifugar y trabajar con el sobrenadante
• Colocar 2 tubos ( paciente y control) con 2 mL de solución buffer Tris pH 7,4 isopropanol 17% V/V y equilibrar a 37 °C 5 minutos
• Añadir 200 μL de hemolizado a su correspondiente tubo
• Incubar a 37 °C 40 minutos
• Observar la aparición de turbidez y fina floculación a los 5, 10, 20 y 30 minutos

5.2.2 Interpretación
La solución del hemolizado permanecerá transparente durante más de 30-40 minutos en ausencia de hemoglobina inestable. Por el contrario, si existe hemoglobina inestable aparecerá floculación entre 5 a 20 minutos. Pueden aparecer falsos positivos en muestras que contengan aumento de Hb F o en muestras almacenadas por tiempo prolongado debido a presencia de metahemoglobina.
Las hemoglobinas M son variantes estructurales en las cuales el hierro se encuentra invariablemente en estado férrico y no puede ser reducido química ni enzimáticamente. Se han descripto variantes de cadenas by a. Presentan un espectro de absorción de hemolizados oxidados que difiere de la metahemoglobina Hb A.
Las hemoglobinas con afinidad alterada por el O2 son variantes estructurales que por diferentes mutaciones determinan cambios en la afinidad de la Hb por el O2. Las que tienen aumento de afinidad por el O2 se manifiestan por eritrocitosis, mientras que las hemoglobinas con baja afinidad por el O2, por cianosis o seudoanemia La electroforesis de Hb no muestra banda anormal en muchos casos. El diagnóstico se basa en los exámenes funcionales de la curva de disociación de O2 (P50) y en el estudio familiar.

C. VARIANTES CON FENOTIPO TALASÉMICO
Hb Lepore, Hb E, Hb Constant Spring
Casos de anemia microcítica hipocrómica con banda anómala en la electroforesis de Hb a pH alcalino puede corresponder a una hemoglobinopatía talasémica. La Hb Lepore presenta migración similar a Hb S a pH alcalino. La Hb E aparece a pH alcalino en posición de HbA2 y de Hb C.

Comentarios

El diagnóstico de las hemoglobinopatías resulta de una combinación de estudios clínicos, pruebas de laboratorio y estudio familiar. Los métodos presentados en esta actualización permiten sólo orientar (salvo excepciones como la Hb S) el diagnóstico de una variante estructural. Las pruebas de mayor utilidad son las que permiten detectar la presencia de una hemoglobinopatía, como ocurre con la hemoglobina S o un portador de beta talasemia, dejando para laboratorios especializados aquellos procedimientos para identificar la mutación. La correcta detección de los portadores de las diferentes hemoglobinopatías tiene como finalidad dar un consejo genético adecuado sobre la forma de herencia, el riesgo de tener hijos afectados con las formas graves de la enfermedad y evitar tratamientos innecesarios. El diagnóstico molecular se reserva para la alfa talasemia, para cuadros con genotipos complejos, estudios prenatales o epidemiológicos.  

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Recibido: 27 de julio de 2016
Aceptado: 2 de marzo de 2017

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