HEMATOLOGÍA

Pruebas bioquímicas para el diagnóstico de anemia megaloblástica*

Biochemical tests for diagnosis of megaloblastic anemias*

Testes bioquímicos para o diagnóstico de anemia megaloblástica

 

Héctor Claudio Merlo¹, Silvia Mónica De Paula²

¹ Bioquímico. Jefe de Laboratorio División Hematología. Hospital General de Agudos Dr. J. M. Ramos Mejía. Subcomisión de Bioquímica y Biología. Sociedad Argentina de Hematología.
² Bioquímica. Laboratorio División Hematología. Hospital General de Agudos Dr. J. M. Ramos Mejía. Subcomisión de Eritropatías. Sociedad Argentina de Hematología.
* Subcomisión de Eritropatías, Sociedad Argentina de Hematología. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

CORRESPONDENCIA Dr. HÉCTOR CLAUDIO MERLO Dra. SILVIA MÓNICA DE PAULA Laboratorio División Hematología Hospital General de Agudos Dr. J. M. Ramos Mejía Gral. Urquiza 609 - C1221ADC CABA, Buenos Aires E-mail: hematologiaramos@gmail.com

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Resumen

Es intención de este trabajo hacer un breve repaso sobre el metabolismo de la Vitamina B₁₂ y del Folato o Vitamina B9. Estas dos vitaminas hidrosolubles juegan un papel importante en el metabolismo celular. Son cofactores de reacciones metabólicas de transferencia de grupos monocarbonados, esenciales para el mantenimiento de la vida. Además se describen las nuevas determinaciones de laboratorio, se evalúan cuáles son los estudios necesarios para arribar a un correcto diagnóstico del paciente con Anemia Macrocítica (AM), su etiología y cómo muchas drogas de uso frecuente en medicina producen AM. Se realiza también la evaluación del conjunto de metodologías que se pueden efectuar como rutina en el laboratorio especializado en hematología y se propone un algoritmo para el diagnóstico del paciente con AM.

Palabras clave: Anemia megaloblástica; Deficiencia de vitamina B₁₂; Deficiencia folato; Algoritmo de anemia macrocítica; Pruebas de laboratorio.

Abstract

The aim of this article is to make a little review on Vitamin B₁₂ and Folate or Vitamin B9 metabolism. These hydrosoluble vitamins have a very important role in cell metabolism. They are cofactors in metabolic reactions of methyl group transfer, essential for life maintaining. Furthermore, new laboratory tests are described, and it is evaluated which the necessary studies are to arrive at a correct diagnosis for macrocytic anemia (MA) patients, their etiology, and how many drugs frequently used in medicine originate MA. Also, the set of methodologies that can be carried out routinely in the laboratory specialized in hematology is evaluated. Finally, a diagnosis algorithm to detect MA in patients is proposed.

Keywords: Megaloblastic anemia; B₁₂ deficiency; Folate deficiency; Macrocitic anemia algorithm; Laboratory tests.

Resumo

Este trabalho visa a realizar uma breve revisão sobre o metabolismo da Vitamina B₁₂ e do Folato ou Vitamina B9. Estas duas vitaminas hidrossolúveis têm um papel importante no metabolismo celular. São cofatores de reações metabólicas de transferência de grupos monocarbonados, essenciais para manter a vida. Também são descritas novas determinações de laboratório, avaliam-se quais são os estudos necessários para chegar a um diagnóstico correto do paciente com Anemia Macrocítica (AM), sua etiologia e de qué maneira muitas drogas de uso frequente em medicina produzem AM. Realiza-se também a avaliação do conjunto de metodologias que podem realizar-se como rotina no laboratório especializado em hematologia e se propõe um algoritmo para o diagnóstico do paciente com AM.

Palavras-chave: Anemia megaloblástica; Deficiência de vitamina B₁₂; Deficiência de folato; Algoritmo de anemia macrocítica; Testes de laboratório.

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Introducción

TRANSPORTE DE FOLATOS
El ácido fólico o vitamina B9 es una vitamina hidrosoluble que resulta de la unión del ácido pteroico y de una o más moléculas de ácido L-glutámico; su forma activa es el tetrahidrofolato (THF). Se encuentra en alimentos de origen vegetal (frutas, verduras, legumbres) o animal (hígado, riñón).
Los folatos y el ácido fólico (AF) se absorben en el duodeno y yeyuno; los poliglutamatos son hidrolizados por la glutamato carboxipeptidasa II del ribete estriado. Su absorción (mecanismo de transporte activo, saturable y pH dependiente) es mediada por el portador de folatos reducido (RFC) que funciona a pH neutro (codificado por el cromosoma 21) y el transportador de folato acoplado a protones (PCFT) que actúa a pH ácido (codificado por el cromosoma 17).
Una vez dentro de la célula la folil poliglutamato sintetasa adiciona residuos glutamato al C-terminal, aumenta su tamaño y evita su salida por las bombas exportadoras de folato. Luego es reducido y metilado a 5-metil-tetrahidrofolato (5-MTHF) que cruza la membrana basolateral del enterocito por un mecanismo de intercambio aniónico activo y entra a la circulación portal.
La membrana basolateral del hígado muestra también la característica de un proceso mediado dependiente del sodio; en el hepatocito es convertido en poliglutamato por acción de folilpoli-g-glutamato sintetasa que puede adicionar hasta 8 residuos glutamato.
La folilpoli-g-glutamato carboxipeptidasa los transformará en monoglutamatos secretados en la bilis y reabsorbidos en el intestino delgado.
El riñón participa de la homeostasis dado que el folato filtrado es reabsorbido en el nefrón, que contiene receptores de folato (FR) en las células del túbulo proximal.
Los FR son una familia de receptores de alta afinidad codificados por 3 genes alfa, beta y gamma localizados en el cromosoma 11. Las alfa y las beta son glicosilfosfatidilinositol proteínas de anclaje y la gamma es secretoria.
La absorción de folato en el citosol por los FR implicaría un proceso de endocitosis ⁽¹⁾.

TRANSPORTE DE VITAMINA B12
La vitamina B12 o Cobalamina, también hidrosoluble, resulta de la unión asimétrica de cuatro anillos pirrólicos (anillo de corrina) en torno a un átomo central de cobalto sobre el que se efectuarán procesos de óxido-reducción que conducirán del Co (3+) a Co (1+) (2) (Figura 2).

Figura 1. Ácido fólico.

Figura 2. Fórmula química de la Vitamina B12.

Mínimas dosis son necesarias para el organismo. La cadena nutricional comienza con la producción por las bacterias en el tracto intestinal de los herbívoros, la acumulación en sus tejidos y el consumo de productos de origen animal dado que el hombre no puede sintetizarla.
La hidroxicobalamina y la cianocobalamina proveniente de los alimentos serán transformadas en metil- y desoxiadenosilcobalamina.
La vitamina B12 es captada por la Haptocorrina, de origen salival, que la protege de la hidrólisis en medio ácido. En el duodeno la Haptocorrina es degradada por las enzimas pancreáticas y la B12 es captada por el Factor Intrínseco (FI) producido por las células parietales; este complejo es absorbido por endocitosis mediada por el receptor Cubilina–AMN.
La cubilina es una proteína de membrana que se une a FI-B12 y AMN es una proteína transmembrana con actividad endocítica.
El FI es degradado por proteasas lisosomales y la B12 retorna al citoplasma por medio de la proteína LMBD, puede permanecer dentro de la célula o ser exportada por el MRP1, transportador basolateral de la célula ileal.
Una vez transportada al plasma circula unida a la Transcobalamina II, la cual puede ser captada por el receptor CD320 en el hígado y demás órganos.
En riñón la recaptura de holotranscobalamina se produce por el receptor Megalina ⁽³⁾.
La B12 es cofactor para dos enzimas: la metionina sintetasa (citoplasmática) y la metilmalonilCoA mutasa (mitocondrial) que cataliza el pasaje de metilmalonilCoA a succinilCoA, metabolito del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
El déficit de B12 reduce la actividad de la metilmalonilCoA mutasa produciendo la acumulación de metilmalonilCoA y ácido metilmalónico (MMA).
La B12 es cofactor de la metionina sintetasa que cataliza la remetilación de la homocisteína a metionina, precursor de la S-adenosilmetionina (SAM), donador de grupos metilo necesarios para la metilación de fosfolípidos, neurotransmisores, aminas, ADN, ARN y proteínas básicas de mielina; en la depleción de B12 se inactiva la metionina sintetasa con importante reducción de las reacciones de metilación, y la homocisteína aumenta ⁽⁴⁾⁽⁵⁾.
La deficiencia de B12 o de folatos se traduce en una anemia megaloblástica resultante en una síntesis alterada de ADN. Ambas vitaminas están intrínsecamente ligadas a la vía de la metionin sintetasa que es la única enzima que usa al 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) y lo convierte en su forma metabólicamente activa, el tetrahidrofolato (THF) necesario en el metabolismo de un átomo de carbono.
En la deficiencia de B12 la actividad de la metionin sintetasa se reduce y se bloquea la formación de THF; el folato queda atrapado como 5-MTHF, que es una forma que no puede utilizarse, dado que el pasaje de 5,10-MTHF a 5-MTHF catalizado por la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) es irreversible.

TRAMPA DE FOLATOS
La SAM es inhibidor alostérico de la MTHFR; en el déficit de B12 la SAM disminuye, por lo que se elimina la inhibición de MTHFR promoviendo la reducción de 5,10-MTHF a 5-MTHF de modo que se utilice para resintetizar metionina y se produce más acumulación de folatos como 5-MTHF.
Las células sufren de una pseudo-deficiencia de folatos dado que no está en su forma activa, de manera que se interrumpe la producción de purinas y pirimidinas necesarias para la síntesis de ADN.
El 5-MTHF no es sustrato de elección para la folilglutamato sintetasa, enzima responsable de la retención celular de folato. Se han reportado bajas concentraciones de folato intraeritrocitario en deficiencia de B12 ⁽⁵⁾.
El 5-MTHF puede atravesar la barrera hematoencefálica, lo que permite el mantenimiento de la mielina.
El defecto en la síntesis de ADN compromete a todas las células del organismo con capacidad proliferativa.
La anemia megaloblástica es la manifestación de esta anomalía en la síntesis de ADN; se activa la apoptosis que causará una eritropoyesis ineficaz y se acorta la sobrevida de los glóbulos rojos (Figura 3).

Figura 3. Ciclo metabólico de Folatos y Vitamina B12

EVALUACIÓN DE LAS ANEMIAS MACROCÍTICAS EN EL LABORATORIO
Las anemias macrocíticas (AM) generalmente definidas por un Volumen Corpuscular Medio (VCM) >100 fL, se pueden clasificar en dos subtipos: las megaloblásticas (AM-Me) y las no megaloblásticas (AM-NoMe).
Dentro de las causas comunes de anemia macrocítica megaloblástica se encuentra la deficiencia de Vitamina B12 (B12) y Folato (Fol), mientras que para la anemia macrocítica no megaloblástica, la causa más frecuente es un aumento de los reticulocitos (Ret) o el consumo crónico de alcohol ^{(6) (7)}. Se debe tener en cuenta también la edad de los pacientes, ya que los valores de B12 y Fol están disminuidos, y los del Ácido Metilmalónico (AMM) y de la Homocisteína total (HCT) están aumentados en adultos mayores de 60 años ⁽⁷⁾.

CAUSAS DE ANEMIA MEGALOBLÁSTICA
Fuera de las deficiencias de B12 y Fol, existen varias causas de AM-Me, entre las que se encuentran la inadecuada secreción de Factor Intrínseco (FI), alteraciones en la liberación de B12 del complejo B12–Receptor, malabsorción por anormalidades del íleo terminal (para B12) o del yeyuno (para Fol) y anormalidades hereditarias o adquiridas en los metabolismos de B12 y Fol ⁽⁷⁾
Además, existe una gran cantidad de drogas de uso frecuente en medicina que interfieren con la absorción o distribución de Fol, como agentes anticonvulsivantes (fenobarbital, fenitoína, etc.), anticonceptivos (estrógenos), antimaláricos (quinina, etc.) y antibióticos (ampicilina, tetraciclinas, etc.) ⁽⁸⁾. Hay drogas que interfieren con el metabolismo de Fol, conocidas generalmente como análogos de folato, que se utilizan en el tratamiento de enfermedades oncológicas, ya sea de tumores sólidos o leucemias (metotrexato, hidroxiurea, mercaptopurina, etc.) ⁽⁸⁾. También hay drogas que disminuyen la absorción de B12: antituberculosos y antibióticos (ácido aminosalicílico, isoniacida, neomicina, etc.), hipoglucemiantes orales (metformina); drogas que aumentan la excreción de B12: antihipertensivos (nitroprusiato de sodio) y las que destruyen B12: antihipertensivos (óxido nítrico) ⁽⁸⁾. Algunos de estos compuestos son conocidos también como antivitaminas, su uso está muy difundido en medicina sobre todo con antagonistas de Fol como el metotrexato y vitamina K (anticoagulantes orales), sin embargo, está aún en las primeras fases de investigación para antagonistas de B12 ⁽⁹⁾.

OTRAS CAUSAS DE ANEMIA MACROCÍTICA NO MEGALOBLÁSTICA
Como se mencionó más arriba, las causas más frecuentes de AM-NoMe son el abuso crónico de alcohol (con o sin enfermedad hepática) y los cuadros hemolíticos o pérdidas abundantes de sangre, que producen reticulocitosis, como así también la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Dentro de otras causas se pueden distinguir la enfermedad hepática (cirrosis y patología hepática aguda), el hipotiroidismo, mielodisplasias como el síndrome 5q-, anemia diseritropoyética congénita tipo I (CDA I), anemia aplástica, síndrome de Diamond-Blackfand y anemia de Fanconi ⁽⁶⁾. Existen también, al igual que en el caso de las AM-Me, drogas que producen por distintos mecanismos una anemia macrocítica, como ser las que interfieren en el metabolismo de purinas y/o pirimidinas, con la consiguiente disminución en la síntesis de ADN, por lo general utilizadas en el tratamiento de patologías oncológicas (mercaptopurina, fludarabina, etc.), antigotosos (allopurinol), inmunomoduladores usados en trasplante de órganos y procesos inflamatorios como artritis reumatoidea y artritis psoriásica (azatioprina, leflunomida, etc.) (8). Existen, además, drogas que producen macrocitosis por mecanismos complejos o desconocidos, como algunos antineoplásicos (asparaginasa, arsénico, etc.) (8) y antirretrovirales de uso frecuente en el tratamiento de pacientes HIV positivos ⁽⁷⁾.

ESTUDIOS BIOQUÍMICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ANEMIAS MACROCÍTICAS
Lo primero es realizar una observación minuciosa de un buen extendido de sangre periférica, ya que de observar policromatofilia, generalmente asociada a presencia de un número aumentado de Ret, estaría indicando un aumento en la actividad eritroide de la médula y orientaría a pensar en un aumento de la producción debido a pérdida de sangre o anemia hemolítica. Por otro lado, la presencia de neutrófilos hipersegmentados, definida generalmente como la presencia de >5% de neutrófilos con cinco o más lóbulos, ya sea con o sin la presencia de macro ovalocitos, orientaría a una megaloblastosis ^{(6) (10)}.

DETERMINACIÓN DEL ESTADO DE VITAMINA B12
Los métodos actuales para determinar la concentración de B12 en suero brindan, según los fabricantes, una sensibilidad del 95–97%, pero los valores normales de B12 no excluyen una deficiencia. Por este motivo, es importante realizar también la determinación los metabolitos relacionados como ácido metilmalónico (AMM) y homocisteína total (HCT) los cuales están aumentados, tempranamente, en la deficiencia de B12 ^{(6) (7) (10)}.
La determinación de AMM tiene varias desventajas, ya que se trata de un estudio caro, por lo que no está muy difundido y además, por lo general, tiene una demora importante en la devolución de resultados ^{(7) (10)}. Esto se debe a que el método de determinación comprende técnicas de separación por Cromatografía Gaseosa y cuantificación por Espectrometría de Masa (CG-EM) ^(10-12). Se puede utilizar además una técnica de Cromatografía Líquida y cuantificación por espectrometría de masa en tandem (CL-EM/EM), la cual según sus desarrolladores, tiene muy buena correlación con la CG-EM en cuanto a los resultados obtenidos, con CV% intra e inter ensayo menores, de 3,8-8,5% para CG-EM y 1,3-3,4% para CL-EM/EM, pero a diferencia de ésta, tiene una reducción importante en los costos (59% menos) y en el tiempo de procesamiento (75% menor), ya que tiene un tiempo de corrida de 7,5 h contra las 30 h de la CG-EM. Por este motivo sus desarrolladores consideran que puede ser automatizable para más de 100 muestras/día ⁽¹³⁾.
Con respecto a la determinación de HCT, tiene la desventaja de estar aumentada tanto en la deficiencia de B12 como en la de Fol, por lo que pierde especificidad ^{(7) (10)}.
En los últimos años se ha estado investigando la incorporación de la determinación de B12 intra-eritrocitaria, que junto con el Fol intra-eritrocitario, evalúan los depósitos de dichas vitaminas, ya que éstas se incorporan al glóbulo rojo durante su formación en los precursores de médula ósea y mantienen su concentración durante los 120 días de vida media del eritrocito, disminuyendo por consiguiente a los pocos meses de deficiencia de estos compuestos ⁽¹⁴⁾. Esta técnica no está muy difundida, ya que se trata de una técnica experimental de radioensayo de inhibición competitiva ⁽¹⁵⁾ y actualmente existe un reactivo comercial de ICN Pharmaceuticals Inc. para la determinación cuantitativa simultánea de Vitamina B12 [57Co] y Folato [125I] en suero y plasma. Este reactivo sirve además para la determinación de Fol intra-eritrocitario, pero no se describe en el inserto del mismo la determinación de B12 intra-eritrocitaria ⁽¹⁶⁾.
La Holotranscobalamina (HoloTC) es la fracción activa de B12 y puede ser más específica que los niveles de B12 sérica para determinar el estado de deficiencia de B12. Existe en la actualidad un test inmunológico comercial para su determinación, el cual fue planteado como un probable gold-standard frente a la determinación de AMM, ya que no se necesita ninguna preparación previa de la muestra ⁽¹⁰⁾. Esta técnica se basa en un ensayo inmunológico de captura por anticuerpos monoclonales ⁽¹⁷⁾. Sin embargo, el uso de este kit comercial está cuestionado, ya que según algunos autores se basa en modelos erróneos. Ellos plantean principalmente que el modelo de Herbert, en el cual se basa la afirmación que la HoloTC sería un indicador precoz de la deficiencia de B12, no considera cómo el reciclado entero-hepático de B12, regula la concentración de HoloTC. En función de esto, la HoloTC sólo sería un indicador temprano de deficiencia de B12 en los casos en que dicha deficiencia se debiera a una interrupción del ciclo entero-hepático. De otra manera, existiría un período de “depleción” en el cual la B12 total caería, mientras que la HoloTC permanecería dentro de valores normales hasta que los depósitos hepáticos se agoten ⁽¹⁸⁾.
En este punto es importante destacar que ante la ausencia de un VCM elevado y la presencia de patología neurológica, no se puede excluir la evaluación de una deficiencia de B12 ya que se ha observado que aproximadamente el 25% de los casos presentan VCM normal ⁽¹⁰⁾.

ESTUDIOS PARA DETERMINAR LA ETIOLOGÍA DE LA DEFICIENCIA DE COBALAMINA
Una vez certificada la deficiencia de B12 es importante realizar estudios para determinar la etiología de la anemia. Esto se debe a que se hace imprescindible el diagnóstico de Anemia Perniciosa (AP).
La AP es una enfermedad autoinmune, que puede coexistir con otras como la enfermedad de Hashimoto, la diabetes tipo I, el vitiligo y el hipoadrenalismo.
Es común encontrar en estudios de autoinmunidad para varias endocrinopatías, anticuerpos asociados a AP ⁽¹⁰⁾.

ANTICUERPOS ANTI FACTOR INTRÍNSECO
La AP se caracteriza por la presencia de Anticuerpos Anti Factor Intrínseco (AcFI).
Este estudio tiene un alto valor predictivo positivo, ya que están presentes en el 95% de los pacientes con AP, mientras que presenta un bajo nivel de falsos positivos de entre 1–2%, sin embargo tiene una baja sensibilidad ya que están presentes solo en el 40–60% de los pacientes con AP; por lo tanto, este estudio, de ser negativo, no permite descartar el diagnóstico.
Se debe tener en cuenta, además, que la tasa de positividad aumenta con la edad y también en determinados grupos raciales, como los latinoamericanos y los afroamericanos y que, además altos títulos de AcFI pueden interferir dando resultados normales de B12 en suero, por lo cual este estudio está absolutamente indicado en aquellos pacientes con resultados de B12 normal, con presencia de AM y síntomas neurológicos. Asimismo, con técnicas de quimio-luminiscencia, se pueden dar falsos positivos en pacientes que hayan recibido recientemente tratamiento con cobalamina inyectable ⁽¹⁰⁾.

ANTICUERPOS ANTI CÉLULAS PARIETALES GÁSTRICAS
Si bien los Anticuerpos anti Células Parietales Gástricas (AcCPG) tienen una baja especificidad para AP, con el progreso de la enfermedad pueden hacerse positivos en el 80% de los pacientes; además, presentan una baja tasa de falsos positivos que se reporta en un 10% de personas normales.
Estos anticuerpos son los responsables de causar Aclorhidria Gástrica y los pacientes pueden progresar a AP ⁽¹⁰⁾.

DETERMINACIÓN DEL ESTADO DE FOLATO
El término Folato se refiere tanto a las diferentes formas biológicamente activas de la vitamina, como al Ácido Fólico, que es la forma sintética usada en la suplementación de alimentos y para el tratamiento médico.
Ambos tipos son absorbidos en la zona proximal del intestino delgado (yeyuno) y, aproximadamente el 50% del Fol corporal se encuentra en el hígado.
Si bien la biodisponibilidad de ambas formas es buena, la absorción del Fol dietario está influenciada por varios factores en el lumen intestinal, como así también es vulnerable a degradación por el proceso de cocción de los alimentos. Existe consenso en que la biodisponibilidad del Fol alimentario es 50% menor que la del ácido fólico.
Una baja ingesta de Fol lleva a bajos niveles de Fol en sangre lo que conduce a bajas concentraciones en los tejidos. Sabiendo que el Fol es esencial para la síntesis de ADN, la deficiencia temprana se ve reflejada en los tejidos de rápida proliferación, como la médula ósea y el tracto gastro-intestinal, mientras que la deficiencia severa, puede llevar a pancitopenia y AM ⁽¹⁰⁾.
Las técnicas para evaluar el estado deficitario de Fol deberían incluir las determinaciones de Fol sérico e intra-eritrocitario. Los resultados obtenidos van a depender del método de determinación utilizado y pueden surgir de las diferencias en las técnicas de preparación de los hemolizados. La especificidad de resultados bajos de Fol intra-eritrocitario está discutida, ya que más del 60% de pacientes con deficiencia de B12 presentan valores disminuidos de Fol intra-eritrocitario, de modo que se hace indispensable realizar la determinación de B12 sérica junto con Fol sérico e intra-eritrocitario, por lo que la deficiencia de Fol se asume sólo cuando se encuentran valores normales de B12 sérica ^{(6) (7)}. Se debe tener en cuenta además, que el resultado de Fol sérico se ve influenciado por la ingesta reciente de ácido fólico, por lo que pueden verse resultados falsamente negativos en pacientes con deficiencia de Fol.
En función de lo expresado hasta aquí, puede proponerse un algoritmo para el estudio de pacientes con AM, de acuerdo con el propuesto por Green et al que se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Algoritmo para la evaluación de pacientes con AM. Adaptado de Green R y Dwyre DM. Sem Hem 2015 Oct; 52 (4): 279-86

EVALUACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DETERMINACIÓN UTILIZADOS EN EL LABORATORIO
Las dos metodologías más utilizadas en nuestro medio son: Inmunoensayo Magnético Quimioluminiscente de Micropartículas (CMIA) de Abbott Diagnostic-Architect y el Enzimo Inmunoensayo Quimioluminiscente competitivo de Siemens HealthCare-Immulite.

Vitamina B12
Architect:
Las muestras no necesitan preparación previa y las muestras hemolizadas deben ser descartadas. El tiempo de reacción es de aproximadamente 40 min.

Precisión y Exactitud
El fabricante realizó estudios de imprecisión durante 20 días basados en el protocolo EP5-A2 del CLSI. Se trabajó con 3 lotes de reactivo, 2 lotes de calibradores y 1 panel de sueros, en 2 equipos diferentes. En este estudio se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla I.

Tabla I. Datos del estudio de imprecisión para la determinación de Vitamina B12

Para determinar exactitud, se realizó un estudio respecto al patrón internacional de OMS 03/178, obteniendo una diferencia de -3,6% respecto al valor esperado.
Las concentraciones máximas de interferentes que mostraron una interferencia menor al 10% son las siguientes:
Bilirrubina hasta 25,1 mg/dL
Proteínas hasta 12 g/dL
Triglicéridos hasta 3.325 mg/dL

Immulite:
En este caso se trata de un ensayo competitivo en fase sólida.
Las muestras se deben desnaturalizar calentando a 100 °C durante 15 a 20 min y luego un enfriamiento de 5 min antes de ser procesadas. El análisis se completa con una corrida de 2 ciclos de 30 min cada uno.

Precisión y Exactitud
El fabricante realiza un estudio de precisión intra-ensayos con 15 replicados de 5 soluciones en una sola tanda. Además, hace precisión inter-ensayos con muestras analizadas en 10 tomas distintas de 3 soluciones. Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas II y III.

Tabla II. Resultados de los estudios de precisión intra-ensayo.

Tabla III. Resultados de los estudios de precisión inter-ensayo.

Se realiza además un estudio de exactitud como recuperación con 4 soluciones de distinta concentración dando porcentajes de recuperación entre 93–115% expresado en % de observado/esperado.
Las concentraciones máximas de interferentes que mostraron una interferencia menor al 10% son:
Bilirrubina hasta 20 mg/dL
Hemoglobina hasta 3,81 g/dL
Triglicéridos hasta 3000 mg/dL

Folato sérico y folato intra eritrocitario
Architect:
Las muestras para determinar Fol sérico no necesitan ninguna preparación previa y las muestras hemolizadas deben ser descartadas. El tiempo de reacción es de aproximadamente 40 min.

Precisión y Exactitud
El fabricante realiza un estudio de imprecisión con el siguiente esquema: usa 3 paneles de suero (S1, S2, S3) en un instrumento, 3 replicados en dos tiempos diferentes durante 20 días con 2 lotes de reactivo. De este estudio se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla IV.

Tabla IV. Datos del estudio de imprecisión para la determinación de Folato sérico.

Las concentraciones máximas de interferentes que mostraron una interferencia menor al 10% son las siguientes:
Bilirrubina hasta 20 mg/dL
Proteínas hasta 12 g/dL
Triglicéridos hasta 3.000 mg/dL
Las muestras para determinar Fol intra-eritrocitario requieren 90 min de incubación del hemolizado a temperatura ambiente.

Precisión y Exactitud
El fabricante realizó el mismo esquema que para el Fol sérico, pero con 3 hemolizados (H1, H2, H3) obteniéndose los resultados mostrados en la Tabla V.

Tabla V. Resultados de los estudios de precisión intra e inter-ensayo.

Realizan también un estudio de exactitud con estándar internacional de OMS 03/178, obteniendo un porcentaje de diferencia entre -0,6–1,3% en un intervalo de confianza de 95% y realizan estudio de reactividad cruzada con 3 sustancias interferentes, obteniéndose resultados de reactividad cruzada entre -0,6–2,1%.

Immulite:
Se trata de un ensayo competitivo en fase líquida.
Las muestras para la determinación en suero se deben desnaturalizar calentando a 100 °C entre 15 a 20 min y luego un enfriamiento por 5 min.
El ensayo se completa con 2 ciclos de 30 min cada uno.

Precisión y Exactitud
El fabricante realiza estudios de precisión intra-ensayo haciendo 20 replicados de 3 soluciones de diferente concentración en una sola tanda y precisión inter-ensayo de 20 tomas distintas de 3 soluciones. Los resultados obtenidos pueden verse en las Tablas VI y VII.

Tabla VI. Resultados del estudio de precisión intra-ensayo para la determinación de Folato sérico.

Tabla VII. Resultados del estudio de precisión inter-ensayo para la determinación de Folato sérico.

Se realiza además un estudio de exactitud como recuperación con 3 soluciones de distinta concentración dando porcentajes de recuperación entre 96–119% expresado en % de observado/esperado.
La única interferencia es la bilirrubina y la concentración máxima que mostró una interferencia menor al 10% es la siguiente:
Bilirrubina hasta 20 mg/dL.

Para la determinación de Fol intra-eritrocitario se debe incubar el hemolizado 90 min a temperatura ambiente.
El fabricante no informa el estudio de precisión para esta determinación.

HOMOCISTEÍNA
Architect:
Las muestras para la determinación de HCT no necesitan ninguna preparación previa.
El tiempo de reacción es de aproximadamente 30 min.

Precisión y Exactitud
El fabricante realiza un estudio basado en el protocolo descrito en la guía EP5-A2 por el CLSI. Se analizaron por duplicado 3 controles y 5 muestras de plasma humano utilizando 2 lotes de reactivos, 2 veces al día durante 20 días, con 2 analizadores. Se generó una curva de calibración nueva para cada lote de reactivos cada día del análisis, Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla VIII.

Tabla VIII. Resultados del estudio de precisión intra-ensayo para la determinación de homocisteína sérica.

Las concentraciones máximas de interferentes que mostraron una interferencia menor al 10% son:
Bilirrubina hasta 20 mg/dL
Hemoglobina hasta 1 g/dL
Proteínas menores de 3 g/dL y mayores de 12g/dL
Triglicéridos hasta 6000 mg/dL

Immulite:
Se trata de un ensayo competitivo de fase sólida.
El pretratamiento lo realiza el instrumento y dura 30 min. El ensayo se completa con un ciclo de 30 min.

Precisión y Exactitud
El fabricante realiza estudios de precisión intra-ensayos procesando 4 muestras por cuadruplicado en 20 tandas, obteniendo los resultados mostrados en la Tabla IX.

Tabla IX. Resultados del estudio de precisión intra-ensayo para la determinación de homocisteína sérica.

Se realiza además un estudio de exactitud como recuperación con 3 soluciones de distinta concentración dando porcentajes de recuperación entre 85–108% expresado en % de observado/esperado.
Las concentraciones máximas de interferentes que mostraron una interferencia menor al 10% son:
Bilirrubina hasta 20 mg/dL
Hemoglobina hasta 5,12 g/dL
Triglicéridos hasta 3000 mg/dL

Holotranscobalamina
Como ya se mencionó, la HoloTC es la fracción metabólicamente activa de la B12 y reflejaría mejor y en forma más temprana la deficiencia de esta vitamina. En la actualidad existe un reactivo comercial para su determinación con el sistema Architect–Abbott.
Las muestras para este ensayo no requieren preparación previa y el tiempo de reacción es de 30 min.

Precisión y Exactitud
El fabricante realiza un estudio basado en el protocolo descrito en la guía EP5-A2 por el NCCLS. Se analizaron 2 controles de diferente concentración y 5 muestras de suero humano, utilizando 2 lotes de reactivos, calibradores y controles, 2 replicados, 2 veces al día durante 20 días, con 2 analizadores. Se utilizó una curva de calibración única para cada lote de reactivos durante todo el estudio, Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla X.

Tabla X. Resultados del estudio de precisión intra-ensayo para la determinación de HoloTC en suero.

Las concentraciones máximas de los interferentes que mostraron una interferencia menor al 10% son:
Bilirrubina: 20 mg/dL
Hemoglobina: 200 mg/dL
Proteínas Totales: 10 g/dL
Triglcéridos: 850 mg/dL
Factor Reumatoideo: 70 UI/mL

Immulite:
Esta plataforma no cuenta con reactivos para la determinación de este analito.

Conclusiones

Como se puede observar, en los análisis de precisión y exactitud realizados por los fabricantes, no se ven grandes diferencias entre las dos metodologías utilizadas. La mayor dificultad radica en que los ensayos en plataforma Immulite requieren más trabajo manual y eventualmente, son de más larga duración. Por lo tanto, la elección de la metodología a utilizar dependerá sólo de las posibilidades de adquisición de equipamiento y reactivos por parte de la institución a la que pertenezca cada usuario.
En lo que se refiere al kit de ICN Diagnostic (Kit de RadioensayoSimulTRAC-S) para la determinación simultanea de B12 y Folato, cabe destacar que ninguno de los autores tiene experiencia en el uso del mismo, pero por lo que se deduce del inserto, resulta una técnica muy laboriosa, larga (tiempos de preparación de las muestras), con mucho y minucioso trabajo manual.

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Recibido: 30 de julio de 2016
Aceptado: 15 de julio de 2017