BIOQUÍMICA CLÍNICA

Estudio comparativo de la determinación de vitamina D por dos inmunoensayos*

Comparative study of the determination of vitamin D by two immunoassays

Estudo comparativo da determinação de vitamina D por dois imunoensaios

 

Francisco Javier Valero Chávez^1a, Luis Miguel Luengo Pérez^2b, Socorro Alejo González^1c, Rafael Bravo Santos^3d, Javier Cubero Juánez^3e

¹ Facultativo Especialista en Análisis Clínicos.
² Facultativo Especialista en Endocrinología y Nutrición.
³ Doctor en Biología.
^a Servicio de Análisis Clínicos. Complejo Hospitalario Universitario de Badajoz.
^b Unidad de Nutrición. Complejo Hospitalario Universitario de Badajoz.
^c Unidad de Hormonas. Complejo Hospitalario Universitario de Badajoz.
^d Laboratorio de Chrononutrition. Departamento de Fisiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Extremadura.
^e Laboratorio de Educación para la Salud. Área de Educación Científica. Universidad de Extremadura.
* Estudio realizado en el Servicio de Análisis Clínicos del Complejo Hospitalario Universitario de Badajoz (España).

CORRESPONDENCIA Dr. FRANCISCO JAVIER VALERO CHÁVEZ Servicio de Análisis Clínicos Complejo Hospitalario Universitario de Badajoz Avda. de Elvas s/n (06006) BADAJOZ (España) E-mail: fjvalerochavez@hotmail.com

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Resumen

La vitamina D es un metabolito que tiene gran importancia en la actualidad, debido al descubrimiento de nuevas funciones. La mejor manera de medir los niveles de vitamina D en el organismo es medir los niveles de 25(OH)vitamina D, pero hoy en día no existe estandarización entre métodos y, por lo tanto, existe gran variabilidad entre ellos. En los laboratorios clínicos los métodos más utilizados son los inmunoensayos y sólo ADVIA Centaur Vitamina D Total assay e IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D pasaron la primera fase del Vitamin D Standardization Certification Program (VDSCP) diseñado por el Centre for Diseases Control (CDC). En este estudio se compararon estos 2 inmunoensayos, pero a pesar de haber pasado la primera fase del VDSCP los resultados reflejaron que sigue existiendo variabilidad entre métodos y, por lo tanto, no son intercambiables, siendo necesario definir valores de referencia para cada método a la espera que el proceso de estandarización termine y exista buena correlación entre los diferentes métodos.

Palabras clave: Vitamina D; Inmunoensayo; Comparación; Interferencias; Variabilidad.

Abstract

Currently, Vitamin D is a highly important metabolite as a result of the discovery of its new functions. The best way to measure the levels of vitamin D in the body is by measuring the levels of 25(OH)vitamin D, but currently there is no standardization between methods and therefore there is a great variability between them. In clinical laboratories, immunoassays are the most used methods, and only ADVIA Centaur Vitamin D Total assay© and IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D©passed the first phase of the VDSCP designed by the CDC. In this research study, these 2 immunoassays were compared, and although both passed the first phase of the VDSCP, the results showed that there still exists variability between methods. Therefore, they are not interchangeable, being it necessary to define some reference values for each method until the standardization method is finishe, and there is a good correlation between methods.

Keywords: Vitamina D; Immunoassay; Comparison; Interferences; Variability.

Resumo

A vitamina D é um metabólito que tem muita importância na atualidade, devido ao achado de novas funções. A melhor maneira de medir os níveis de vitamina D no organismo é medir os níveis de 25(OH)vitamina D, mas hoje em dia não existe padronização entre métodos e, por isso, existe uma grande variabilidade entre eles. Nos laboratórios clínicos, os métodos mais utilizados são os imunoensaios e só a ADVIA Centaur Vitamina D Total assay e IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D, passaram a primeira fase do Vitamin D Standardization Certification Program (VDSCP) desenhado pelo Centre for diseases control (CDC). No estudo foram comparados esses dois imunoensaios, porém, apesar de ter passado a primeira fase do VDSCP os resultados mostraram que continua existindo variabilidade entre métodos e, por isso, não são intercambiáveis, sendo necessário definir valores de referência para cada método à espera de que o processo de padronização finalize, e exista boa correlação entre os diferentes métodos.

Palavras-chave: Vitamina D; Imunoensaio; Comparação; Interferências; Variabilidade.

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Introducción

La vitamina D pertenece al grupo de vitaminas liposolubles, siendo su principal función la regulación junto con la Parathormona (PTH) del metabolismo fosfocálcico. Para ello actúa sobre la absorción intestinal de calcio, la síntesis y degradación del hueso, así como sobre la excreción renal de calcio. Sin embargo, en los últimos años se ha descrito que esta vitamina tiene acciones antiproliferativas, inmunomoduladoras y de estimulación celular que se relacionan con múltiples efectos fisiopatológicos ⁽¹⁾.
Aunque está englobada dentro del grupo de vitaminas liposolubles, al contrario que el resto de vitaminas, no es necesario su aporte exógeno para mantener unos niveles adecuados de vitamina D, ya que entre el 70-80% de vitamina D es de síntesis endógena mediante un proceso de fotobiogénesis y sólo un 20-30% corresponde al aporte exógeno mediante la dieta, por lo que esto y las diversas funciones en las que está implicada, hacen que se la esté empezando a considerar cada vez más como una hormona esteroidea.
El aumento de publicaciones sobre nuevas implicaciones de la vitamina D ha conllevado la solicitud masiva por parte de los clínicos de la determinación de los niveles séricos de vitamina D, lo que ha producido que la mayoría de los laboratorios clínicos hayan abandonado los métodos con extracción previa para pasar a métodos más rápidos como son los inmunoensayos. El mejor parámetro que mide los niveles de vitamina D en el organismo es la determinación de los niveles séricos de 25(OH)vitamina D total⁽²⁾.
En la actualidad existen diferentes métodos para medir los niveles de 25(OH)vitamina D, pero no existe todavía estandarización y eso hace que exista gran variabilidad intermétodo e interlote ^(3-5).
De los métodos disponibles en el mercado los que presentan mayor precisión son la cromatografía líquida de alta eficacia con detección ultravioleta (HPLC-UV) y la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/ MS); aunque estos métodos son más precisos, requieren de una infraestructura, personal calificado, mayor volumen de muestra y paso de extracción previo, lo que hace que en la mayoría de los laboratorios clínicos la determinación de los niveles de 25(OH)vitamina D total se realice mediante inmunoensayos automatizados. Los principales inmunoensayos presentes en el mercado son los de Liaison, iSYS, Elecsys, Abbott y Siemens. Estos métodos son mucho más rápidos con un alto rendimiento, pero presentan posible susceptibilidad a afectos de matriz, variabilidad entre lotes, discutida recuperación de la 25(OH)D2, alta reactividad cruzada con el 24,25-dihidroxivitamina D e inadecuada liberación de la proteína de unión a la vitamina D (VDBP) ⁽⁶⁾⁽⁷⁾.
El programa Vitamin D External Quality Assurance Survey (DEQAS) está designado como el mejor control de calidad externo en la evaluación de los niveles de 25-hidroxivitamina D; cuenta con más de 1.100 participantes de más de 55 países. En él se compara la exactitud de los resultados de diferentes laboratorios calculando el porcentaje de desviación frente a la media promedio de todos los laboratorios (Averaged Laboratory Trimmed Mean, ALTM) ⁽⁸⁾, se hacen comparaciones entre diferentes métodos y se realizan estudios sobre las principales interferencias de cada método. El DEQAS utilizaba como valor de referencia la media de todos los laboratorios (ALTM), pero a partir de abril de 2013 utiliza los valores asignados a los controles de calidad externos por el National Institute of Standards and Technology (NIST) de tal manera que los participantes pueden evaluar la exactitud de sus resultados comparándolos con un método de referencia reconocido a nivel internacional.
Además, el Centre for Diseases Control (CDC) ha diseñado un programa en 2014-2015 (Vitamin D Standardization-Certification Program, VDSCP) que evalúa el rendimiento del ensayo (sesgo e imprecisión) del fabricante del ensayo a lo largo de un año. Los criterios para superar dicha prueba eran una imprecisión global <10% en el intervalo de 22-275 nmol/L para vitamina D total; a los laboratorios que superaron esta primera prueba se les otorgó un certificado. Dentro de este programa los métodos que superaron la prueba eran LC/MS/MS, y sólo dos inmunoensayos (ADVIA Centaur Vitamina D Total assay e IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D).
El DEQAS está intentando corregir los errores de imprecisión y sesgos de los principales métodos. Recientemente ha informado que en muestras con alta concentración de 24,25(OH)2D la mayoría de los inmunoensayos dan valores muy superiores a los que asigna el NIST; sólo los inmunoensayos de Siemens ADVIA Centaur y DiaSorin Liaison están libres de interferencias por este metabolito y al igual que HPLC/UV y LC-MS/MS tampoco presentan interferencia. También ha reportado la existencia de interferencia de los HPLC/ UV y LC-MS/MS con el 3-epi-25-(OH) D3, metabolito que no parece interferir en los inmunoensayos ⁽⁹⁾.
Como se ha mencionado anteriormente el gran volumen de muestras en los laboratorios de rutina de análisis clínicos hace que los inmunoensayos sean los métodos a elegir en estos casos. En este aspecto parece que los inmunoensayos ADVIA Centaur Vitamina D Total assay y IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D llevan ventaja sobre el resto al pasar la primera fase del programa VDSCP.
El objetivo del presente artículo es realizar un estudio comparativo entre los dos inmunoensayos que han pasado la primera fase del VDSCP, ADVIA Centaur Vitamina D Total assay e IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D, para ver si existe correlación entre los dos métodos y ver si son intercambiables o si, por el contrario, todavía queda mucho que hacer en el proceso de estandarización y sigue existiendo gran variabilidad entre métodos.

Materiales y Métodos

Se seleccionaron un total de 70 muestras de suero de pacientes del Complejo Hospitalario Universitario de Badajoz. Se realizó una selección de muestras ya analizadas por el inmunoensayo de rutina (IDS-iSYS® 25-Hydroxy Vitamin D) para tener resultados de concentraciones de 25(OH)vitamina D distribuidas por todo el rango de linealidad del método y así comparar las desviaciones entre métodos en diferentes puntos, de tal manera que se seleccionan al azar 30 muestras con concentraciones de 25(OH) vitamina D menores de 20 ng/mL, 20 muestras con concentraciones entre 20 y 30 ng/mL y 20 muestras con concentraciones >30 ng/mL. Los sueros se reanalizaron utilizando el equipo ADVIA Centaur XP (Siemens®).
El ensayo de IDS-iSYS® 25-Hydroxy Vitamin D es el inmunoensayo utilizado en el laboratorio de rutina. Es un inmunoensayo con detección por quimioluminiscencia (CLIA), que utiliza 10 microlitros de muestra a los que somete a una fase de pretratamiento para desnaturalizar la fuerte unión de VDBP. Este ensayo que está validado para muestras de suero presenta un rango de medida que va desde 7-125 ng/mL. Cualquier valor por debajo de 7 se debe informar como <7 y los valores mayores de 125 ng/mL deben diluirse manualmente con una muestra de suero humano de baja concentración de vitamina D. Presenta una especificidad del 102% para 25-hidroxivitamina D, con una reacción cruzada del 1% para el 3-epi-25OHD. Según las indicaciones del fabricante también presentaba una detección equimolar de la 25(OH)D2.
El inmunoensayo con el que ha sido comparado es el ensayo ADVIA Centaur Vitamina D Total. Es un inmunoensayo competitivo con detección por quimioluminiscencia, que utiliza 20 microlitros de muestra. El rango analítico va desde 4-150 ng/mL. Los valores de vitamina D superiores a 150 ng/mL deben ser diluidos con el diluyente que incorpora el kit. Este inmunoensayo es válido tanto para muestras de suero como para muestras de plasma (EDTA, heparina de litio y heparina de sodio). Presenta una especificidad del 104% para 25(OH)vitamina D total, y una reacción cruzada del 1,1% para el 3-epi-25-(OH)D3.
La especificidad analítica de los dos inmunoensayos reflejada como el porcentaje de reactividad cruzada y la interferencia con otros metabolitos de la vitamina D, que no son el 25(OH) Vitamina D Total se expresan en la Tabla I.

Tabla I. Porcentaje de reactividad cruzada de cada inmunoensayo (Advia Centaur® e IDS-iSYS®) para cada uno de los metabolitos de la vitamina D según el folleto del fabricante.

Estos dos inmunoensayos utilizan calibradores de referencia (SRM 972 y SRM 2972) desarrollados por el National Institute of Standards and Technology (NIST) en 2009, cuya finalidad es intentar disminuir la variabilidad entre los diferentes métodos. Además, el laboratorio de Análisis Clínicos se encuentra inscripto en el DEQAS, de tal manera que permite comparar los resultados obtenidos del control de calidad externo determinado por el inmunoensayo de rutina en este laboratorio (IDS-iSYS®) con los valores asignados para ese control externo por el National Institute of Standards and Technology (NIST).
Para el análisis de los resultados se utilizó:
--- Estadística descriptiva: como parámetro estadístico de medidas de centralización se utilizó la media y como estadístico de medidas de dispersión la desviación estándar, calculando a partir de éste el coeficiente de variación.
--- Estadística inferencial: se ha demostrado que los métodos de correlación y regresión habituales para evaluar la concordancia entre medidas cuantitativas son insuficientes y que la interpretación del coeficiente de correlación de Pearson como una medida de concordancia es errónea (10)(11). La igualdad de medias tan sólo garantiza que los 2 métodos se centran en el mismo valor, pero en ningún caso que todos sus valores sean iguales. Hay paquetes estadísticos (MedCalc®) que incorporan directamente un procedimiento de comparación de métodos en el que el cálculo de la mayoría de coeficientes, modelos de regresión y métodos gráficos están implementados, sin que sea necesaria la manipulación algebraica de las variables originales para llevarlos a cabo (SPSS® sólo tiene implementado el procedimiento para el cálculo del coeficiente de correlación intraclase).

Para realizar la comparación de métodos se utilizó el programa estadístico MedCalc® versión 16.8.4. Este programa permite realizar el análisis de Bland-Altman, regresión de Deming y regresión Passing-Bablok. Se ha utilizado el análisis de Bland-Altman y el método de regresión Passing-Bablok realizando la comparación de los dos métodos, utilizando como método de referencia el que se usa de rutina en el laboratorio (IDS-iSYS®), y se calculó la pendiente, la intersección en el origen y el coeficiente de correlación de Spearman, todo con un intervalo de confianza del 95% (IC=95%).
En un primer análisis se utilizaron todas las muestras (n=70) y después se analizaron por separado las muestras con concentración de 25(OH)vitamina D<20 ng/mL (n=30) y las muestras con concentraciones >20 ng/mL (n=40).
Además, como dependiendo de los niveles de vitamina D se distinguen 4 categorías, deficiencia de vitamina D (<20 ng/mL), insuficiencia de vitamina D (20- 30 ng/mL), suficiencia de vitamina D (30-100 ng/mL) y toxicidad (>100 ng/mL). En este estudio también se observó cuántos pacientes se encuadraban en cada categoría utilizando uno u otro inmunoensayo.
Además, se estudió la precisión de los 2 métodos, para lo cual se seleccionaron al azar 50 muestras y se analizaron por triplicado por los 2 equipos. Los resultados se expresaron con la desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV).

Resultados

Los resultados obtenidos al analizar las 70 muestras por cada uno de los inmunoensayos se muestran en la Tabla II.

Tabla II. Resultado de cada muestra al ser analizada por cada inmunoensayo.

Para el estudio comparativo entre los dos métodos, se utilizó como método de referencia IDS-iSYS®, siendo éste el método utilizado de rutina en el laboratorio de Análisis Clínicos y como método comparativo Advia Centaur®. Se calculó la media, desviación estándar y los resultados mínimos y máximos para cada uno de los inmunoensayos, expresando los resultados en la Tabla III.

Tabla III. Media, desviación típica, máximo y mínimo del total de las muestras al ser analizadas con cada inmunoensayo (Advia Centaur® e IDS-iSYS®).

Al realizar la regresión lineal de Passink-Bablok con todas las muestras (n=70), se obtuvo un punto de corte en el origen de 1,15 (IC 95%: -1,44 a 3,93), una pendiente de la recta de 0,98 (IC 95%: 0,84 a 1,14) y una recta de regresión calculada de y=1,15 + 0,98x, como se puede observar en la Figura 1. El coeficiente de correlación de Spearman entre los dos métodos analizados fue de 0,86 (IC 95%: 0,78 a 0,91) con un nivel de significación p<0,0001. También se realizó el análisis de Bland- Altman, el cual indica la dispersión respecto a la media de los resultados obtenidos, y la diferencia entre los dos métodos (Figura 2).

Figura 1. Regresión lineal de Passing-Bablok al analizar todo el tamaño de la muestra (N=70).

Figura 2. Análisis de Bland-Altman el cual indica la dispersión de cada método con respecto a la media.

Cuando se analizaron las muestras menores de 20 ng/mL (deficiencia de vitamina D) por un lado y las mayores de 20 ng/mL por otro, los resultados indicaron que no existió correlación entre la medición de la concentración de 25(OH)vitamina D entre los diferentes métodos en el rango de deficiencia (<20 ng/mL), coeficiente de correlación de Spearmande 0,57. Sin embargo, al analizar los resultados mayores de 20 ng/mL se encontró una correlación baja, con un r de Spearman de 0,69. En la Tabla IV se expresan los resultados obtenidos; en la Figura 3, la regresión de Passink-Bablok al analizar las muestras con resultado menor de 20 ng/mL y, en la Figura 4, cuando se utilizaron las muestras con resultados mayores de 20 ng/mL.

Figura 3. Regresión lineal de Passing- Bablok al analizar las muestras <20 ng/mL. Punto de corte -3,06 (IC 95%: -11,97 a 2,29); pendiente de la recta 1,40 (IC 95%: 0,98 a 2,06) coeficiente correlación Spearman 0’57 (IC 95%: 0,27 a 0,77) con un nivel de significación p=0,001.

Figura 4. Regresión lineal de Passing-Bablok al analizar las muestras >20 ng/mL. Punto de corte -1,92 (IC 95%: -11,31 a 6,32); pendiente de la recta 1,06 (IC 95%: 0,76 a 1,40) coeficiente correlación Spearman 0’69 (IC 95%: 0,48 a 0,82) con un nivel de p<0,0001.

Tabla IV. Análisis de la media, desviación típica y coeficiente de correlación de Spearman por los dos inmunoensayos para las muestras <20 ng/mL y >20 ng/mL.

Los 70 resultados obtenidos de las determinaciones por los dos inmunoensayos se clasificaron en categorías clínicas, según la cual se dividían en pacientes con deficiencia de vitamina D (<20 ng/mL), insuficiencia de vitamina D (20-30 ng/mL), suficiencia de vitamina D (30-100 ng/mL) y toxicidad (>100 ng/mL); los resultados obtenidos se expresan en la Tabla V. La variación analítica entre métodos hacía que se clasificara a pacientes en diferentes categorías clínicas. Además, se estudió cada paciente individualmente:
--- En cinco pacientes en los cuales el resultado con Advia Centaur® los incluía en el grupo de deficiencia, sin embargo, con IDS-iSYS® estaban en el rango de insuficiencia.
--- En cuatro pacientes ocurría lo contrario, con el método de IDS-iSYS® presentaban resultados de deficiencia y con el de Advia Centaur®, insuficiencia.

Tabla V. Distribución de las muestras en cada una de las categorías dependiente de los niveles de vitamina D, al analizarlas con los dos inmunoensayos

Al estudiar las determinaciones de 25(OH)vitamina D de forma individual de los pacientes que se encontraban en el rango de deficiencia (29 sujetos con cada inmunoensayo), los resultados obtenidos con el IDS-iSYS® no coincidían con los resultados si las muestras eran analizadas con el Advia Centaur®. Lo mismo ocurría con los pacientes que se encontraban en el rango de insuficiencia.
El estudio para ver la precisión de los inmunoensayos se realizó analizando las muestras de 50 pacientes por triplicado por los dos métodos, y reportó los resultados reflejados en la Tabla VI para el coeficiente de variación, y la desviación típica existente entre cada método, y el resultado final se refleja en la Tabla VII.

Tabla VI. Resultado de DE y CV al analizar las muestras por triplicado por cada inmunoensayo.

Tabla VII. Media del DE y CV de cada inmunoensayo al analizar las 50 muestras.

Por último, se realizó un análisis comparativo entre los dos métodos para ver la desviación estándar y el coeficiente de variación, reflejando así la variación de los resultados utilizando diferente método, y se obtuvo una DE de 4,81 y un CV del 20,45%.

Discusión y Conclusiones

Un aspecto muy importante a tener en cuenta a la hora de evaluar el estado fisiológico de vitamina D es el método utilizado para realizar su determinación. Tanto es así, que debido a la falta de estandarización de su medida se hace difícil establecer unos puntos de corte sobre los niveles de suficiencia. En 2010 se desarrolló un método de LC-MS/MS ⁽¹²⁾ que más tarde se reconoció como el método de referencia para la medición de 25(OH)vitamina D. Éstos han disminuido su imprecisión en los últimos años de un 13,4% a un 6,9% ⁽¹³⁾, por lo que son métodos más consistentes (CV 5-10%) y mucho más precisos (sesgo 5%) que los métodos basados en anticuerpos. Pero su complejidad y la necesidad de personal muy especializado en su manejo lo convierten en un método poco útil en la práctica diaria. La disponibilidad de inmunoanálisis automatizados permite asumir, desde el punto de vista asistencial, el aumento en la demanda de la determinación de este parámetro.
Los dos métodos que han sido comparados son los dos inmunoensayos que superaron el programa VDSCP. Al compararlos, presentaron una correlación estadísticamente significativa entre sí, con un coeficiente de correlación de Spearman de 0,86 al analizar todas las muestras en conjunto, resultados similares a los obtenidos por otros estudios de comparación de inmunoensayos ^(14-17). Sin embargo, al analizar las muestras menores de 20 ng/mL por separado, se encontró que la correlación fue baja, al presentar un coeficiente de correlación de 0,57, objetivando una mayor dispersión de los resultados entre los dos métodos en los valores de decisión clínica. Esta variabilidad intermétodo en valores de decisión clínica hace que la inclusión de un paciente en un rango analítico concreto de vitamina D (deficiencia, insuficiencia, suficiencia o toxicidad) no sea igual ⁽¹⁸⁾, y que utilizando diferente método haya pacientes que pasan de una categoría a otra, influyendo en la toma de decisión del clínico. Se puede afirmar que el estudio de correlación muestra gran concordancia entre los resultados de los dos métodos utilizados, pero hay que mencionar que los resultados obtenidos no son intercambiables para muestras individuales y la variabilidad que se produce en valores bajos podría deberse a las diferencias en las reactividades cruzadas que presenta cada método ⁽¹⁹⁾.
En el estudio de reproducibilidad, el Advia Centaur® presenta mejor CV que IDS-iSYS®, siendo en este aspecto este inmunoensayo mejor, aunque todavía presenta CV muy elevado, con gran variabilidad intramétodo.
Algunos artículos sugieren que para estudiar la verdadera relación entre la vitamina D y la enfermedad es necesario la medición simultánea de las concentraciones de varios metabolitos de la vitamina D⁽²⁰⁾, aspecto que sólo se pueden conseguir mediante los métodos de LC-MS/MS; entre estos metabolitos cobra cada vez más importancia la 24,25-dihidroxivitamina D⁽²¹⁾. Este metabolito es un interferente en algunos inmunoensayos; por un lado, algunos no lo detectan y por otro, los que lo detectan lo hacen como vitamina D Total. En este aspecto, la idoneidad del inmunoensayo es ser capaz de detectar individualmente los diferentes metabolitos de la vitamina D, cosa que todavía no se ha conseguido.
Como conclusiones finales se puede decir que la variabilidad intermétodo e intramétodo encontrada en la comparación de los dos inmunoensayos hace que, aunque presenten alto nivel de correlación estadística, ahora mismo sus resultados no sean intercambiables individualmente. La vitamina D está considerada como un metabolito difícil de medir y el proceso de estandarización es difícil, por lo que se recomienda que hasta que finalice dicho proceso para el perfeccionamiento de la técnica y exista una buena correlación entre los diferentes métodos sería necesario que cada laboratorio en consenso con los clínicos, definiera sus propios valores de referencia, dependiendo del método utilizado. Además, todo apunta a que en el futuro la vitamina D será necesaria medirla mediante LC-MS/MS, para medir por separado sus diferentes metabolitos y calcular así el verdadero nivel fisiológico de la misma.

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Recibido: 8 de diciembre de 2016
Aceptado: 10 de marzo de 2017