BIOLOGÍA MOLECULAR

Búsqueda de biomarcadores a partir de péptidos expresados en biopsias de cáncer de mama

Search for biomarkers from peptides expressed in breast cancer biopsies

Busca de biomarcadores a partir de peptídeos expressos em biópsias câncer de mama

 

Carlos Muza Briseño^1a, William Haskins^2c, Guillermo Cazares Urbina^3d, Raúl Rodríguez Herrera^4b, Madeleine Zaehringer^5d, Alejandro Zugasti Cruz^6b, Jesús Antonio Morlett Chávez^7abe

¹ Maestría en Ciencias con especialidad en Biología Molecular.
² Dr. en Ciencias con especialidad en Química.
³ Médico especialista en Ginecología y Oncología.
⁴ Dr. en Ciencias con especialidad en Genética.
⁵ Dra en Ciencias con especialidad en Biología.
⁶ Dr. en Ciencias con especialidad en Toxicología.
⁷ Dr. en Ciencias con especialidad en Biología Molecular.
^a Departamento de Análisis Clínicos y Diagnóstico Molecular.
^b Laboratorio de Biología Molecular, Departamento de Investigación en Alimentos, Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila, Boulevard. Venustiano Carranza esquina con José Cárdenas. República. CP 25280, Saltillo, Coahuila, México. Tel: (844) 4169213, Fax: 4390511.
^c RCMI Proteomics & Protein Biomarkers Cores, Dept. of Biology-BSE 3.108A. One UTSA Circle, University of Texas at San Antonio. San Antonio, Texas 78249-0662, ph:(210)458-7932 fx: (210)458-5658.
^d Centro Médico Universidad. Ave Universidad 768 altos, Col. Los Maestros, CP 25160. Saltillo, Coahuila, México. Tel: (844) 419-37-76.
^e Depto. de Laboratorio Clínico, Hospital General de Zona con Medicina Familiar No.2, Instituto Mexicano del Seguro Social, Blvd. Venustiano Carranza y Humberto Hinojosa s/n. Col., Kiosco. CP 2520. Saltillo Coahuila. Tel (844) 4150091.

CORRESPONDENCIA ANTONIO MORLETT CHÁVEZ E-mail: antoniomorlett@uadec.edu.mx

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Resumen

El cáncer de mama (CM) es una de las principales causas de muerte en México. Se ha observado un incremento en la incidencia de éste en mujeres de 15-29 años. A fin de comprender las causas en el desarrollo del CM, se pretendió buscar la asociación entre los genes/enfermedad empleando técnicas de Biología Molecular. Se analizaron, por genómica funcional, 50 biopsias frescas de pacientes con CM (BFCM), 50 biopsias embebidas en parafina de CM (BEPCM) y 10 biopsias frescas de pacientes con sospecha de CM (BFSC), obtenidas de mujeres que residen en Coahuila, México. Las muestras proteicas se cuantificaron y se resolvieron en geles de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y en dos dimensiones (2-DE). El perfil proteico de las BFCM, BEPCM versus BFSC mostró diferencias entre las bandas peptídicas observadas en los geles. Aquellos péptidos que se diferenciaron por su expresión fueron analizados por cromatografía líquida acoplada a masas en tándem (LC/ MS/MS). Las huellas peptídicas obtenidas, a su vez, se analizaron por medio del banco de genes (PubMed). Se encontraron, en las muestras de cáncer, proteínas asociadas a migración celular, supresión de tumores, estrés oxidativo y choque térmico. Por último, estos hallazgos se confirmaron empleando inmuno-electro transferencia o Western blot (WB) con anticuerpos contra vimentina.

Palabras clave: Cáncer de mama; Proteómica; Geles de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio; Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem; Biomarcadores.

Abstract

Breast cancer (BC) is one of the leading causes of death in Mexico. Moreover, BC is the main cause of death in women between 15-29 years old in northern Mexico. Proteomic techniques have been used in order to achieve a better understanding of the genes involved in the development of BC. The proteins in BC extracted from 50 fresh breast cancer tissues (FBCT), 50 paraffin embedded breast cancer tissues (PEBCT) and 10 biopsies from women suspected of cancer (SC), residing in Coahuila, Mexico were analyzed in this paper. The quantity of protein extracted was similar in both samples FBCT and PEBCT. However, protein quality was lower in PEBCT than FBCT. Subsequently, these proteins were resolved in SDS-PAGE and 2DE. Differences were noticed in protein profile and all those suspect proteins were analyzed by LC/MS/MS. Amino acidic fingerprint allowed for the identification of peptides associated with a) cell migration, b) tumor suppression, c) oxidative stress or heat shock.

Keywords: Breast cancer; Proteomics; Sodium polyacrylamide-dodecyl sulfate gels in two dimentions; Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry; Biomarkers.

Resumo

O câncer da mama (CM) é uma das principais causas de morte no México. Observou-se um aumento na incidência desse câncer em mulheres entre os 15-29 anos de idade. Para compreender as causas do desenvolvimento de CM, visou-se encontrar a associação entre os genes/doença utilizando técnicas de Biologia molecular. Analisaram-se por genômica funcional, 50 biópsias frescas de pacientes com CM (BFCM), 50 biópsias embebidas em parafina (BEPCM) e 10 biópsias frescas de pacientes com suspeita de CM (BFSC), obtidas de mulheres residentes em Coahuila, México. As amostras de proteínas foram quantificadas e separadas em géis de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e em duas dimensões (2-DE). O perfil proteico das BFCM, BEPCM comparado com BFSC mostrou diferenças entre as bandas peptídicas observadas nos géis. Esses peptídeos que diferem em sua expressão foram analisados por cromatografia líquida acoplada a massas em tandem (LC/MS/MS). As pegadas peptídicas obtidas, por sua vez, foram analisadas utilizando o banco de genes (PubMed). Verificaram-se nas amostras de câncer, proteínas associadas à migração celular, supressão de tumores, estresse oxidativo e choque térmico. Finalmente, estes achados foram confirmados utilizando a imuno-eletro transferência ou Western Blot (WB) com anticorpos contra vimentina.

Palavras-chave: Câncer de mama; Proteômica; Géis de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio; Electroforese bidimensional; Cromatografia líquida acoplada a massas em tandem; Biomarcadores.

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Introducción

El cáncer se define como la acumulación gradual de alteraciones génicas que llegan a transformar cualquier célula del ser humano en una masa de proliferación incontrolable ⁽¹⁾. Específicamente, el cáncer de mama (CM) se encuentra entre las principales causas de muerte a nivel mundial incluido México ⁽²⁾. En los últimos años se observó que existe una estrecha relación entre el CM y algunos factores como: a) socioeconómicos, b) índice de masa corporal, c) dieta, d) edad temprana del primer embarazo, e) no haber amamantado y f) alta densidad de los senos. Sin embargo, ninguno de estos factores ha permitido explicar las posibles causas ni el desarrollo del CM; en consecuencia, solo se ha registrado una ligera disminución en la incidencia de este cáncer. Asimismo, se ha reportado que el diagnóstico oportuno del CM permitiría un mejor tratamiento y pronóstico para la paciente. Pero, la palpación, mamografía, ultra-ecografía, resonancia magnética-nuclear e histopatología carecen de alta especificidad y sensibilidad, resultando poco eficientes para un diagnóstico oportuno. Sin embargo, para contrarrestar estas limitantes, el desarrollo de la medicina genómica ha contribuido a mejorar la comprensión de la fisiopatología, diagnóstico y al descubrimiento de nuevas terapias contra el CM ⁽³⁾⁽⁴⁾. Además, la proteómica ha brindado las bases para comprender las vías de señalización que gobiernan el desarrollo y progresión del CM ^(5-7).
En este mismo contexto, el estudio de la alteración en la expresión de genes/proteínas, se lleva a cabo mediante geles de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en dos dimensiones (2-DE) y cromatografía líquida acoplada a masas en tándem (LC/MS/MS). Cabe señalar que uno de los primeros biomarcadores fueron los genes supresores de tumor BRCA1 y BRCA2. Reportes previos han demostrado, por genómica comparativa, que la mayoría de los pacientes con CM presentaban mutaciones en estos genes ^(8-10). Sin embargo, la genómica funcional confirmó que BRCA1 y BRCA2 participan en múltiples funciones y asociaciones, lo cual conlleva a restar importancia al empleo de estos genes como biomarcadores ^(10-13). Anteriormente se había reportado la sobre expresión de tres péptidos en biopsias de CM que se identificaron como proteínas relacionadas a la cascada del complemento ⁽¹⁴⁾. Asimismo, se reportó la sobreexpresión de los péptidos alfa enolasa, anexina y calmodulina en biopsias de CM (6). Sus resultados fueron validados por western blot, empleando anticuerpos anti-alfa enolasa, anti-anexina y anti-calmodulina. Otros estudios reportaron la desregulación de Ak1, Atox1 e Hist1H2BM en etapas temprana del CM ⁽¹⁵⁾. Asimismo, la sobreexpresión de éstas se confirmó empleando anticuerpos contra Ak1, Atox1 e Hist1H2BM. Mas aún, se reportó la presencia de 19 proteínas que permiten una mejor clasificación respecto a los subtipos de cáncer de mama, como receptor de progesterona (+/-), receptor de estrógenos (+/-), receptor del factor de crecimiento epidermal (+/-), o los triple negativos, entre otros (4). En el presente trabajo, se analizó la vía SDS-PAGE, 2-DE, Melanie, TagIdent y LC/MS/MS, el proteoma de biopsias frescas de pacientes con CM (BFCM), biopsias embebidas en parafina de CM (BEPCM) y biopsias frescas de pacientes con sospecha de CM (BFSC). Algunas de las proteínas sobre-expresadas e identificadas en BFCM fueron STAT6, CDC42, vimentina (VIM), y Prohibitina.

Materiales y Métodos

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras, 50 BFCM, 50 BEPCM y 10 BSC fueron recolectadas por el Departamento de Patología del Centro Médico de la Universidad (Saltillo, Coahuila, México). A cada paciente se le explicó el procedimiento y a quien aceptó participar en el protocolo se le solicitó que firmara el consentimiento informado. Las biopsias se obtuvieron empleando técnicas quirúrgicas. Las muestras etiquetadas como BFSC y BFCM fueron consideradas negativas o positivas, respectivamente, después de un estricto análisis patológico. Las muestras se recolectaron durante un período de 6 meses, y cada una se congeló en nitrógeno líquido, realizándose posteriormente la extracción de proteínas, como se describe a continuación.

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y HERRAMIENTAS PROTEÓMICAS
La extracción de proteínas y las electroforesis SDS-PAGE y 2DE se realizaron de acuerdo con la metodología descrita previamente ^(16)(17). Los homogeneizados de tejido que contenían las proteínas totales se almacenaron a -20 ºC hasta su uso. Asimismo, la concentración de éstas se determinó por la técnica de Bradford ⁽¹⁸⁾ y se ajustaron a dos concentraciones diferentes, 20 μg y 200 μg. La determinación de VIM por western blot, se llevó a cabo conforme a las metodologías previamente reportadas ^(17)(18).

ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS
Los geles SDS-PAGE y 2DE obtenidos con las proteínas separadas electroforéticamente, se digitalizaron en el densitómetro GS-800 (Bio-Rad, Dallas, Texas, EE.UU.). El análisis de los geles 2-DE fue desarrollado empleando el software Melanie 7.0 (http://world-2dpage.expasy.org/melanie). Además, para obtener el punto isoeléctrico (pI) y el peso molecular (PM) de cada una de las manchas obtenidas, se empleó el software TagIdent (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html) ⁽⁷⁾.

IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
La identificación de las proteínas se llevó a cabo por medio de LC/MS/MS; el análisis se realizó en la Universidad de Texas en E.E.U.U. y se siguió el protocolo propuesto anteriormente ^(16)(20).

Resultados

Las proteínas extraídas a partir de las BEPCM, BFCM y BFSC se separaron en SDS-PAGE. Debido a la escasa calidad de las proteínas extraídas de las BEPCM fue imposible realizar algún tipo de comparación con el resto de las muestras ⁽⁶⁾. De acuerdo con lo anterior, se mencionó que los agentes químicos empleados durante la fijación y procesamiento de la biopsia afectan el rendimiento y calidad de las proteínas ⁽²¹⁾.
El análisis de los proteomas a partir de BFCM versus BFSC, permitió identificar 48 bandas de proteínas diferentes que teóricamente estaban sobre-expresadas o sub-expresadas en las muestras con cáncer. Cada una de las bandas obtenidas se analizó por LC/MS/MS, lo que permitió identificar en su mayoría a la familia de proteínas de choque térmico (HSP). También se identificaron el factor de crecimiento transformante (TGFb1), vimentina, serpina, superóxido dismutasa y lumican, entre otras (Tabla I). Posteriormente, esas mismas proteínas se analizaron por 2-DE. Los resultados indicaron que dieciocho manchas proteicas, del total analizado, se correspondieron con las identificadas por SDS-PAGE (Figura 1). Previo a la obtención de las secuencias de aminoácidos, cada una de las manchas se analizó in silico, lo cual permitió determinar el peso molecular (PM) y el punto isoeléctrico (pI). A partir de este análisis se determinó la presencia de la HSP90, calnexina, moesina y endoplasmina (Tabla I).

Tabla I. Análisis de péptidos asociados con cáncer de mama.
Cada uno de los geles SDS-PAGE y 2DE se analizaron por los software Melanie v 7.0 y TagIdent. Después de este análisis, se seleccionaron péptidos, los cuales, se recuperaron desde los geles, y posteriormente se analizaron por LC/MS/MS.

Figura 1. Las proteínas de dos BFCM (A y B), de una BEPCM (C) y de una BFSC (D) se resolvieron en 2-DE.
El análisis con el software Melanie permitió identificar 18 manchas de péptidos expresados diferencialmente en las BFCM. Por último, se obtuvieron las huellas peptídicas de esas manchas por LC/MS/MS y se compararon con la base de datos del banco de genes. Los cuadros muestran las proteínas presentes en todos los geles “proteínas ancla”. Los círculos indican la presencia de proteínas en las biopsias de cáncer de mama, mientras que en las biopsias de pacientes sanas, esas proteínas no se han expresado. Las flechas muestran las proteínas expresadas en pacientes sanas y la ausencia de esas mismas proteínas en pacientes con cáncer de mama.

En la Figura 2 se muestra el análisis que determinó la presencia y expresión de las 18 proteínas identificadas por 2-DE en las 50 BFCM y 10 BFSC. Estos resultados indicaron que la familia de las HSP, prohibitina y VIM se sobre-expresaron en casi cerca del 90% de las biopsias analizadas, mientras que las proteínas ACACA y las de choque térmico se encontraron sobre expresadas en menos del 50% de las muestras con cáncer. Para confirmar estos resultados, cada una de las biopsias se analizó empleando anticuerpos contra VIM. La sobre-expresión de VIM se observó en cuarenta y siete BFCM y en cuarenta y dos BEPCM, mientras que niveles basales fueron detectados en las muestras de pacientes sin cáncer (Figura 3). Además, nuevamente, el análisis densitométrico indicó que VIM se sobre-expresó de 6-7 veces en 86% de los casos.

Figura 2. Análisis representativo de la expresión de vimentina.
I) Vimentina registra un peso molecular de 54 KDa aproximadamente. Actina (42 KDa) se utilizó como control. A) El Western blot pertenece a las muestras de las pacientes que presentan cáncer de mama. B) Muestras de personas quienes resultaron ser negativas para el cáncer de mama. II) Análisis densitométrico de los western blot presentados en los incisos A y B. Según este análisis, en pacientes con cáncer, vimentina se expresó de 5-6 veces en comparación con aquellas biopsias de pacientes sin cáncer. Mismos resultados se observaron para el resto de las biposias.

Figura 3. Estimación de las proteínas encontradas en las muestras con cáncer.
Se observa que PHB, la familia de las HP y vimentina son las proteínas que están presentes en la mayoría de las muestras con cáncer. La desregulación de vimentina nos permitió identificarla por western blot para determinar su expresión.

Discusión y Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos a partir del SDS-PAGE, en la Tabla I, se muestran los péptidos identificados como CANX, CDC42, ANXA, APOE, HSPB1 y VIM. La sobre-expresión de CDC42, ENO1 y LUM se ha observado en biopsias de tejido humano ⁽²²⁾. Estas proteínas participan en la migración, regulación del ciclo celular y metástasis, sin embargo, la desregulación de estas proteínas solo se había observado en las líneas celulares de mama MCF-7 y BT549 ^(12)(23-27). En la misma Tabla I se muestra a VIM, calnexina, prohibitina, moesina y CDC42, entre otras, extraídas a partir de los geles 2D y analizadas por LC/MS/MS. Específicamente, VIM ha sido asociada con un fenotipo invasivo, movilidad, progresión y migración celular ^{(12)(18)(24)(28)}. Antes, VIM se había distinguido solo en líneas celulares de cáncer de mama, sin embargo, a fines de la última década, se documentó la sobre-expresión de esta proteína en biopsias de este mismo cáncer ^{(16)(17)(22)(29)}. También se observa la sobre-expresión de las proteínas HSP y ENO1, las cuales están relacionadas con procesos neoplásicos, de pobre diagnóstico, resistencia a tratamientos y metástasis ^(30-33). Otra proteína identificada en el presente trabajo fue ASHA1 que regula la respuesta durante el tratamiento de cáncer, inhibiendo el crecimiento de las células cancerosas e induciendo apoptosis, posiblemente por arresto del factor de trascripción E2F ^(34)(35). Mientras, TGF β1, en condiciones normales, facilita la adhesión y migración celular a través de la integración de receptores de superficie ^{(36- 38)}. Sin embargo, la sobre-expresión de ésta, se asocia con el pobre pronóstico para pacientes con cáncer de mama.
Los resultados más consistentes en este trabajo fueron los altos niveles de VIM. Anteriormente, sus altos niveles fueron detectados en 231 líneas celulares de cáncer de mama ⁽¹⁶⁾ y modelos murinos ⁽³⁹⁾. Más adelante, se detectó su sobre- expresión en pacientes con cáncer de mama ⁽¹⁷⁾. Además, se planteó a VIM como un marcador para clasificar los tumores de mama y determinar la enfermedad residual y la transición de las células epiteliales a mesenquimales en pacientes con CM ^(16)(17). Más aún, estudios recientes reportaron su sobre-expresión en pacientes con cáncer de mama ⁽⁴⁰⁾ y su asociación con la expresión de la topoisomerasa 2 ⁽⁴¹⁾ y E-cadherina ⁽⁴²⁾. También, se mencionó que la expresión de VIM correlaciona negativamente con la expresión de los receptores de estrógenos y progesterona, además del grado de tumor y pezón invertido ⁽⁴¹⁾. Al respecto se ha establecido que la co-expresion deVIM, E-cadherina y topoisomerasa entre otros genes, está asociada con un fenotipo agresivo y de diagnóstico reservado para la paciente ^(39-42).
En conclusión, las muestras obtenidas se analizaron por herramientas proteómicas cualitativas y semi-cuantitativas. Sin embargo, respecto a las BEPCM, es necesario emplear métodos de fijación con las herramientas de biología molecular, para evitar la pérdida de muestras. A pesar de las limitantes que presenta el SDS-PAGE para resolver las proteínas, se documentó la presencia de proteínas relacionadas al CM como serpina, LUM SOD2 y TGF-b1. Sin embargo, el empleo de 2-DE y LC/ MS/MS, ayudó a potenciar el análisis y asimismo, a confirmar la presencia de ANXA1, VIM, STAT 6 y CANX en BFCM. Por último, se concluye que la expresión de VIM está fuertemente correlacionada con un fenotipo más agresivo y un pobre pronóstico para las pacientes.

AGRADECIMIENTOS

Muza Briseño C y Jesús Antonio Morlett Chávez agradecen al Dr. Will Haskins y al Dr. Madeleine Zaehringer of RCMI Proteomics & Protein Biomarkers Cores, Dept. of Biology University of Texas at San Antonio, al Dr. Guillermo Cazares Urbina, al Dr. Edgar Braham Priego of CGEPI-UAdeC y a la Dra. Carolina Flores Gallegos.

FUENTE DE FINANCIAMIENTO

Recursos PFCE-2016.

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Recibido: 20 de septiembre de 2016
Aceptado: 29 de mayo de 2017