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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.51 no.4 La Plata dic. 2017

 

INMUNOLOGÍA

Exposición de criptoantígeno eritrocitario por larvas recién nacidas de Trichinella spiralis

Exposure of erythrocyte cryptic antigen by Trichinella spiralis newborn larvae

Exposição do cripto antígeno eritrocitário por larvas recém-nascidas de Trichinella spiralis

 

Patricia Ponce de León1, Jimena Nocelli2, Gabriel López Murúa3

1 Doctora en Cs. Biomédicas. Docente Área Parasitología. Dpto. Microbiología.
2 Becaria. Área Parasitología. Dpto. Microbiología.
3 Bioquímico. Docente Área Parasitología. Dpto. Microbiología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, Argentina, Suipacha 531- 2000 Rosario.

CORRESPONDENCIA Dra. PATRICIA PONCE DE LEÓN Área Parasitología - Dpto. de Microbiología Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario Suipacha 531 - 2000 ROSARIO - Argentina E-mail: tefu1958@hotmail.com  


Resumen

La desialización del eritrocito puede exponer determinantes antigénicas crípticas de la membrana, entre las cuales se encuentra el antígeno T. Se ha comunicado que las larvas recién nacidas de Trichinella spiralis (LRN), las cuales circulan por el torrente sanguíneo del hospedador, captan el ácido siálico eritrocitario. El objetivo de este trabajo fue estudiar in vitro la exposición del criptoantígeno T por la desialización producida por distintas concentraciones de LRN. Se trabajó con 30 suspensiones eritrocitarias en medio enzimático, que fueron incubadas en partes iguales con concentrados de LRN (GR Tratados) durante 2 horas a 37 ºC con agitación continua. Los respectivos GR Controles se pusieron en contacto con solución salina. El tratamiento de 10/30 suspensiones globulares se realizó con 500 LRN/mL, 10 con 300 LRN/mL y las últimas 10 con 150 LRN/mL. Se aplicó el Método de Aglutinación anti-T con antígeno T (en Placa y Tubo) enfrentando las suspensiones a suero de adulto y suero de cordón. El tratamiento de 9/10 de las suspensiones con 500 LRN/mL, el de 7/10 con 300 LRN/mL y el de 2/10 con 150 LRN/mL las expuso al criptoantígeno. Se concluye que en pacientes diabéticos, hipertensos o con otra patología que produzca disminución de ácido siálico eritrocitario y que cursen simultáneamente una infección por T. spiralis, en la etapa de circulación de larvas por el torrente sanguíneo podría producirse la activación T con la consecuente hemólisis, trombocitopenia y trombosis.

Palabras clave: Antígeno T; Larvas recién nacidas; Trichinella spiralis.

Abstract

Erythrocyte desialylation can expose cryptic antigenic determinants of the membrane, among which is the T antigen. It has been reported that newborn larvae (NL), which circulate in the bloodstream of the host, capture erythrocyte sialic acid. The aim of this study was to study in vitro exposure of cryptic T antigen by the desialylation produced by different concentrations of NL. Work was carried out on 30 red cell suspensions in enzymatic medium, which were incubated in equal parts with NL concentrates (Treated RBC) for 2 hours at 37 ºC with continued agitation. The respective Control RBC was incubated with saline solution. Treatment of 10/30 globular suspensions was performed with 500 NL/mL, 10 with 300 NL/mL and the last 10 with 150 NL/mL. Anti T- antigen T Agglutination Tests (Plate and Tube) were made, facing the globular suspensions against adult and cord human sera. Treatment of 9/10 suspensions with 500 NL/mL, 7/10 with 300 NL/mL and 2/10 with 150 NL/mL exposed T antigen. It is concluded that in patients with diabetes, hypertension or other diseases with lower content of erythrocyte sialic acid and who simultaneously have a T. spiralis infection, T activation may occur in the stage of larvae circulating through the bloodstream, with consequent haemolysis, thrombocytopenia and thrombosis.

Keywords: T antigen; Newborn larvae; Trichinella spiralis.

Resumo

A dessialização do eritrócito pode expor determinantes antigênicos crípticos da membrana, entre os quais se encontra o antígeno T. Foi comunicado que as larvas recém-nascidas de Trichinella spiralis (LRN), as quais circulam na corrente sanguínea do hospedeiro, capturam o ácido siálico eritrocitário. O objetivo foi estudar in vitro a exposição do cripto antígeno T pela dessialização produzida por diferentes concentrações de LRN. Trabalhou-se com 30 suspensões eritrocitárias em meio enzimático, incubadas em partes iguais com concentrados de LRN (GV Tratados) durante 2 horas a 37 °C com agitação contínua. Os respectivos GV Controles entraram em contato com solução salina. Tratamento de 10/30 suspensões globulares foi realizado com 500 LRN/mL, 10 com 300 LRN/mL e as últimas 10 com 150 LRN/mL. Foi aplicado o Método de aglutinação anti T-antígeno T (em Placa e Tubo) enfrentando as suspensões a soro de adulto e soro de cordão. O tratamento de 9/10 suspensões com 500 NRL / mL, o de 7/10 com 300 LRN/mL e o de 2/10 com 150 LRN/mL expuseram o cripto antígeno. Conclui-se que em pacientes diabéticos, hipertensos ou com outra patologia que produza diminuição do ácido siálico eritrocitário, e que padeçam simultaneamente uma infecção por T. spiralis, na fase de circulação de larvas pela corrente sanguínea, poderia ocorrer a ativação T com a consequente hemólise, trombocitopenia e trombose.

Palavras-chave: Antígeno T; Larvas recém-nascidas; Trichinella spiralis.


 

Introducción

Los hematíes son aglutinados por casi todos los sueros humanos normales. Algunas formas de poliaglutinabilidad se deben a la exposición, por acción de enzimas bacterianas o virales, de determinantes antigénicos que forman parte de la estructura de la membrana eritrocitaria normal pero que habitualmente se encuentran ocultos.
La causa más frecuente de poliaglutinabilidad se debe a la exposición del antígeno T, que reacciona con una aglutinina anti-T presente en todos los sueros de individuos normales, excepto en los del neonato y en los de infantes tempranos (1)(2).
El antígeno T (Thomsen-Friedenreich) β D Gal(1-3) D NAcGal es el oligosacárido precursor de una variedad de hidratos de carbono de las glicoproteínas eritrocitarias. Esta estructura precede en la biosíntesis a los determinantes antigénicos M y N, y también se encuentra en otros hidratos de carbono de la membrana celular. Algunas sustancias presentes en ciertos microorganismos o sus lipopolisacáridos son responsables de la aparición de anticuerpos naturales anti-T, principalmente IgA e IgM, presentes en el suero humano normal. El fenómeno Thomsen-Friedenreich, (poliaglutinabilidad de los hematíes humanos) se debe al desenmascaramiento de antígeno T críptico por enzimas microbianas o virales que eliminan residuos terminales de ácido siálico en la membrana del hematíe (3-6).
La unión del antígeno T con su anticuerpo específico desencadena poliaglutinación in vitro y una posible hemólisis, trombocitopenia y trombosis in vivo (2). Otra complicación es la reacción hemolítica asociada a la transfusión, debido a que las IgM anti–T presentes en el plasma transfundido producen reacciones transfusionales importantes en el individuo receptor (1)(7)(8).
La exposición del antígeno T está frecuentemente asociada con la producción de neuraminidasas de organismos como Clostridium perfringens y Streptococcus pneumoniae, Bacteroides, Escherichia coli, bacilos gram-negativos como Actinomyces y el virus de la influenza, así como también se ha demostrado la activación T in vitro por neuraminidasas producidas por Vibrio Cholerae (8).
Ponce de León et al. realizaron la primera comunicación de desenmascaramiento del antígeno T por la desialización eritrocitaria producida por un parásito trabajando con Ascaris lumbricoides (9).
Trichinella spp. es un helminto que afecta a una gran variedad de hospedadores, convirtiéndolo en uno de los nematodos infecciosos más ampliamente distribuido en el mundo. La fuente más importante de infección humana es el cerdo doméstico; sin embargo, durante las últimas décadas, la carne proveniente de caballos, jabalíes y otros animales silvestres ha sido responsable de la aparición de brotes de esta enfermedad (10). La trichinellosis producida por T. spiralis es un problema a nivel mundial y constituye una de las principales zoonosis de América Latina. El primer reporte de un caso humano en Argentina fue en 1879 (11) y desde entonces constituye un grave problema de salud pública, considerándosela una enfermedad endémica con picos epidémicos.
El ciclo biológico de T. spiralis incluye la migración de las larvas recién nacidas (LRN) por el torrente circulatorio, hasta su enquistamiento en la célula muscular (12). En experiencias previas se ha comunicado que las LRN captan el ácido siálico eritrocitario (13).
Debido a que las LRN tienen un contacto directo con los eritrocitos del hospedador durante la migración por el torrente circulatorio y a las implicancias clínicas que podría tener la activación T en el paciente parasitado, el objetivo de este trabajo fue estudiar in vitro la posible exposición de este antígeno críptico por la desialización producida por distintas concentraciones de LRN.

Materiales y Métodos

MUESTRAS
Larvas recién nacidas de T. spiralis (LRN)
Se trabajó con ratones CBi infectados con T. spiralis, provistos por el Bioterio del Instituto de Genética Experimental de la Facultad de Cs. Médicas (UNR-Argentina). Entre los 6 y 13 días post-infección, se obtuvieron hembras grávidas del intestino delgado de los ratones por cirugía, las cuales fueron incubadas en 100 μL de medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino y 250 μg/mL de gentamicina durante 18 horas a 37 ºC en atmósfera de 5% de CO2. Posteriormente las LRN fueron separadas de las hembras adultas y recolectadas en solución fisiológica con formol al 10%. A las 24 horas se prepararon concentrados de LRN no viables, para lo cual se lavaron las larvas 3 veces por centrifugación en solución salina y se realizaron los recuentos, por duplicado, en microscopio óptico. Se trabajó con 10 concentrados de LRN1: 500 LRN/mL, 10 de LRN2: 300 LRN/ mL y otros 10 de LRN3: 150 LRN/mL (14).
Los protocolos para la obtención de LRN de T. spiralis son utilizados en líneas de investigación de las Facultades de Cs. Médicas y de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR-Argentina), los cuales fueron aprobados por los Comités de Bioética de ambas instituciones.

Glóbulos rojos en medio enzimático de bromelina (GR)
Se trabajó con eritrocitos Grupo O provenientes de dadores voluntarios sanos. Se colocó un volumen de sedimento eritrocitario, previamente lavado en solución salina, con un volumen y medio de bromelina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente los glóbulos fueron lavados 3 veces con solución fisiológica (2).
Métodos

TRATAMIENTO DE LOS ERITROCITOS
El tratamiento consistió en incubar el sedimento globular con igual volumen de LRN a 37 ºC durante 120 minutos, con agitación continua utilizando un agitador magnético marca Decalab, Industria Argentina (GR Tratados).
Se trabajó con 30 suspensiones eritrocitarias, realizando el tratamiento de 10 de ellas con concentrados de LRN1, de otras 10 con LRN2 y de las últimas 10 suspensiones globulares con LRN3. Para cada tratamiento hubo un Control (eritrocitos en medio enzimático, sin contacto con LRN) que fue incubado de la misma manera con igual volumen de solución salina. Al finalizar el tiempo de incubación, los sedimentos de GR Tratados y del correspondiente Control fueron lavados 3 veces en solución salina y se prepararon suspensiones al 2-5% y al 20% a partir de ellos.

PRUEBAS EN TUBO Y PLACA DE AGLUTINACIÓN ANTI-T CON ANTÍGENO T
Se colocaron 20 µL de suspensiones de GR Tratados y GR Controles en 2 tubos para cada prueba (al 2-5% para las de Tubo y al 20% para las de Placa). A uno de cada par se le agregaron 20 µL de suero de individuos adultos sanos (sueros anti-T) y al restante 20 µL de suero de cordón (control negativo de anti-T). Todos los tubos se homogeneizaron por agitación y se colocaron, con tapones de goma, a 4 ºC durante 24 h. Pasado este tiempo, para la prueba en Placa se volcó el contenido de los tubos correspondientes en una placa de vidrio y para la prueba en Tubo fueron centrifugados durante 1 minuto a baja velocidad (500 rpm) y luego fueron agitados. En ambos métodos se observó la presencia o ausencia de aglutinación (2).

Resultados

Los resultados mostraron que el tratamiento de los eritrocitos con 18 de los 30 concentrados de LRN, provocó la aglutinación eritrocitaria con suero de individuos adultos. En 13 de las suspensiones de GR Tratados se observó la presencia de aglutinados en ambas pruebas, mientras que en las 5 restantes solamente en el método en Tubo. Ninguno de los GR tratados aglutinó al ser enfrentado al suero de cordón.
El tratamiento con 500 LRN/mL de 9/10 suspensiones globulares estudiadas (90%), el de 7/10 de las tratadas con 300 LRN/mL (70%) y el de 2/10 de las que se incubaron con 150 LRN/mL (20%) produjo la aglutinación de los eritrocitos al ser enfrentados a los sueros de adultos, indicando la exposición del criptoantígeno T. Los resultados se muestran en la Tabla I.

Tabla I. Resultados del Método de Aglutinación anti-T con antígeno T.

Los glóbulos rojos Control no aglutinaron con sueros de adultos ni de cordón.

Discusión y Conclusiones

La causa más frecuente de poliaglutinabilidad se debe a la exposición del criptoantígenoT, que reacciona con una aglutinina anti-T presente en todos los sueros de individuos adultos normales, produciendo una aglutinación in vitro y una posible hemólisis in vivo. El fenómeno es generalmente transitorio, a menudo solo dura unos pocos días o semanas y rara vez persiste por meses.
Existen otras variantes de la activación T, por ejemplo la Tn. Esta activación se diferencia de la T en que es persistente; se acompaña de anomalías hematológicas, y por último porque los pacientes afectados tienen dos poblaciones de glóbulos rojos, una normal y otra que presenta la modificación Tn. Este fenómeno se debe a una mutación somática que se produce en las stem cells, que conduce a la aparición de una población de glóbulos rojos anormales. También en este caso el anticuerpo correspondiente, anti Tn, se encuentra en todos los sueros de adultos normales. Este tipo de poliaglutinación ha sido asociada en adultos a síndromes mielodisplásicos, leucemia aguda, neutropenia, trombocitopenia y en ciertos casos de anemia hemolítica, aunque también ha sido descrita poliaglutinación Tn en recién nacidos.
Finalmente, la poliaglutinación Tk es el resultado de b-galactosidasas microbianas que clivan residuos de galactosa exponiendo el determinante antigénico Tk (N-acetilglucosamina) y la activación Tx, descrita en niños con infección por pneumococo y con anemia hemolítica aguda, de la cual el mecanismo molecular no ha sido clarificado (2)(4-6)(15).
La naturaleza ubicua de los anticuerpos anti-T en los individuos adultos sugiere que la exposición del antígeno T podría producir autoaglutinación y hemólisis (4). Osborn concluye que la activación T y Tk en niños con enterocolitis necrotizante está asociada al incremento en la incidencia de hemólisis, hiperbilirrubinemia, hipercalcemia e insuficiencia renal (5). La activación de antígeno T en neonatos también produce otra complicación asociada a la transfusión, pues las inmunoglobulinas M anti–T, contenidas en el plasma transfundido, originan reacciones hemolíticas importantes (4)(5)(16).
A pesar de que no hay consenso a nivel mundial sobre la necesidad de realizar un tamizado de rutina para identificar anticuerpos anti-T en plasma de dadores, hay coincidencia en que existe riesgo potencial de reacciones hemolíticas en recién nacidos transfundidos (17)(18).
La exposición del antígeno T ha sido asociada con la producción de neuraminidasas de bacterias y virus (8)(18)(19), pero se ha comunicado por primera vez el desenmascaramiento de este antígeno críptico eritrocitario por acción de A. lumbricoides (9).
Los glóbulos rojos en medio enzimático de bromelina, pierden parcialmente su contenido de ácido siálico, por lo que podrían homologarse a patologías in vivo que presentan déficit de carga aniónica eritrocitaria, como son la diabetes y la hipertensión (19)(20).
La experiencia mostró que la captación del ácido siálico de eritrocitos en medio enzimático por LRN de T. spiralis puede exponer al antígeno críptico T.
T. spiralis causa una enfermedad cosmopolita y endémica en América Latina. Si bien se ha comunicado que la desialización producida por larvas musculares de este parásito (21) expondrían al antígeno T, los resultados obtenidos en esta experiencia tienen importancia clínica porque las LRN circulan por el torrente sanguíneo durante el ciclo evolutivo del parásito.
Cada hembra de este nematodo produce aproximadamente 1.500 larvas vivas en un periodo de 2-5 semanas, aunque la cantidad es variable según la especie de Trichinella y el hospedador (22).
Los resultados mostraron que la frecuencia de exposición del antígeno T aumenta a mayor concentración de LRN utilizadas en el tratamiento de los eritrocitos.
La activación T podría producir en el paciente adulto autoaglutinación eritrocitaria y hemólisis, mientras que en la población infantil, es un factor de riesgo ante la necesidad de una transfusión (1)(2)(5)(6)(16)(23).
Esta experiencia sugiere que en la etapa de la migración de LRN por el torrente circulatorio, podría ocurrir la exposición del antígeno T en aquellos individuos que presenten menor contenido de ácido siálico en sus glóbulos rojos.

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Recibido: 9 de enero de 2017
Aceptado: 11 de agosto de 2017

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