TOXICOLOGÍA

Alteraciones leucocitarias por exposición a perclorato de amonio en ratones de la cepa ICR*

Leucocitary changes by ammonium perchlorate in ICR mice strain

Alterações leucocitárias por exposição a perclorato de amônio em camundongos da linhagem ICR

 

Carol Morales Suárez¹, Andrea Wilches-Torres², Germán Arias Holguín³, Jorge Alejandro Rojas Camargo⁴, Cristina Millán Reyes⁵, Carolina Cipagauta Esquivel⁶

¹ Médica.
² PhD. Ciencias – Química.
³ Magíster en Docencia de la Química.
⁴ Licenciado en Matemática y Física.
⁵ Magíster en Educación.
⁶ Especialista en Higiene y Salud Ocupacional.
* Grupo de investigación Núcleo, Universidad de Boyacá. Cra. 2ª Este N° 64-169. Tunja - Boyacá, Colombia. Teléfono: (098) 7450000 Ext. 6408, 5402

CORRESPONDENCIA Dra. ANDREA WILCHES-TORRES E-mail: andreawilches@uniboyaca.edu.co; jarias@uniboyaca.edu.co

---

Resumen

El presente trabajo tuvo como objetivo identificar alteraciones en el recuento de leucocitos en sangre periférica, generadas por la exposición a perclorato de amonio, en ratones de la cepa ICR, evaluando diferentes concentraciones de exposición y diferenciando dichas alteraciones en machos y hembras. Se realizó mediante un trabajo de diseño analítico tipo experimental. Se utilizaron 60 ratones de la cepa ICR, 30 machos y 30 hembras de los cuales 50 fueron expuestos a perclorato de amonio. La manipulación se llevó a cabo de acuerdo con lo establecido en la resolución 008430 de 1993, artículo 87 del Ministerio de Salud de la República de Colombia. Un 70% de los ratones hembra y un 83% de los ratones macho expuestos a perclorato de amonio presentaron alteraciones en el recuento celular de la línea blanca. Los machos presentaron mayor alteración leucocitaria, en especial linfocitopenia. Por otro lado, el peso en los ratones expuestos disminuyó considerablemente hacia la tercera semana de administración de perclorato de amonio, lo cual podría indicar que esta sustancia tóxica genera un estado de inmunosupresión. Se evidenció leucopenia, específicamente neutropenia, neutrofilia y linfocitopenia como principales alteraciones en el recuento de leucocitos en ratones de la cepa ICR, expuestos a perclorato de amonio.

Palabras clave: Leucocitos; Inmunidad celular; Inmunosupresión; Toxicidad; Perclorato de amonio.

Abstract

The objective of this work was to identify the changes in the leukocyte counts in peripheral blood by ammonium perchlorate in ICR strain mice, evaluating the different exposure concentrations and differentiating the changes between males and females. Through an analytic experimental investigation, 60 ICR strain mice, 30 males and 30 females were used, 50 of which were exposed to ammonium perchlorate. This study was carried out by Resolution 008430/93, article 87 of Ministry of Health of Colombia. A total of 70% females and 83% males had changes in the leukocyte counts, especially lymphocytopenia in males, further, weight decreased the third week of treatment, and probably that toxic substance induces a state of immunosuppression. The main changes in the leukocyte counts in peripheral blood by ammonium perchlorate in ICR strain was leukopenia.

Keywords: Ammonium perchlorate; Leukocytes; Cellular immunity; Immunosuppression; Toxicity.

Resumo

O objetivo deste trabalho foi identificar as alterações na contagem de leucócitos em sangue periférico, geradas pela exposição a perclorato de amônio em camundongos da linhagem ICR, avaliando diferentes concentrações de exposição e diferenciando estas alterações entre machos e fêmeas. Isto foi realizado através de um trabalho de desenho analítico tipo experimental. Foram utilizados 60 camundongos da linhagem ICR, sendo 30 machos e 30 fêmeas, dos quais 50 foram expostos ao perclorato de amônio. O manuseio foi realizado conforme a resolução 008430 de 1993, artigo 87 do Ministério da Saúde da Colômbia. 70% dos camundongos fêmea e 83% dos machos apresentaram alterações na contagem celular dos leucócitos, especialmente a linfocitopenia em machos. Além disso, o peso nos camundongos expostos diminuiu en forma considerável para a terceira semana de tratamento com perclorato de amônio, o qual poderia indicar que esta substância tóxica gera um estado de imunossupressão. Houve evidência de leucopenia, especificamente neutropenia, neutrofilia e linfocitopenia como principais alterações na contagem de leucócitos em camundongos da linhagem ICR, expostos a perclorato de amônio.

Palavras-chave: Leucócitos; Imunidade celular; Imunossupressão; Toxicidade; Perclorato de amônio.

---

 

Introducción

El anión perclorato es un compuesto químico que proviene de fuentes naturales y antropogénicas; debido a su capacidad de generar reacciones en cadena altamente exotérmicas y finalmente explosivas, es utilizado como combustible de cohetes y misiles, luces de bengala, explosivos, baterías, sistemas de bolsas de aire de seguridad para automóviles, fertilizantes, entre otros ^(1-3).
En el ambiente el perclorato es muy estable químicamente, por lo que puede ser encontrado en agua, suelo y plantas, lo que hace que el riesgo de exposición de los humanos a este xenobiótico, sea elevado ⁽⁴⁾⁽⁵⁾. Diferentes estudios se han realizado alrededor del mundo, en los que se han evidenciado diversas fuentes de perclorato a las que están expuestos los organismos ⁽⁶⁾⁽⁷⁾.
Se ha propuesto que otra fuente de contaminación proviene de la degradación del hipoclorito, componente principal en gran variedad de desinfectantes y blanqueadores utilizados en la limpieza de instalaciones, empaques y utensilios relacionados con la producción de alimentos ⁽⁴⁾.
A nivel mundial se ha estudiado el perclorato como sustancia tóxica para el organismo, encontrando una amplia relación entre la exposición de éste y la alteración en la glándula tiroides, específicamente en la recaptación del yodo ^(1)(8)(9). La alteración química endocrina se puede presentar en el feto desde el momento de la gestación cuando se ha desarrollado una disfunción en la glándula tiroides secundaria a la exposición a perclorato ⁽¹⁾.
El contacto de organismos vivos con sustancias tóxicas genera una respuesta inmune, en la que intervienen gran número de células entre las que se encuentran linfocitos y monocitos ^(10)(11). Teniendo en cuenta su condición de xenobiótico, la exposición a perclorato de amonio podría desencadenar una respuesta inmune con alteración en los niveles de las células sanguíneas. Es escasa la información relacionada con el efecto de la exposición a perclorato en células de la línea blanca, por lo tanto, y teniendo en cuenta la evidencia de la frecuente exposición oral a este xenobiótico, el presente trabajo se planteó como objetivo general identificar las alteraciones en el recuento de leucocitos en sangre periférica generadas por la exposición oral a perclorato de amonio en ratones de la cepa ICR, el cual desde la experimentación animal fue abordado para establecer un posible efecto inmunotoxicológico secundario a la exposición.
Los resultados obtenidos dan cuenta del impacto inmunosupresor causado por la sustancia tóxica, efecto evaluado además desde un punto de vista nutricional, lo que aporta y abre la posibilidad de investigaciones futuras relacionadas con efectos del perclorato, así como el planteamiento de trabajos in vivo que aborden la problemática de la exposición a xenobióticos.

Materiales y Métodos

INVESTIGACIÓN ANALÍTICA DE TIPO EXPERIMENTAL.
El proyecto contempló actividades de tipo experimental que implicaron el uso de sustancias químicas en pequeña escala. Su realización fue avalada por el comité de bioética de la Universidad de Boyacá.

METODOLOGÍA
El estudio se realizó en una población homogénea conformada por 60 ratones de la cepa ICR, 30 hembras y 30 machos, de 42 días de nacidos y con un peso promedio para hembras de 16,6 g, con una desviación estándar de +/- 3,6 g, mientras que los machos tuvieron un peso promedio inicial de 18,6 g con una desviación estándar de +/- 4,0 g.
Los ratones provenían del mismo criadero y tenían aproximadamente la misma edad y peso al momento de iniciar el estudio. Los modelos experimentales se distribuyeron en dos conjuntos (hembra y macho), los cuales estuvieron conformados por 6 grupos de 5 ratones cada uno, elegidos en forma aleatoria.
Mediante un diseño experimental de bloques aleatorios se estableció el siguiente orden:

A. Organización de grupos experimentales
Grupo 1: Control negativo; no expuesto al tóxico.
Grupo 2: Dosis segura; el grupo recibió 0,7 μg kg/día de perclorato de amonio, dosis segura según la Agencia de Protección Ambiental de EE.UU ^(12)(13).
Grupo 3: Mitad de la dosis; al grupo se le suministró la mitad de la dosis segura de perclorato de amonio.
Grupo 4: Dosis duplicada; el grupo recibió el doble de la dosis segura de perclorato de amonio.
Grupo 5: Dosis quintuplicada; al grupo se le suministró la cantidad correspondiente a cinco veces la dosis segura de perclorato de amonio.
Grupo 6: Dosis decaplicada; el grupo recibió diez veces la dosis segura.

B. Adaptación del modelo animal a las condiciones del Bioterio durante 21 días
El modelo experimental llegó al Bioterio de la Universidad de Boyacá con una edad de 21 días, con el fin de realizar una adaptación de tres semanas hasta completar la edad de 42 días, condición requerida para el estudio. Este tiempo permitió que los ratones se adecuaran al ambiente, a la alimentación y a permanecer en un grupo.

C. Exposición a perclorato de amonio por 14 días
Tras la adaptación, se inició la administración oral de perclorato de amonio grado análisis R-A Chemical disuelto en agua potable. Teniendo en cuenta el peso de cada ratón se calculó la dosis respectiva que se debía administrar, con base en la dosis segura reportada por la Agencia de Protección Ambiental de EE.UU. (0,7 μg kg/día) ^(12)(13). El perclorato fue suministrado al modelo experimental durante 14 días, utilizando micropipetas p100 y puntas estériles que permitían controlar el consumo de la dosis para cada grupo. Durante el tiempo de tratamiento, se realizó un seguimiento semanal del peso de cada ratón.

D. Sangría y toma de muestra
Tras anestesia y mediante punción cardiaca, se tomó una muestra de sangre de cada ratón, con el fin de realizar un extendido de sangre periférica.

E. Procesamiento de muestras
Se realizó el conteo diferencial de leucocitos mediante extendido de una gota de sangre directa (sin anticoagulante) sobre lámina portaobjetos, secado al aire libre, fijado con metanol durante 1 minuto, sometido a coloración con Wright, lavado y secado al aire libre; posteriormente se adicionó una gota de aceite de inmersión y se procedió a la observación y diferenciación de las células blancas, realizando un conteo de cien leucocitos en microscopio óptico (Olympus CX31, Filipinas) con objetivo 100X o lente de inmersión, reportando porcentaje de neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, monocitos, etc., lo que permitió obtener un recuento relativo (%) de la línea blanca.
Paralelamente, para hacer el recuento total de leucocitos de manera absoluta, se tomaron 20 μL de sangre previamente recogida sobre anticoagulante (EDTA) liofilizado, y se diluyeron hasta 3,8 mL con líquido de Turk. Se cargó la cámara de Nuebauer y se dejó en reposo durante 10 minutos, después de los cuales se realizó conteo en el microscopio óptico (Olympus CX31, Filipinas) con objetivo 10X. El resultado absoluto de leucocitos (por mm3) se obtuvo multiplicando x 50 (teniendo en cuenta la dilución y la profundidad de la cámara) la cantidad de células blancas hallada.

CONDICIONES AMBIENTALES EN LAS QUE SE MANTUVIERON LOS RATONES
El tratamiento de los ratones se realizó teniendo en cuenta los principios éticos de investigación en animales (14) y la normatividad colombiana que indica que “los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad apropiada, y utilizar el mínimo número requerido para obtener resultados científicamente válidos ⁽¹⁵⁾”.
Los ratones fueron mantenidos en condiciones ideales de luz–oscuridad (12 h/12 h), temperatura (entre 20 ºC y 22 ºC) y ruido para reducir al mínimo el estrés. Estos parámetros fueron controlados gracias al equipo Enviro-GardTM-B 59016N, disponible en el bioterio de la Universidad de Boyacá. Cada grupo de ratones estuvo en un habitáculo previamente esterilizado, y se alimentó con LadDiet Rodent®. No hubo restricción de agua ni de alimentación.

EVALUACIÓN ESTADÍSTICA DE LOS RESULTADOS
Se llevó a cabo mediante análisis de varianza de un factor, diseño completamente aleatorizado, empleando el software estadístico SPSS 21.
Teniendo en cuenta que los datos pueden considerarse muestras aleatorias de poblaciones normales que poseen la misma varianza y si difieren en algo es solo en sus medias, se estableció la hipótesis de trabajo: “existe diferencia entre las medias debido a los tratamientos”. Mediante un análisis de ANOVA de un factor se determinó que hay diferencias entre las medias de los tratamientos y es significativa con un nivel de confianza de 0,95. Lo anterior se corroboró mediante las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey y Dunnett.

Resultados

GRUPO DE RATONES MACHO
La Tabla I presenta el recuento de leucocitos en ratones macho utilizados en la experimentación, mostrando el número de animales que presentó alteraciones o normalidad en los valores de leucocitos. El grupo control presentó entre 5000 y 12000 leucocitos/mm³, valores reportados como normales en estudios realizados en ratas ⁽¹⁶⁾. La Figura 1, correspondiente a los resultados de la prueba ANOVA, permitió evidenciar que hay diferencia de medias en el recuento celular (número de leucocitos) debido a los tratamientos, y estas diferencias son significativas.

Tabla I. Nivel de leucocitos en ratones macho utilizados en la experimentación.

Figura 1. Nivel de leucocitos en ratones macho utilizados en la experimentación.

Figura 2. Nivel de neutrófilos en ratones macho utilizados en la experimentación.

 

Tabla II. Nivel de neutrófilos en ratones macho utilizados en la experimentación.

Tal como ocurrió en el caso anterior, no se realizaron las pruebas post hoc (Tukey Dunnett) para el número de neutrófilos en machos.
La Tabla III describe el recuento de linfocitos en ratones macho utilizados durante el estudio, donde se observó la presentación de linfocitopenia y linfocitosis como alteraciones generadas por la exposición a perclorato de amonio. En la Figura 3 el ANOVA permite evidenciar que hay diferencia de medias en el recuento celular (número de linfocitos) debido a los tratamientos, y que estos valores son significativos.

Tabla III. Nivel de linfocitos en ratones macho utilizados en la experimentación.

Figura 3. Nivel de linfocitos en ratones macho utilizados en la experimentación.

El análisis de Tukey y Dunnett fue aplicado, corroborando los resultados obtenidos mediante el ANOVA (datos no mostrados).

GRUPO DE RATONES HEMBRA
La Tabla IV describe el recuento de leucocitos en ratones hembra expuestos a perclorato, evidenciando la presentación de anormalidades en el recuento de estas células, en todos los grupos expuestos a perclorato de amonio. Los individuos del grupo control mantuvieron niveles normales de leucocitos ⁽¹⁶⁾.

Tabla IV. Nivel de leucocitos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

La Figura 4 muestra la diferencia de medias en el recuento celular (número de leucocitos) debido a los tratamientos. Las diferencias encontradas fueron estadísticamente significativas. Mediante el análisis de Tukey y Dunnett se corroboraron los resultados del ANOVA (datos no mostrados).

Figura 4. Nivel de leucocitos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

En la Tabla V se presenta el recuento de neutrófilos en ratones hembra utilizados en la experimentación. No aplica ANOVA debido a que hay menos de dos grupos por variable dependiente, es decir número de neutrófilos en ratones hembra (Fig. 5).

Tabla V. Nivel de neutrófilos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

Figura 5. Nivel de neutrófilos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

La Tabla VI muestra el recuento de linfocitos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

Tabla VI. Nivel de linfocitos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

En la Figura 6 se plasman los resultados obtenidos por ANOVA evidenciando la diferencia de medias en el recuento celular (número de linfocitos debido a los tratamientos) y que éstas son significativas. Mediante Tukey y Dunnett fueron corroborados los resultados obtenidos por el ANOVA (datos no mostrados).

Figura 6. Nivel de linfocitos en ratones hembra utilizados en la experimentación.

Tomando como base los anteriores resultados, se encontró que:
• Se evidencian estados de leucopenia (Tabla I) en el 88% de ratones que fueron expuestos a perclorato de amonio. Adicionalmente, se observó una disminución de peso, en especial después de la segunda semana de tratamiento, y más evidente en los machos que en las hembras, en las que la leucopenia se presentó en un 64% de los individuos expuestos a perclorato (Tabla IV). Los grupos control negativo presentaron niveles normales de leucocitos.
• En machos, la mayoría de los individuos expuestos a perclorato de amonio, incluso a la dosis segura o a la mitad de ésta, presentaron alteración en el recuento de leucocitos. Por su parte, en el grupo de ratones hembra, la mayoría de animales expuestos a la mitad de la dosis segura no presentaron alteración en el número de leucocitos, pero los expuestos a la dosis segura y a dosis superiores, evidenciaron alteraciones en el recuento celular.
• Según las concentraciones de la sustancia tóxica, las alteraciones en el recuento celular de la línea blanca en cada grupo, fueron: leucocitosis, leucopenia, neutropenia, neutrofilia, monocitosis, monocitopenia, linfocitosis, linfopenia
• Los machos presentaron alteraciones en el recuento celular de la línea blanca en mayor porcentaje que las hembras, en especial linfopenia. Veintiocho ratones macho utilizados en el experimento mostraron esta alteración celular, de los cuales 25 fueron expuestos a perclorato de amonio, los tres restantes pudieron presentar esta alteración secundaria a la manipulación experimental (Tabla III).
• De los ratones expuestos en el experimento, 12 hembras tuvieron disminución de peso, lo que corresponde a un 40%. Ventiún machos presentaron disminución de peso, correspondiente al 70% de los mismos. El peso disminuyó entre la tercera semana de tratamiento y el final del experimento.

Discusión y Conclusiones

El perclorato de amonio es una sustancia tóxica ^(1)(4)(5)(8) que en condiciones normales genera una respuesta inmune adaptativa. Dada la alteración en el recuento leucocitario, específicamente en los linfocitos, y teniendo en cuenta la disminución de peso durante el tiempo de exposición al tóxico en los ratones (14 días), se puede sugerir que el perclorato de amonio estaría generando un estado de inmunodepresión.
Hay variaciones entre los tratamientos de este estudio, causadas por la exposición a perclorato de amonio; la principal alteración se observa en el recuento de leucocitos en ratones de la cepa ICR como leucopenia y de esta línea celular neutropenia, neutrofilia y linfopenia.
En ratones macho expuestos a perclorato de amonio se presenta mayor linfopenia en comparación con las hembras.
Las hembras en un 100% presentaron neutropenia. Esto puede estar asociado a los cambios sexuales propios del género, que se hacen más evidentes por la exposición a un tóxico, como el perclorato de amonio y a los cambios en el desarrollo sexual propios de la edad de las hembras.
La exposición a perclorato de amonio causa alteraciones en el organismo de los ratones expuestos, generadas principalmente por disminución en el peso, lo que se refleja en una deficiente respuesta inmune, evidente en trastornos como la linfopenia en donde los linfocitos juegan un papel importante en la respuesta adaptativa o específica.
Estos resultados abren la posibilidad de estudiar más a fondo los mecanismos inmunológicos que pueden verse alterados como respuesta a la exposición de agentes tóxicos como el perclorato de amonio.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a los integrantes del Semillero de Investigación en modelos animales IMAN, del Grupo de Investigación en Ciencias Básicas “NÚCLEO”. Igualmente agradecen a la Universidad de Boyacá por la financiación de esta investigación.

Referencias bibliográficas

1. Agency for Toxic Substances and Disease Registry - U.S. Department of Health and Human Services. Toxicological profile for perchlorates. Atlanta: Agency for Toxic Substances and Disease Registry; 2008.         [ Links ]

2. Agencia para sustancias tóxicas y el registro de enfermedades (ATSDR), División de toxicología y medicina ambiental. Resumen de salud pública percloratos. Atlanta: ATSDR; 2008.         [ Links ]

3. Foubister V. Chilean fertilizer leaves perchlorate legacy. Anal Chem 2006 Dic; 1: 7914-5.         [ Links ]

4. Maffini M, Trasande L, Neltner L. Perchlorate and diet: Human exposures, risks, and mitigation strategies. Curr Envir Health Rep 2016 Jun; 3 (2): 107-17.         [ Links ]

5. Steinmaus CM. Perchorate in water supplies: Sources, exposures, and health effects. Curr Envir Health Rep 2016 Jun; 3 (2): 136-43.         [ Links ]

6. Sánchez CA, Blount BC, Valentin-Blasini L, Lesch SM, Krieger RI. Perchlorate in the feed-dairy continuum of the Southwestern United States. J Agric Food Chem 2008; 56: 5443–50.

7. Lau FK, de Castro BR, Mills-Herring L, Tao L, Valentin- Blasini L, Alwis KU, et al. Urinary perchlorate as a measure of dietary and drinking water. J Expo Sci Environ Epidemiol 2013; 23 (2): 207-14.         [ Links ]

8. Arias GJ, Wiches A, Pedraza D. Análisis de la relación entre alteraciones del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides y exposición a perclorato en ratones de la cepa ICR. Nova 2013; 11 (19): 41-9.         [ Links ]

9. Dyke JV. Perchlorate and iodide in biological samples [Dissertation]. Lubbock (TX): Texas Tech Univ.; 2008.         [ Links ]

10. Chaplin DD. Overview of the immune response. J Allergy Clin Immunol 2010; 125 (2 supl 2): S3-23.         [ Links ]

11. Gómez F, Rueda Ardila N, Rodriguez Rodriguez J. La Inmunología en el Diagnóstico Clínico. 1ª. ed. Bogotá (COL): Centro Editorial Javeriano CEJA; 1994.         [ Links ]

12. Greer MA, Goodman G, Pleus RC, Greer SE. Health effects assessment for environmental perchlorate contamination: The dose-response inhibition of thyroidal radioiodide uptake in humans. Environ Health Perspect 2002; 110: 927-37.         [ Links ]

13. United States Enviromental Protection Agency USEPA [Internet]. USA: EPA Tecnical Fact Sheet – Perchlorate; 2014. Disponible en https://www.epa.gov/sites/production/files/2014-03/documents/ffrrofactsheet_contaminant_perchlorate_january2014_final.pdf. Actualizado enero 2014; fecha de acceso: 10 de julio de 2017.

14. Rodriguez E. Ética de la investigación en modelos animales de enfermedades humanas. Acta Bioethica. 2007; 13 (1): 25-40.         [ Links ]

15. República de Colombia, Ministerio de Salud. Normas científicas, técnicas y administrativas para la Investigación en Salud. Resolución 008430 de 1993.         [ Links ]

16. 3Rs-Centre Ultrecht Life Sciences [Internet]. Netherlands: Department of animals in science and society, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University; 2016 [citado 30 de junio 2017]. Disponible en: https://www.humane-endpoints.info/es/raton/parametros-fisiologicos. Fecha de acceso: 30 de junio de 2017.         [ Links ]

Recibido: 12 de diciembre de 2016
Aceptado: 26 de septiembre de 2017