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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957On-line version ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.52 no.2 La Plata June 2018

 

BIOLOGÍA MOLECULAR

Aseguramiento de Calidad en el Laboratorio de Biología Molecular: Control de Contaminación Ambiental

Quality Assurance in the Laboratory of Molecular Biology: Control of Environmental Contamination

Garantia de Qualidade no Laboratório de Biologia Molecular: Controle da Contaminação Ambiental

 

Quillen Amigo1, María Florencia Garbarello1, Eliana Maricel Otarola1, María Amelia Nardi1, Cecilia Ariana Frecha2, Aida Furci1, José Oyhamburu3

1 Bioquímica.
2 Lic. en Bioquímica. Doctor por la Universidad de Granada. Diploma de Estudios Avanzados en Inmunología Molecular y Celular. Investigador del CONICET. Hospital Italiano de Buenos Aires.
3 Bioquímico.
Laboratorio Central, Hospital Italiano de Buenos Aires, Argentina.

CORRESPONDENCIA Bioq. QUILLEN AMIGO Juan D. Perón 4190 C1181ACH CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES E-mail: docencia.laboratorio@hospitalitaliano.org.ar


Resumen

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la técnica más importante en Biología Molecular. Su principal deficiencia es la susceptibilidad a la contaminación de la muestra, ya sea con productos de amplificación generados en reacciones previas o con material genético proveniente de otras muestras. Se entiende por contaminación a la presencia indeseada de moléculas de ADN o ARN, que pueden actuar como templados en reacciones de amplificación. El objetivo del trabajo fue demostrar la importancia de la implementación de un control de contaminación ambiental periódico monitoreando la integridad del circuito de PCR. Para ello, se hisoparon puntos correspondientes a diferentes áreas de trabajo y se investigó la presencia de amplicones mediante PCR Real Time en Lighcycler 2.0, Roche® y Ampliprep Cobas s201, Roche®. En puntos críticos del circuito (flujo laminar o la cabina de seguridad del área de pre-PCR) no se detectaron amplicones, aunque sí se hallaron en las mesadas y heladeras. En el resto del circuito, la distribución de los amplicones fue variable. De esta forma se demuestra la importancia de la realización de un control de contaminación ambiental periódico en laboratorios que realizan la técnica de PCR, pudiendo detectar contaminación de forma precoz y tomar acciones correctivas a tiempo.

Palabras clave: Reacción en cadena de la polimerasa; Circuito de PCR; Contaminación por amplicones; Buenas prácticas de laboratorio; Laboratorio de biología molecular.

Abstract

Polymerase chain reaction (PCR) is the most important technique in Molecular Biology. Its main deficiency is susceptibility to contamination of the sample, either with amplification products generated in previous reactions or with genetic material from other samples. Contamination is understood as the undesired presence of DNA or RNA molecules, which may act as annealing in amplification reactions. The objective of this work is to demonstrate the importance of implementing a periodic environmental pollution control by monitoring the integrity of the PCR. To do this, different areas of work were swabbed and the presence of amplicons were investigated by Real Time PCR in Lighcycler 2.0, Roche® and Ampliprep Cobas s201, Roche®. At critical points in the circuit (laminar flow or pre-PCR area booth) no amplicons were detected, although they were found in countertops and refrigerators. In the rest of the circuit, the distribution of the amplicons was variable. Thus, the importance of conducting a periodic environmental contamination control in laboratories that perform the PCR technique is demonstrated, enabling early detection contamination and corrective actions being taken on time.

Key words: Polymerase chain reaction; PCR circuit; Amplicon contamination; Good laboratory practice; Molecular biology laboratory.

Resumo

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica mais importante em Biologia Molecular. Sua principal deficiência é a suscetibilidade à contaminação da amostra, seja com produtos de amplificação gerados em reações prévias ou com material genético em reações prévias ou com material genético proveniente de outras amostras. Entende-se por contaminação a presença não desejada de moléculas de DNA ou ARN, que podem agir como temperados em reações de amplificação. O objetivo do trabalho foi demonstrar a importância da implementação de um controle de contaminação ambiental periódico monitorando a integridade do circuito de PCR. Para isso, se fez esfregaço de pontos correspondentes a diferentes áreas de trabalho e foi investigada a presença de amplicons mediante PCR Real Time em Lighcycler 2.0, Roche® e Ampliprep Cobas s201, Roche®. Em pontos críticos do circuito (fluxo laminar ou a cabine de segurança da área de pré-PCR), não foram detectados amplicons, apesar de serem encontrados nas bancadas e refrigeradores. No resto do circuito, a distribuição dos amplicons foi variável. Assim mostra a importância da realização de um controle de contaminação ambiental periódico em laboratórios que realizam a técnica de PCR, podendo detectar a contaminação de forma precoce e tomar ações corretivas a tempo.

Palavras-chave: Reacção em cadeia da polimerase; Circuito de PCR; Contaminação por amplicons; Boas práticas de laboratório; Laboratorio de biologia molecular.


 

Introducción

El Laboratorio de Biología Molecular se basa fundamentalmente en el empleo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Esta reacción fue descubierta en 1986 por K. Mullis y consiste en la amplificación in vitro del ADN por medio de una reacción enzimática específica (1). La implementación de esta técnica en el laboratorio bioquímico clínico fue revolucionaria por su rapidez y versatilidad (2). Además, es altamente específica y sensible por lo que requiere mínima cantidad de muestra para su realización (3). Es justamente, debido a esta elevada sensibilidad analítica, que el principal riesgo de la PCR es su susceptibilidad a la contaminación (4).
En el laboratorio de Biología Molecular la contaminación se define como la presencia indeseada de moléculas de ADN o ARN, que pueden actuar como templados en las reacciones de amplificación (5). Esto podría llevar a la necesidad de realizar repeticiones de los procedimientos, con su consecuente costo económico e, incluso, derivar en problemas diagnósticos como son los resultados falsos positivos (3).
Si bien la contaminación es un fenómeno que suele ser subestimado, ya en 1988 se reportó por primera vez un resultado falso positivo en la detección de genoma del Virus de la Hepatitis B por esta problemática (5). A partir de entonces numerosos artículos fueron publicados describiendo este fenómeno y proponiendo pautas de trabajo para evitar su efecto negativo sobre la seguridad del paciente (6).
Las diferentes fuentes de contaminación reportadas incluyen el pasaje accidental de material genético de una muestra a otra, la presencia de ácidos nucleicos foráneos en reactivos o personal de laboratorio y la contaminación del ambiente por productos de amplificación generados en reacciones previas (amplicones) (7). Éstos representan la principal fuente de contaminación del laboratorio de Biología Molecular debido a su estabilidad y elevada producción en cada reacción.
En el Laboratorio de Biología Molecular de este hospital se procesan alrededor de 8.000 muestras por mes y, siguiendo las recomendaciones dirigidas a los laboratorios clínicos que realizan PCR(3), el sector se encuentra organizado en áreas de trabajo físicamente separadas, donde cada una cuenta con su propio instrumental como ser vórtex, centrífugas, pipetas y tips. Asimismo, el flujo de trabajo es unidireccional, es decir, desde la zona de "pre-PCR" a la de "post-PCR". En
el área de "pre-PCR" se prepara la master mix (mezcla que contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación) y es una zona libre de material genético. El área de "post-PCR" es aquella donde se realiza la amplificación de los ácidos nucleicos, por lo que es la región que contiene mayor cantidad de amplicones. Por otro lado, la mayoría de las determinaciones que se realizan en el laboratorio de Biología Molecular son automatizadas y con un sistema cerrado, lo que disminuye la producción de aerosoles y la posible contaminación con amplicones (8). Para degradar los amplicones generados, diariamente se emplea luz UV en las diferentes salas y equipos (9), y para reforzar este proceso en las plataformas de amplificación automatizadas se utiliza el método de descontaminación con Uracil-N-glicosilasas (UNG). De esta manera se disminuye la probabilidad de que amplicones generados en reacciones previas funcionen como nuevos templados (10). Otra medida importante que el laboratorio está implementando desde 2009 es la realización de un control de contaminación ambiental de forma periódica para sensar la presencia de amplicones en el ambiente de trabajo.
Es importante tener en cuenta que las acciones preventivas anteriormente citadas no garantizan la total ausencia de amplicones contaminantes y que ningún método de descontaminación es totalmente efectivo (7). Por esa razón, el presente trabajo tiene como objetivo demostrar la importancia de la implementación de un control de contaminación ambiental periódico a fin de detectar la presencia de contaminación de forma precoz y así tomar acciones correctivas a tiempo.

Materiales y Métodos

En septiembre de 2016 se llevó a cabo en el laboratorio de Biología Molecular de este hospital, un control ambiental con el fin de detectar posible material genético contaminante.

ÁREAS INVOLUCRADAS
En la Figura 1 se detallan los nueve puntos de control correspondientes a las diferentes áreas de trabajo del laboratorio en las que se censó la presencia de amplicones.


Figura 1

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
Se utilizaron simultáneamente tres hisopos de Dacron previamente humedecidos en agua libre de ADNasas/ ARNasas ("agua free") para la recolección de muestras en cada punto de control. El procedimiento se realizó respetando el flujo de trabajo unidireccional y fue llevado a cabo por un mismo operador en todas las oportunidades para estandarizar la toma de muestra. Los tres hisopos de cada punto de control fueron colocados en tubos Falcon con 1.400 μL de "agua free" y posteriormente se utilizó el vórtex para inducir la liberación del material recolectado. Se obtuvo un total de nueve tubos, que luego fueron utilizados para llevar a cabo las reacciones de amplificación.

AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS
En todas las muestras recolectadas se realizó la búsqueda de amplicones del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), Hepatitis C (HCV) y Hepatitis B (HBV) por PCR en tiempo real (multiplex), empleando la prueba Cobas TaqScreen MPX en la plataforma Ampliprep Cobas s201 de Roche®. Asimismo, se estudiaron por PCR en tiempo real los amplicones de Citomegalovirus (CMV), beta globina y Enterococo Vancomicina Resistente (EVR) en LightCycler 2.0 (Roche®). Para CMV y beta globina se utilizaron los kits comerciales de TibMolbiolLightMix® Kit CMV EC y LightMix® Kit Beta Globin Extraction Control, respectivamente. En ambos casos se emplearon además para la preparación de la master mix los reactivos de Roche del kit LightCycler®FastStart DNA Master HybProbe. Para la determinación de EVR se emplearon los reactivos de LightCycler VRE Detection Kit (Roche®).
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo establecido por el fabricante y bajo las mismas condiciones en que se procesan las muestras clínicas. Por lo tanto, se emplearon 1.100 μL de muestra para la técnica multiplex y 5 μL para CMV, EVR y beta globina, respectivamente. Para la preparación de la master mix se utilizaron primers, sondas, MgCl2, enzima Taq polimerasa y agua free en las cantidades y concentraciones descritas en el inserto comercial.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
Luego de concluidos los ciclos de amplificación para cada analito, se verificó en los programas de los equipos correspondientes la presencia o ausencia de una curva de amplificación para cada muestra, lo cual permitió discernir los resultados positivos de los negativos respectivamente. Los resultados se organizaron en Tablas y en el caso de los positivos, se registró para cada curva el valor de Cp (crosspoint) obtenido. Este valor indica el número de ciclo de la PCR al cual la fluorescencia detectada supera la fluorescencia basal, por lo tanto, se entiende que cuanto menor es el Cp mayor es la carga inicial de la secuencia en estudio.

Resultados

HALLAZGOS GENERALES
Se observó que en puntos críticos del circuito, como el flujo laminar o la cabina de seguridad del área de pre-PCR no se detectaron amplicones, aunque sí se hallaron en las mesadas y heladeras del área. En el resto del circuito, la distribución de los amplicones fue variable.
El detalle de los resultados obtenidos y los valores de Cp de la PCR para cada analito en los distintos puntos de control se presentan en la Tabla I.

Tabla I. Detalle de los Cp (crosspoint) obtenidos para cada determinación en los distintos puntos en los que se realizó el control de contaminación ambiental.

MEDIDAS CORRECTIVAS ADOPTADAS
Ante estos resultados, se decidió aplicar las siguientes acciones correctivas:
1. Implementación de un protocolo reforzado de limpieza. El protocolo consiste en utilizar un paño embebido con NaClO al 5% sobre las superficies, luego eliminar sus residuos con agua y finalmente utilizar isopropanol al 70%. A partir de entonces,
este procedimiento se realiza de manera complementaria a la limpieza diaria de las superficies, que consiste en el empleo de isopropanol al 70% y la utilización de luz UV en todo el circuito.
2. Reentrenamiento del personal. En el laboratorio no sólo participan los operadores y profesionales de Biología Molecular, sino también el personal de limpieza, por lo que todos fueron debidamente reentrenados en el cumplimiento del circuito de PCR y en la importancia de las buenas prácticas de trabajo.

Un mes después de la implementación de las medidas correctivas, se repitió el control de contaminación ambiental, siguiendo el mismo procedimiento descrito previamente. En este caso se observó la negativización de la mayoría de los amplicones hallados en el primer control, a excepción de los de HIV y beta globina. Sin embargo, estos últimos fueron detectados en concentraciones menores a las iniciales, lo que se reflejó en sus valores de Cp (Tabla II).

Tabla II. Resultados obtenidos luego de la descontaminación para cada determinación en los distintos puntos en los que se realizó el control, con sus correspondientes valores de Cp (crosspoint) obtenidos.

ANÁLISIS DEL IMPACTO CLÍNICO ASOCIADO A LA CONTAMINACIÓN DETECTADA
A fin de evidenciar si la presencia de contaminación tuvo impacto sobre los resultados clínicos emitidos, se realizó un análisis retrospectivo de los controles negativos que se procesaron en los diez meses previos al inicio del estudio, correspondientes a los seis analitos involucrados. Para HIV, HCV, HBV y EVR no se observó positivización del control negativo durante el período estudiado, pero sí se observó un caso de amplificación del control negativo para CMV y otro para beta globina. En ambos casos se procesaron nuevamente las muestras y los controles, tal como se establece en los procedimientos estandarizados del laboratorio, y se obtuvo la negativización del control negativo, con lo que se pudo validar la corrida.
Teniendo en cuenta que a lo largo de los diez meses de estudio se registraron 226 controles negativos para CMV y 243 para beta globina, los controles invalidados por positivización representaron sólo un 0,44% y 0,41% respectivamente, lo cual no se considera un porcentaje significativo. Además, sabiendo que al reprocesar la corrida los controles arrojaron los resultados esperados y los de las muestras fueron coincidentes con los iniciales, se puede inferir que la presencia de amplicones en el Laboratorio no tuvo impacto en los resultados clínicos.

CONSERVACIÓN DE LA INTEGRIDAD DEL CIRCUITO DE PCR TRES MESES DESPUÉS
Luego de tres meses de realizado el segundo control de contaminación, se llevó a cabo un tercer control para hacer un seguimiento de los analitos que persistieron (HIV y beta globina). Se detectaron secuencias de HIV sólo en el área de post PCR, mientras que beta globina se halló a lo largo del circuito en mesadas y heladeras. Los resultados globales de los tres controles de contaminación que se realizaron permiten documentar que las medidas correctivas implementadas fueron efectivas para lograr una disminución significativa de los amplicones y que esta situación se mantuvo a lo largo del tiempo (Tabla III).

Tabla III. Resultados globales en Cp (cross point) de las PCR correspondientes a los tres controles de contaminación que se llevaron a cabo. Los valores entre barras representan los resultados del primer, segundo y tercer control para cada amplicón buscado.

Discusión y Conclusiones

Para el aseguramiento de la calidad en el laboratorio de Biología Molecular es fundamental respetar el circuito de PCR y contar con controles de calidad internos (QCI) y externos (QCE). El Laboratorio Central del Hospital Italiano de Buenos Aires incluye dentro de sus QCI un control de contaminación ambiental semestral para sensar la presencia de amplicones. Con el fin de demostrar la importancia de su implementación, se exponen los resultados obtenidos en los últimos tres controles realizados.
El primero de ellos refleja la presencia de amplicones en gran parte de las áreas estudiadas del laboratorio. Si bien no es inesperada su presencia en el área de post PCR, ya que es el sector en el que se llevan a cabo las reacciones de amplificación, sí lo es en el resto de las áreas y especialmente en la sala de pre PCR, donde se evidenció la presencia de cuatro de los seis analitos estudiados.
Los amplicones de HIV fueron los más ampliamente distribuidos a lo largo del circuito, lo que podría deberse a que en el laboratorio se realizan tres determinaciones que llevan a su generación: la determinación cualitativa del genoma del virus, su cuantificación y su genotipificación, que se lleva a cabo manualmente e implica una PCR nested.
Los resultados expuestos a partir del segundo control de contaminación evidencian que el refuerzo en los protocolos de limpieza y el reentrenamiento del personal en las buenas prácticas de trabajo, fueron exitosos para disminuir la carga de amplicones en el ambiente. Esto se infiere a partir de la negativización de gran parte de los analitos buscados. Aquellos que persistieron lo hicieron en concentraciones menores a las iniciales, lo que se vio reflejado en el aumento de los valores de "Cp".
Ante estos resultados, se realizó el análisis retrospectivo de los controles negativos de las determinaciones implicadas para evidenciar si la presencia de contaminación tuvo impacto en los resultados clínicos emitidos. El análisis demostró que los niveles de contaminación presentes no fueron suficientes como para afectar significativamente los resultados de los controles que se realizaron en los últimos diez meses. Por consiguiente, se asegura la confiabilidad de los resultados clínicos emitidos durante ese período. Este hallazgo resulta de importancia, ya que en muchos laboratorios sólo se utiliza como indicador de contaminación la positividad a repetición del control negativo presente en cada corrida. A partir de un control de contaminación periódico es posible anticipar esta situación que suele ser difícilmente reversible.
En este trabajo se propone utilizar el control de contaminación ambiental como Indicador de Calidad para los laboratorios de Biología Molecular. Posee las ventajas de ser un procedimiento sencillo, versátil y de bajo costo relativo. Cada laboratorio deberá evaluar los analitos que serán incluidos en su control y la periodicidad del mismo, según la dinámica de trabajo. En este caso, se realizó la búsqueda de amplicones de HCV debido a que las muestras de personas infectadas con este virus suelen presentar elevada carga viral y además se trata de una determinación que se procesa diariamente junto a las de HIV y HBV en el Banco de Sangre del laboratorio. Como CMV y EVR también tienen la misma frecuencia de procesamiento, ambas determinaciones fueron consideradas en el control ambiental. La beta
globina se incluyó en el estudio, debido a que se utiliza como control de extracción en algunas determinaciones, evidenciando la presencia de material genético. Es una determinación importante en la validación de los resultados negativos, por lo que un resultado falso positivo tendría una gran implicancia diagnóstica.
Es importante tener en cuenta que no se encontraron en la bibliografía consultada límites de contaminación aceptables para los laboratorios que realizan la técnica de PCR, por lo que los presentes resultados no pueden ser contrastados con otros valores. Asimismo, si bien son conocidas las medidas para prevenir la contaminación, no existen protocolos oficiales publicados de control de contaminación ambiental específicos para laboratorios de Biología Molecular.
Se considera de interés para la comunidad clínica e investigadora que se establezcan valores de corte y pautas para el diseño de estrategias de screening que permitan evaluar la presencia de amplicones en el laboratorio.
Implementar un control de contaminación ambiental periódico resulta fundamental para la confiabilidad de los resultados emitidos y, en el caso de los laboratorios clínicos, para garantizar la seguridad del paciente evitando posibles errores en Medicina (11). Asimismo, previene situaciones que podrían llevar a grandes costos, como el reprocesamiento de muestras, descontaminaciones intensivas e incluso, la necesidad de suspender prácticas de laboratorio.
Este trabajo refleja el impacto positivo que generó en el Laboratorio del Hospital Italiano la implementación de este proceso de mejora de la calidad y pretende dar cuenta de la importancia de su utilización en todos los Laboratorios de Biología Molecular.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Laboratorio Central del Hospital Italiano, y especialmente al área de Biología Molecular, y quieren hacer un agradecimiento especial a los miembros del Departamento de Investigación, Área de Investigación no patrocinada por su guía y colaboración en la escritura de este proyecto.

Referencias bibliográficas

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