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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957On-line version ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.52 no.2 La Plata June 2018

 

INMUNOLOGÍA

Desialización eritrocitaria por larvas recién nacidas de Trichinella spiralis incubadas in vitro

Erythrocyte desialylation by Trichinella spiralis newborn larvae incubated in vitro

Dessialização eritrocitária por larvas recém-nascidas da Trichinella spiralis incubadas in vitro

 

Patricia Ponce de León1a

1 Doctora en Ciencias Biomédicas.
a Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.

CORRESPONDENCIA Dra. PATRICIA PONCE DE LEÓNÁrea Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario. Suipacha 531 2000 ROSARIO, Argentina E-mail: tefu1958@hotmail.com


Resumen

Trichinella spiralis es la especie que causa la mayoría de los casos de infección humana en todo el mundo. Se comunicó que el contacto de los eritrocitos con concentrados de larvas recién nacidas (LRN) no viables provoca la disminución de ácido siálico globular. El objetivo del trabajo fue estudiar la desialización eritrocitaria producida por LRN mantenidas en cultivo. Se realizaron 2 experiencias en las que se incubaron 80 larvas con 100 μL de eritrocitos en 1 mL de medio RPMI suplementado durante 1, 2, 3, 4 y 24 horas a 37 ºC. Se aplicó el Método de Titulación de la Agregación por Polibrene y se calculó Título, Score Total y CexpCASP en los eritrocitos control e incubados con LRN. Los resultados mostraron que en la primera y segunda hora la captación de ácido siálico fue moderada. A las 3 horas el título disminuyó significativamente en relación al del control y el CexpCASP (0,14±0,014) indicó la pérdida casi total de ácido siálico globular. Ambos valores se mantuvieron a las 4 y 24 horas. Al comparar con estudios similares realizados con larvas infectantes, se sugiere que, in vivo, las LRN captarían más rápidamente el ácido siálico que las larvas musculares.

Palabras clave: Desialización eritrocitaria; Larvas recién nacidas; Cultivo.

Abstract

Trichinella spiralis is the species that causes most human cases of infection in the world. It was reported that contact of erythrocytes with concentrates of non-viable newborn larvae (NL) causes the decrease in erythrocyte sialic acid. The objective was to study erythrocyte desialylation produced by NL maintained in culture. Two experiments were conducted, in which 80 larvae were incubated with 100 μL of erythrocytes in 1 mL of supplemented RPMI medium for 1, 2, 3, 4 and 24 hours at 37 ºC. Titration of Aggregation by Polybrene Method was used and Title, Total Score and CexpCASP were calculated in Control erythrocytes and erythrocytes incubated with NL. The results showed that the sialic acid capture was moderated in the first and second hour. At three hours of incubation, the Title decreased significantly in relation to Control and CexpCASP (0.14±0.014) indicated almost total loss of erythrocyte sialic acid. Both values were maintained at 4 and 24 hours. When compared to similar studies conducted with infective larvae, it is suggested that, in vivo, NL would capture sialic acid faster than muscle larvae.

Keywords: Erythrocyte desialylation; Newborn larvae; Culture.

Resumo

Trichinella spiralis é a espécie que causa a maioria dos casos de infecção humana em todo o mundo. Comunicou-se que o contato dos eritrócitos com concentrados de larvas recém-nascidas (LRN), não viáveis, provoca a diminuição de ácido siálico globular. O objetivo do trabalho foi estudar a dessialização eritrocitária produzida por LRN mantidas em cultivo. Foram realizadas duas experiências nas quais se incubaram 80 larvas com 100 μL de eritrócitos em 1 mL de meio RPMI suplementado durante 1, 2, 3, 4 e 24 horas a 37 °C. Foi aplicado o Método de Titulação da Agregação por Polibreno e se calculou Título, Pontuação Total (ST) e CexpCASP nos eritrócitos. Os resultados mostraram que na primeira e segunda hora a captação de ácido siálico foi moderada. Às 3 horas o título diminuiu significativamente em relação ao do controle e o CexpCASP (0,14±0,014) indicou a perda quase total de ácido siálico globular. Ambos os valores se mantiveram às 4 e 24 horas. Ao comparar com estudos similares realizados com larvas infetantes, sugere-se que, in vivo, as LRN captariam mais rapidamente o ácido siálico que as larvas musculares.

Palavras-chave: Dessialização eritrocitária; Larvas recém-nascidas; Cultura.


 

Introducción

La trichinellosis es una enfermedad parasitaria transmisible al hombre por el consumo de carne de cerdo cruda o insuficientemente cocida, presas de caza infectadas o salazones preparadas con estas materias primas. El agente causal es un nematodo filiforme perteneciente al género Trichinella que abarca varias especies con diferente distribución geográfica, siendo T. spiralis la especie que causa la mayoría de los casos de infección humana en todo el mundo.
El ciclo de vida de este nematodo es de tipo autoheteroxeno lo que significa que el mismo hospedador alberga a las formas adultas, a las larvales recién nacidas y a las larvales musculares que serán infectantes para un nuevo hospedador. Las larvas musculares infectantes habitan en las fibras del músculo estriado de los animales afectados. Cuando la carne de estos animales es consumida la digestión estomacal las libera, permitiéndoles evolucionar hasta parásitos adultos en el intestino delgado. Los nematodos adultos copulan y las hembras depositan larvas recién nacidas (LRN) en la mucosa intestinal, que se distribuyen por todo el cuerpo mediante la circulación linfática y sanguínea, pero solamente aquellas que llegan al músculo estriado pueden continuar su evolución para alcanzar la capacidad infectante (1).
La patogenicidad de T. spiralis es mayor que la del resto de las especies del género debido a que las hembras producen el número más alto de larvas recién nacidas (2). En el ciclo biológico las LRN establecen un íntimo contacto con los glóbulos rojos del hospedador durante la migración por el torrente sanguíneo, por lo que es importante estudiar el efecto que producen sobre la desialización eritrocitaria.
Experiencias previas comunicaron que el contacto de los eritrocitos con concentrados de LRN no viables provoca la disminución de ácido siálico globular, ocasionando alteraciones en la agregación eritrocitaria y en el comportamiento hemorreológico de la sangre (3) (4), así como también exposición del antígeno críptico T (5)(6). El objetivo de este trabajo fue estudiar la desialización eritrocitaria producida por LRN mantenidas en cultivo.

Materiales y Métodos

Muestras
LARVAS RECIÉN NACIDAS T. spiralis (LRN)
Se trabajó con ratones CBi infectados con T. spiralis, provistos por el Bioterio del Instituto de Genética Experimental de la Facultad de Ciencias Médicas (UNR). Entre los 6 y 13 días post-infección, se obtuvieron hembras grávidas del intestino delgado de los ratones por cirugía, las cuales fueron incubadas en 100 μL de medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino y 250 μg/mL de gentamicina durante 18 horas a 37 ºC en atmósfera de 5% de CO2. Posteriormente, las LRN fueron separadas de las hembras adultas y recolectadas en el mismo medio (7). Se realizó el recuento, por duplicado, en microscopio óptico y se determinó que la concentración era 4000±200 LRN/ mL.
Los protocolos para la obtención de LRN son utilizados en líneas de investigación de las Facultades de Ciencias Médicas y de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR), los cuales han sido aprobados por los Comités de Bioética de ambas instituciones.

GLÓBULOS ROJOS EN MEDIO SALINO (GR)
Se trabajó con suspensiones de eritrocitos frescos Grupo O provenientes de dadores sanos voluntarios, lavados 3 veces en solución salina.
Métodos

INCUBACIÓN DE LOS GR
Se realizaron 2 experiencias, preparando en cada una de ellas 6 tubos de tapa a rosca con 1 mL de medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino y 250 μg/mL de gentamicina. A todos se les agregaron 100 µL del sedimento globular. En 5 de ellos se adicionaron 20 µL del concentrado larval (aproximadamente 80 LRN) y el restante fue utilizado como control.
Los tubos se incubaron a 37 °C en atmósfera de CO2. A los tiempos de incubación: 1, 2, 3, 4 y 24 horas, se retiró uno de los tubos sembrados con LRN, así como también 20 µL del sedimento globular del tubo control. Los eritrocitos fueron lavados en solución fisiológica y se prepararon suspensiones al 20% a partir de cada uno de los sedimentos.

MÉTODO DE TITULACIÓN DE LA AGREGACIÓN POR POLIBRENE
El método se aplicó simultáneamente en los GR control y en los mismos eritrocitos incubados con LRN. Se hicieron diluciones seriadas progresivas del polibrene en solución salina (Puro, 1/2; 1/4; 1/8……1/128). A continuación se colocaron, en una placa de vidrio 1 gota de la suspensión eritrocitaria al 20% y 1 gota de cada una de las diluciones del polibrene. Se mezcló con varilla de vidrio y se homogeneizó por movimientos circulares de la placa durante 1 minuto, hasta que se produjo la agregación entre los eritrocitos con carga negativa y el policatión polibrene (8).
Se evaluó la carga aniónica del control y de los GR incubados con las LRN, determinando el título como la última dilución del policatión que presentó agregación. Se consideró significativa una diferencia de título ≥2 diluciones entre ambos (9).
ón de los glóbulos incubados con LRN, en relación a la del respectivo control, se la semicuantificó con cruces (4+, 3+; 2+: 1+; +/-; -) y se asignó un score a cada una según Goudemand y Marsalet (10), de acuerdo con la siguiente escala:

4+ 10
3+ 8
2+ 5
1+ 2
+/- 1 (agregación apenas visible)

Se determinó el coeficiente experimental de captación de ácido siálico por el parásito usando el método de polibrene (CexpCASP) como el cociente entre el score total de la agregación (ST) de los eritrocitos incubados con las LRN y el score de la agregación de los eritrocitos control (9).

Donde score Total= Σ Si Si: score individual
Este coeficiente es igual a 1 cuando no hay modificación de ácido siálico por acción del parásito y es igual a 0 cuando el tratamiento ocasiona la pérdida total del ácido siálico del eritrocito, o sea que la captación del mismo es máxima.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Se calculó el valor de la media y de la desviación estándar para cada tiempo de incubación con los 2 valores de CexpCASP obtenidos, a los fines de establecer si los valores incluidos en el rango de dispersión del coeficiente para cada tiempo también estaban en el rango de dispersión del coeficiente de los dos tiempos inmediatos (11).

Resultados

Los resultados en la primera hora de incubación de los eritrocitos con las LRN, mostraron que el título no se modificó en relación al del control, si bien hubo una moderada disminución del ST de agregación, siendo el CexpCASP 0,66±0,007 (media ± desviación estándar).
Los GR incubados con las larvas durante 2 horas presentaron un valor promedio del coeficiente semejante al del tiempo anterior (0,61±0,007), aunque el título fue menor en 1 dilución (disminución no significativa).
A las 3 horas de incubación el título de los eritrocitos en contacto con LRN descendió 2 diluciones con respecto al control y el CexpCASP disminuyó marcadamente (0,14±0,014). Ambos valores no sufrieron modificaciones en los 2 tiempos siguientes de incubación (4 y 24 horas).
El Título y el ST de los GR Control se mantuvo en todos los tiempos. Los resultados se observan en la Tabla I y en la Figura 1.

Tabla I. Valores de Título, Score Total de la agregación y CexpCASP para cada tiempo de incubación


Figura 1
.

Discusión y Conclusiones

La trichinellosis producida por T. spiralis es un problema a nivel mundial y constituye una de las principales zoonosis de América Latina. La primera comunicación de un caso humano en Argentina fue en 1879 (12) y desde entonces constituye un grave problema de salud pública, considerándosela una enfermedad endémica con picos epidémicos. Se especula que el parásito llegó al continente americano desde el europeo a través de los animales que se transportaban en los barcos durante el siglo XV y siguientes. La primera demostración del género Trichinella en América Latina fue en 1863, a partir de un cerdo adquirido en Valparaíso, Chile, por la tripulación de un barco alemán, identificándose el parásito en la carne consumida y en uno de los marineros fallecido (13).
Durante su ciclo biológico, las hembras ovovivíparas de este nematodo liberan LRN aproximadamente a los 7 días de la infección, las cuales pasan al torrente sanguíneo y sistema linfático para diseminarse en el cuerpo (14). Las LRN, por lo tanto, establecen contacto con los eritrocitos de su hospedador durante su migración hasta ubicarse finalmente en los músculos estriados de mayor actividad, donde se enquistan.
Experiencias previas comunicaron la disminución de ácido siálico globular por contacto con LRN, no viables (3)(4), y la exposición del criptoantígeno T eritrocitario por la desialización producida por estas larvas (5)(6).
Los ácidos siálicos pertenecen a una familia de azúcares que se localizan en las posiciones terminales de una gran variedad de glucoconjugados. Naturalmente, muestran una inmensa diversidad de estructuras que reflejan su participación en importantes procesos biológicos de crecimiento y desarrollo, tanto normal como patológico (15)(16). En la actualidad se reconoce la existencia de más de 50 estructuras de ácidos
siálicos, hecho que no sucede con ningún otro monosacárido, los cuales están distribuidos en vertebrados, invertebrados, bacterias y virus, aunque no se han encontrado en vegetales (17). Estos azúcares juegan un papel destacado regulando los procesos de reconocimiento celular y molecular, dado que en diversas situaciones son componentes esenciales de receptores implicados en la transducción de señales. Pueden funcionar también como enmascaradores biológicos, que por efectos estéricos y/o de repulsión electrostática, pueden impedir o reducir la accesibilidad de los ligandos a sus receptores sobre la superficie celular. Es reconocida también su influencia sobre la estructura de macromoléculas y sobre la especificidad de antígenos, así como su papel de protección frente a ataques enzimáticos, por lo que la participación de los ácidos siálicos en la composición de los glicoconjugados determina, al menos de modo parcial, sus funciones (17). Los ácidos siálicos participan activamente en la respuesta inmune.
La experiencia mostró que, en la primera hora de incubación, si bien no se modificó el título de agregación de los eritrocitos control, hubo una moderada disminución de ácido siálico (CexpCASP=0,66±0,007), la cual fue similar a la visualizada a las 2 horas, donde se observó también el descenso no significativo del título en 1 dilución. Si se compara con una experiencia similar, en la que se cultivaron 60 larvas musculares vivas (LM) de T. spiralis con eritrocitos (18), se observa que en la primera hora de incubación no se produjo la captación de ácido siálico por las LM (media±desviación estándar de CexpCASP=0,97±0,052) y que recién a las 3 horas se pudo observar la reducción del Título del Control en una dilución y la moderada disminución del coeficiente (0,62±0,021).
Las LRN vivas a las 3 horas de incubación provocaron la disminución del Tìtulo del Control en 2 diluciones y captaron casi la totalidad del ácido siálico, tal como evidenció el CexpCASP (0,14±0,014). Ambos valores se mantuvieron en los tiempos de incubación siguientes, mientras que las LM recién a las 24 horas de contacto con los eritrocitos, lograron la mayor captación de ácido siálico (CexpCASP =0,13±0,093) (18).
La experiencia realizada sugiere que, in vivo, las LRN captarían más rápidamente el ácido siálico que las LM. Debido a las funciones biológicas que tiene este glucoconjugado, podría ser utilizado por T. spiralis para la evasión de la respuesta inmune del hospedador. En este contexto sería lógico que la velocidad de captación de ácido siálico por las LRN fuese mayor, ya que circulan alrededor de 24 horas por sangre hasta arribar a su localización definitiva (19), mientas que las LM que tienen contacto con los eritrocitos por la intensa vascularización de la célula nodriza, pueden permanecer enquistadas y viables durante meses o años (20).

Referencias bibliográficas

1. Caracostantogolo J, Martínez M. Epidemiología de la trichinellosis y situación en la Argentina. Vet Argent 2009; 26 (257). Disponible en: http://www.produccion-animal.com.ar/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/parasitarias/parasitarias_cerdos/08-Trichinellosis.pdf. (Fecha de acceso: 5 de diciembre de 2017).         [ Links ]

2. Pozio E, KD Murrell. Systematics and epidemiology of Trichinella. Adv Parasitol 2006; 63: 367-439.         [ Links ]

3. Ponce de León P, Fernandez A, Racca L, Vasconi MD. Alteración de la agregación eritrocitaria por larvas recién nacidas de Trichinella spiralis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2015; 49 (4): 417-23.         [ Links ]

4. Ponce de León P, Toderi M, Castellini H, Riquelme B. In vitro alterations of erythrocyte aggregation by action of Trichinella spiralis newborn larvae. Clin Hemorheol Microcirc 2017; 65: 195–204.

5. Ponce de León P, López Murúa G. Desenmascaramiento del antígeno T eritrocitario por efecto de larvas recién nacidas de Trichinella spiralis. Divulgación de la Producción Científica y Tecnológica. E-Book. 1° ed. Rosario: UNR Editora. 2015. pp. 225-8.         [ Links ]

6. Ponce de León P, Nocelli J, López Murúa G. Exposición de criptoantígeno eritrocitario por larvas recién nacidas de Trichinella spiralis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2017; 51 (4): 669-73.         [ Links ]

7. Luebke RW. Nematodes as host resistance models for detection of immunotoxicity. Methods 2007; 41 (1): 38-47.         [ Links ]

8. Lin M. A safe, simple and efficient cross matching using the slide polybrene method. Transfusion Today 2006; 66: 28.         [ Links ]

9. Ponce de León P, Racca L, Menendez M, Biondi C, Valverde J. Acción de Ascaris lumbricoides sobre la carga aniónica de eritrocitos y eritrocitos desializados. Acta Bioquím Clín Latinoam 2012; 46 (2): 247-56.         [ Links ]

10. Goudemand M, Marsalet ID. Elements d´immuno-hématologie. 3ª ed. Paris: Flammarion; 1974.         [ Links ]

11. Wackerly D, Mendenhall W, Scheaffer R. Estadística matemática con aplicaciones. México: Thomson Learning; 2003.         [ Links ]

12. Campbell WC. Chemotherapy of Parasitic Diseases. 1ª ed. New York: Ed. Plenum Press; 1983.         [ Links ]

13. Steffan PE, Riva E, Muchiut S, Fiel CA. Trichinellosis. Las buenas prácticas de producción y el diagnóstico como bases para la prevención y el control. Disponible en: http://www.vet.unicen.edu.ar/index.php/es/triquinelosis. (Fecha de acceso: 5 de diciembre de 2017).         [ Links ]

14. Pozio E, Hoberg E, La Rosa G, Zarlenga DS. Molecular taxonomy, phylogeny and biogeography of nematodes belonging to the Trichinella genus. Infect Gen Evol 2009; 9 (4): 606-16.         [ Links ]

15. Lehmann F, Tiralongo E, Tiralongo J. Sialic acid-specific lectins: occurrence, specificity and function. Cell Mol Life Sci 2006; 63 (12): 1331-54.         [ Links ]

16. King TP. Lectin cytochemistry and intestinal epithelial cell biology. Londres: Pusztai A. and B Taylor; 1995.         [ Links ]

17. Cabezas Fernández del Campo JA. Influencia de la sialilación y de la "pegilación" de la molécula de ciertos medicamentos en su actividad. An R Acad Nac Farm 2008; 74 (3): 409-32.         [ Links ]

18. Ponce de León P, López Murúa G. Cinética de desialización eritrocitaria producida por larvas musculares vivas de Trichinella spiralis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2017; 51 (2): 237-42.         [ Links ]

19. Vignau ML. Triquinosis. Ciencia Hoy 2004; 14 (82): 58-65.         [ Links ]

20. Uribarren Berrueta T. Trichinelosis o triquinelosis, 2015. Disponible en: http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/trichinelosis.html. (Fecha de acceso: 5 de diciembre de 2017).         [ Links ]

Recibido: 13 de diciembre de 2017
Aceptado: 19 de marzo de 2018

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