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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.52 no.2 La Plata jun. 2018

 

TOXICOLOGÍA

Protección de la Spirulina maxima sobre la citotoxicidad de la hidroxiurea en células embrionarias de ratón

Protection of Spirulina maxima on cytotoxicity of hydroxyurea in mouse embryonic cells

Proteção de Spirulina maxima em citotoxicidade de hidroxiureia em células embrionárias de camundongo

 

Jorge Vázquez-Sánchez1a, Angélica Pérez-Juárez1b, Cornelio Barrientos-Alvarado1b

1 Doctor en Ciencias Químico-Biológicas.
a Escuela Superior de Enfermería y Obstetricia, Instituto Politécnico Nacional, Prolongación De Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Casco de Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F., México.
b Escuela Superior de Medicina, Instituto Politécnico Nacional, Plan de San Luis y Díaz Mirón s/n, Col. Casco de Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F., México.

CORRESPONDENCIA CORNELIO BARRIENTOS ALVARADO. Departamento de Fisiología. Escuela Superior de Medicina, Instituto Politécnico Nacional, Prolongación De Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Casco de Santo Tomás, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F., México. Tel.: +52 55 57296000 ext: 46231, 52350; fax: +52 55 57296206. E-mail: cornelio_barrientos@yahoo.com.mx


Resumen

La Spirulina maxima (SP) tiene efectos farmacológicos protectores por su contenido de ficobiliproteínas que están relacionados con su actividad antioxidante. La hidroxiurea (HU) es un fármaco antineoplásico, citotóxico y teratógeno que implica la inducción del estrés oxidativo. El objetivo de este trabajo fue determinar si la SP y su extracto acuoso de proteína (SPE) protegen contra el efecto citotóxico de HU en cultivos celulares primarios a partir de embriones de ratón de once días. Los efectos de SP, SPE e HU sobre la viabilidad celular se determinaron por el ensayo de fluorescencia de resazurina en cultivos celulares de embriones completos de ratones de once días, de encéfalo y de brotes de extremidades anteriores. Se demostró que ni SP ni su extracto provocaron efectos citotóxicos en ninguna concentración ensayada, por lo que se aumentaba la viabilidad celular. Se encontró que las células expuestas a HU de embriones completos y encéfalo mostraron mayor toxicidad que las células de los miembros anteriores. La SP y el SPE protegieron contra la citotoxicidad de HU de una manera dependiente de la concentración hasta 48 h después de la exposición al fármaco. Este efecto podría ser adecuado para prevenir la muerte celular que deriva en un proceso teratogénico, atribuido a sus propiedades antioxidantes.

Palabras clave: Spirulina maxima; Hidroxiurea; Efecto citotóxico y teratogénico; Ratón.

Abstract

Spirulina maxima (SP) has protective pharmacological effects that are related to the antioxidant activity due to its phycobiliprotein content. Hydroxyurea (HU) is an antineoplastic, cytotoxic and teratogenic drug, which involves the induction of oxidative stress. The aim of this study was to determine whether SP and its aqueous protein extract (SPE) protect against the cytotoxic effect of HU in primary cell cultures from mouse embryos. The effects of SP, SPE, and HU on cell viability were determined by resazurin fluorescence assay in whole embryo cell cultures, encephalon, and eleven-day-old forehead bud outbreaks. It was shown that neither SP nor its extract caused cytotoxic effects at any concentration tested, increasing cell viability. It was found that cells exposed to HU of whole embryos and encephalon showed higher toxicity than cells of the previous limbs. SP and SPE protected HU cytotoxicity in a concentration-dependent manner up to 48 hours after exposure to the drug. This effect could be adequate to prevent cell death resulting in a teratogenic process attributed to its antioxidant properties.

Keywords: Spirulina maxima; Hydroxyurea; Cytotoxic and teratogenic effect; Mouse.

Resumo

Spirulina maxima (SP) tem efeitos farmacológicos protetores devido a seu conteúdo de ficobiliproteínas, que estão relacionadas com sua atividade antioxidante. A hidroxiureia (HU) é uma droga antineoplásica, citotóxica e teratogênica, que envolve a indução do estresse oxidativo. O objetivo deste estudo foi determinar se a SP e seu extrato aquoso de proteína (SPE) protegem contra o efeito citotóxico da HU em culturas celulares primárias a partir de embriões de camundongo de onze dias. Os efeitos de SP, SPE e HU na viabilidade celular foram determinados pelo ensaio de fluorescência de resazurina em culturas celulares de embriões inteiros de camundongos de onze dias, de encéfalo e de surtos de extremidades anteriores. Demonstrou-se que nem a SP nem seu extrato causaram efeitos citotóxicos em qualquer concentração testada, aumentando a viabilidade celular. Verificou-se que as células expostas à HU de embriões completos e encéfalo mostraram maior toxicidade do que as células dos membros anteriores. SP e SPE protegem contra a citotoxicidade de HU de forma dependente da concentração até 48 h após a exposição ao medicamento. Esse efeito poderia ser adequado para prevenir a morte celular, que resulta em um processo teratogênico atribuído a suas propriedades antioxidantes.

Palavras-chave: Spirulina maxima; Hidroxiureia; Efeito citotóxico e teratogênico; Camundongo.


 

Introducción

La Spirulina spp. es una cianobacteria planctónica que se encuentra en el agua alcalina de los lagos volcánicos. Es ampliamente consumida por sus efectos nutricionales y farmacológicos debido a sus altos niveles de vitaminas, minerales, proteínas y ácidos grasos esenciales (1). Varios de los efectos farmacológicos de la SP se han relacionado con las propiedades antioxidantes del extracto proteico (2-5), específicamente con algunas ficobiliproteínas como la c-ficocianina (CP) y la alocicocianina (6–9), pigmentos que tienen el mismo efecto antioxidante que el extracto a concentraciones similares (10), y que son inhibidores selectivos de la ciclooxigenasa-2 que regula la expresión génica (11-15).
Aunque se han identificado más de 50 agentes teratógenicos de tipo ambiental, químicos y físicos, del mismo modo se han identificado algunos medicamentos pioneros para la prevención de malformaciones congénitas provocadas por agentes teratogénicos ambientales y de compuestos nutricionales (16), importante ya que las malformaciones congénitas son una de las principales causas de mortalidad infantil en el mundo, entre los países industrializados son la primera causa de muerte, mientras que en los países subdesarrollados son la segunda o tercera causa (17).
La toxicidad del desarrollo se evalúa mediante estudios in vivo e in vitro, los cuales pueden ser realizados en cultivos de células, tejidos, órganos o embriones completos. La mayoría de las sustancias que provocan patologías del desarrollo alteran la transducción de señales y/o activan la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) como principal mecanismo de daño macromolecular y muerte celular (18).
La hidroxiurea (HU) es un fármaco antineoplásico empleado en la quimioterapia clínica y en el tratamiento de enfermedades virales. Su mecanismo principal implica la inhibición de la ribonucleótido reductasa (RNR) por su reacción con el radical tirosilo, catalíticamente esencial en la enzima (19). Dentro de 2-4 h luego de la exposición, provoca un episodio rápido de muerte celular y profunda inhibición de la síntesis de ADN celular, ya sea in vivo o in vitro (20-23). Se ha propuesto que la HU reaccionaría dentro de las células para producir ROS que podrían ser responsables de la muerte celular temprana (24). Algunos antioxidantes como el D-manitol y el propilgalato reducen la toxicidad de la HU durante el desarrollo y otros como la vitamina E, el benzoato de sodio, la catalasa, la peroxidasa y la superóxido dismutasa protegen contra la citotoxicidad aguda de la HU (21).
El objetivo de este trabajo fue determinar si la SP y su extracto acuoso proteico (SPE) podrían proteger contra el efecto citotóxico de la HU en cultivos celulares de embriones completos, encéfalos y brotes de extremidades anteriores de embriones de ratón de once días de edad, durante 48 h de exposición.

  Materiales y Métodos

SPIRULINA MAXIMA
La muestra utilizada en este estudio fue de un lote de producción a granel (SDW-9714) de calidad estandarizada (SP fue analizada y todos sus contenidos nutricionales fueron determinados e indicados en la etiqueta) suministrado por Alimentos Esenciales para la Humanidad, SA CV, Ciudad de México.

EXTRACTO DE PROTEÍNA DE Spirulina maxima (SPE)
Se disolvió 1 g de SP en 10 mL de solución tampón de fosfato (PBS) a pH 7,2 y se almacenó en la oscuridad. Después de 12 h, la suspensión se centrifugó durante 15 min a 13000 rpm (Centrífuga refrigerada Sorvall RC-5B Superspeed, Dupont Instruments Canada Company, Ontario L5M2H3, Canadá) y durante 30 min a 35000 rpm (Centrífuga refrigerada Optima™ L-80 XP Ultracentrifuge, Beckman Coulter, Inc. California, EE.UU.). Después de cada ciclo de centrifugación se desechó el precipitado (color verde) y se centrifugó nuevamente el sobrenadante. El extracto de proteína obtenido se dializó frente a una solución de fosfato de Na 0,01 M en la oscuridad, con una membrana de 12 KDa durante 5 días y después se liofilizó. Todos los procedimientos se realizaron a 4 °C. Con el fin de conocer si CP era el componente principal en el extracto, se llevaron a cabo mediciones específicas de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y medición espectroscópica.

SDS-PAGE
Se llevó a cabo una SDS-PAGE al 15% para SPE, CP (Sigma Chem. Co.) y un marcador de peso molecular (Sigmamarker-Sigma Chem. Co.) como describe Binder et al. (25).

MEDICIONES ESPECTROSCÓPICAS
Los espectros UV-VIS de las muestras de proteínas se registraron en un espectrofotómetro BioSpec mini- 1240 UV-Vis (Shimadzu Instruments, Kyoto, Japón). Se comparó la longitud de onda de absorción máxima para el extracto con la indicada para CP (620 nm). La pureza se evaluó de acuerdo con la relación de absorbancia (A620 / A280 para c-ficocianina) (26).

ANIMALES
Los ratones CD-1 (30±2 g de peso corporal) fueron tratados de acuerdo con la reglamentación oficial mexicana (NOM-062-ZOO-1999) según las especificaciones técnicas para producción, cuidado y uso de animales de laboratorio según el NIH # 86-23 (27). Se mantuvieron a una temperatura constante (24±1 °C) y humedad (50%), y bajo un ciclo de luz controlado de 12 h.

CULTIVOS CELULARES
Se obtuvieron cultivos celulares a partir de embriones de ratón de once días. Los ratones hembra CD-1 preñados se sacrificaron y los cuernos uterinos se pusieron en solución tampón de fosfato (PBS). Los embriones fueron removidos y de algunos de ellos, sus miembros anteriores y el encéfalo fueron cuidadosamente separados, desde el telencéfalo hasta el mielencéfalo. Los tres grupos de células se colocaron en PBS limpio. Todos se cortaron en trozos pequeños y se tripsinizaron durante 15 min con tripsina (Sigma Chem. Co.). Se inactivó con suero bovino fetal (FBS) (Gibco Co.), después la mezcla se centrifugó durante 10 min a 800 rpm (centrífuga Sol-Bat). El sobrenadante se descartó y se resuspendió el precipitado celular en 3 mL de medio DMEM-F12 50:50 (In vitro, SA) con 15% de FBS, bicarbonato de sodio al 2,5% (In vitro, SA) y 0,5% de penicilina-estreptomicina (5000 U/μg/mL) (In vitro, SA). La viabilidad y las concentraciones celulares se determinaron con un colorante de exclusión azul de tripano (Sigma Chem. Co.) utilizando un hemocitómetro. Para todos los experimentos se sembraron células a una densidad de 1 x 104 células/pocillo en microplacas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron a 37 ºC y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Los experimentos se realizaron 24 h más tarde. Todos los tratamientos se realizaron por cuadruplicado.

VIABILIDAD CELULAR (ENSAYO FLUORESCENTE DE RESAZURINA)
1) Efectos de SP, SPE e HU sobre la viabilidad celular: Se evaluaron por el ensayo fluorescente de resazurina descrito por O’Brien et al. (28) con algunas modificaciones: los cultivos celulares se expusieron a concentraciones finales de 0,004, 0,008, 0,016, 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 mM de HU, y 0,125, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 y 16,0 mg/mL de SP o SPE. Se añadieron 30 μL de solución de resazurina (0,015% de resazurina en polvo en agua destilada estéril) 30 min antes de las mediciones.
2) Viabilidad celular de SP o SPE e HU simultánea: Para probar los efectos de protección de la SP y del SPE sobre la citotoxicidad inducida por la HU, se seleccionaron las siguientes concentraciones de SP y SPE: 0,063, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 mg/mL, y únicamente 0,25 mM para HU. La HU se añadió después de 24 h de exposición a la SP o al SPE, realizando mediciones fluorométricas a las 2, 4, 24 y 48 h después de la exposición a la HU, en un espectrómetro de fluorescencia (Perkin-Elmer LS55). La viabilidad celular se calculó como un porcentaje de las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de células de control no tratadas.
Se utilizó un cultivo testigo (T) de células sin HU ni SP o SPE para los tejidos estudiados, así como un grupo de referencia de toxicidad (HU) con solo una concen
tración de 0,25 mM de HU, y un grupo de referencia de viabilidad (SP) o (SPE) con solo una concentración de 2 mg/mL de SP o SPE, respectivamente.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todos los ensayos se realizaron por cuadruplicado. Las unidades de fluorescencia relativa obtenidas del espectrofluorómetro se transformaron en porcentajes y luego en valores paramétricos utilizando el arcoseno de la tasa porcentual en fracciones de 1, mediante una prueba de análisis de varianza (ANOVA) y una probabilidad α de 0,05. Los datos se expresaron como la media±DE. Las comparaciones estadísticas se realizaron con un ANOVA bidireccional cuando era apropiado, con una prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Los cálculos y los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SigmaStat 3.5 (Systat, Richmond, CA).

Resultados

Las mediciones por SDS-PAGE y espectroscópicas confirmaron la presencia de c-ficocianina en el extracto obtenido. La longitud de onda máxima de absorción para el extracto fue de 620,74 nm (Fig. 1), que correspondió a la informada para c-ficocianina. La relación de absorbancia (A620 / A280) fue de 2,22.


Figura 1
. Espectro de absorción de SPE. El pico de C-ficocianina fue de 619,88 nm.

Los cultivos celulares expuestos a la SP y al SPE no mostraron efectos citotóxicos y en algunas concentraciones se observó un aumento en la viabilidad mayor al 10% (p≤0,01) en comparación con el grupo control (Fig. 2). Este aumento del efecto de la SP y del SPE se mostró en los cultivos de células de encéfalo. La viabilidad fue variable a diferentes tiempos de exposición en las diferentes concentraciones de SP y SPE (Fig. 2 a y b).


Figura 2
. Comparación de la viabilidad en diferentes tiempos para cultivos celulares de encéfalo expuestos a distintas concentraciones de: a) Spirulina maxima y b) SPE (Extracto de proteína de Spirulina maxima). Cada valor representa la media±DE. * p<0,005 para los diferentes tiempos de exposición en la concentración respectiva.

Los cultivos expuestos a la HU mostraron una disminución en la viabilidad para todas las concentraciones usadas y tiempos de exposición (Fig. 3). Se observó que a las 24 h la viabilidad celular de los cultivos de embriones disminuyó mostrándose diferencia significativa (p<0,01) después de 48 h y en concentraciones mayores de 0,25 mM (Fig. 3 a y b). Se demostró que la viabilidad celular en estos cultivos no era la misma que la del grupo testigo, con 0 mM de HU.


Figura 3
. Comparación de la viabilidad en diferentes tiempos para cultivos celulares de a) embriones completos, b) encéfalo y c) miembros anteriores; expuestos a hidroxiurea (HU). Cada valor representa la media±DE. * p<0,05 para los diferentes tiempos de exposición en la concentración respectiva.

Se seleccionó una concentración de 0,25 mM de HU para evaluar los efectos de protección de la SP o del SPE a diferentes concentraciones. En todos los casos la SP o el SPE presentaron una protección dependiente de su concentración y tiempo de exposición (Fig. 4)(Fig.5).


Figura 4
. Comparación de la viabilidad en diferentes tiempos para cultivos celulares de: a) embriones completos, b) encéfalo y c) extremidades anteriores expuestas a hidroxiurea (HU) a 0,25 mM + Spirulina maxima (SP) a diferentes concentraciones: 0,125,0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0 mg/mL. T: cultivo testigo sin HU y sin SP; HU: cultivo con solo HU (0,25 mM) y SP: cultivo con solo Spirulina máxima (0,2 mg/mL).* p<0,05 para los diferentes tiempos de exposición en las concentraciones respectivas; a p<0,05 24 h vs a 2, 4, 48 h para todas las concentraciones de SP.


Figura 5
. Comparación de la viabilidad a diferentes tiempos para cultivos celulares de: a) embriones completos, b) encéfalo y c) extremidades anteriores, expuestas a hidroxiurea (HU) a 0,25 mM + Extracto de proteína de Spirulina maxima (SPE) a diferentes concentraciones: 0,125, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0 mg/mL. T: cultivo testigo sin HU y sin SPE; HU: cultivo con sólo HU (0,25 mM) y SPE: cultivo con sólo extracto de proteína de Spirulina máxima (0,2 mg/mL). * p<0,05 para los diferentes tiempos de exposición en las concentraciones respectivas; a p<0,05 48 h vs 2, 4, 24 h para todas las concentraciones de SPE; b p<0,05 2 h vs 4, 24, 48 h para las concentraciones de SPE: 2, 4 y 8 mg/mL.

Un efecto de citotoxicidad inducida por la HU se observó a las 4 h de exposición de HU + SP, mostrándose un efecto mayor a las 24 h (p<0,01), sin observar un efecto protector de la SP. Sin embargo, se observó un mejor efecto protector de la SP al periodo de exposición superior a 48 h para los tejidos estudiados, reduciendo la toxicidad de la HU en comparación a cuando se administraba sola (T), y aumentando la viabilidad después de las concentraciones mayores a 0,125 mg de SP, viabilidad cercana a la del cultivo de referencia (SP) (Fig. 4 a, b y c).
Con respecto al SPE, mostró mayor protección para la toxicidad de la HU, cuando el tiempo de exposición fue un mínimo de 2 h y a concentraciones mayores de 0,5 mg/mL de SPE (p<0,05), observándose una viabi
lidad mayor con respecto al cultivo de referencia (T) conforme se aumentó la concentración del SPE (Fig. 5 a, b y c). La exposición a 48 h de HU ocasionó toxicidad para los cultivos de embriones completos y de las extremidades sin importar la concentración del SPE.
La protección en general contra los efectos citotóxicos de la HU fueron semejantes en las células de los diferentes tejidos estudiados observándose un ligero aumento en la viabilidad de los cultivos de la extremidad anterior respecto de los embriones completos y de las células del encéfalo. Se observó un mejor efecto protector de la SP y del SPE con concentraciones superiores a 1 mg/mL. Con respecto a los tiempos de exposición se observó que la SP tiene mejor protección a mayores tiempos de exposición (48 h) y el SPE a menores tiempos de exposición (2 h) (Fig. 4 )(Fig. 5).

Discusión y Conclusiones

Se ha documentado que las propiedades antioxidantes de Spirulina spp se atribuyen principalmente a su contenido en ficobiliproteínas, como la c-ficocianina, que ha sido ampliamente estudiada debido a su actividad antioxidante (13-15). Sin embargo, Piñero et al. demostraron que las propiedades antioxidantes de la c-ficocianina se asocian principalmente con la actividad del extracto proteico; en este estudio se utilizó un método alternativo para obtener el SPE con una proporción similar (2,22 vs. 2,16 según Piñero et al.) fracción que presenta la misma actividad antioxidante que la ficocianina pura (10). El extracto obtenido presentó una baja cantidad de otras proteínas, como se evidenció por la SDS-PAGE realizada (Fig. 1).
La SP y el SPE no presentaron ningún efecto citotóxico contra cultivos primarios de diferentes partes de los embriones o contra células de embriones completos (Fig. 2). De hecho, aumentaron la viabilidad celular y la proliferación en las primeras 24 h después de la exposición, pero más tarde a las 48 h el ritmo de crecimiento fue el mismo que el del cultivo testigo, lo cual puede ser atribuido a las bajas propiedades nutritivas del extracto de la proteína; se ha descrito que la subnutrición afecta el desarrollo, el crecimiento y la rehabilitación de animales (29-31).
Por otra parte, los cultivos celulares ensayados mostraron diferentes sensibilidades a la HU (Fig. 3), lo que puede explicarse por la tasa de proliferación celular, ya que este fármaco destruye rápidamente las células embrionarias proliferantes (22). A los once días los miembros anteriores crecen, mientras que el encéfalo e
incluso el embrión completo está en un proceso de diferenciación más que en crecimiento (32)(33). DeSesso y Goeringer demostraron que la muerte celular temprana después de la exposición a la HU no es causada por la inhibición de la síntesis de ADN (24). La HU produce los mismos efectos teratogénicos y metabolitos citotóxicos tanto in vivo como in vitro (34)(35) en varias especies de animales como ratón, rata y conejo. Las malformaciones congénitas causadas por la HU son similares, afectando principalmente el desarrollo encefálico y del miembro anterior (22).
Se sabe que la HU reacciona en las células para producir especies de oxígeno altamente reactivas, tales como el radical hidroxilo que produce sus efectos citotóxicos, los cuales se pueden reducir usando antioxidantes en las primeras horas después de la exposición. Sin embargo, algunos informes mostraron que después de 24 h de exposición a la HU los efectos citotóxicos son los mismos, con o sin presencia de antioxidantes debido a la profunda inhibición de la síntesis de ADN (20)(21). Por el contrario, hay informes que muestran que la exposición a la c-ficocianina antes, durante y después del contacto con agentes tóxicos, da como resultado un mejor efecto protector (36)(37). En este estudio se observó que las concentraciones de la SP y del SPE (Fig. 4)(Fig. 5), superiores a 1 mg/mL, a 48 h o 2 h de exposición, respectivamente, protegieron contra la muerte celular logrando valores similares a los del cultivo testigo. Esto puede explicarse debido a algunas interacciones de la HU o sus metabolitos, como el óxido nítrico (NO), con residuos de tirosina y triptofano sobre la estructura de la apoficocianina, tal como fue descrito por Bhat y Madyastha (38)(39). Ellos describieron que tanto la HU como el NO pueden inhibir la enzima ribonucléotido reductasa mediante una reacción con su radical tirosilo, catalíticamente esencial, disminuyendo su efecto tóxico (40).
La SP y el SPE podrían proteger de dichos mecanismos de daño debido a sus propiedades antioxidantes. La SP y el SPE previenen la incidencia de todas las alteraciones provocadas por una sola exposición a la HU, como el desarrollo craneofacial extenso, cierre del tubo neural y desarrollo anormal del brote de la proa en embriones de ratón, de una manera dependiente de la dosis (41). El SPE presentó una reducción significativa de malondialdehído (MDA) que se genera como resultado de la peroxidación lipídica en células expuestas a la HU.
En conclusión, según los resultados obtenidos este estudio apoya el argumento de que la SP y el SPE previenen la citotoxicidad inducida por la HU en los cultivos celulares primarios hasta 48 h después de su exposición, presumiblemente por su actividad antioxidante. Sin embargo, como el efecto protector continúa en las concentraciones más altas de SP o SPE, es necesario realizar más pruebas para elucidar otros mecanismos relacionados.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado con fondos del Instituto Politécnico Nacional y Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.

CONFLICTOS DE INTERÉS.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

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Recibido: 18 de agosto de 2017
Aceptado: 30 de octubre de 2017

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