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Acta bioquímica clínica latinoamericana

Print version ISSN 0325-2957On-line version ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.53 no.2 La Plata June 2019

 

BIOQUÍMICA CLÍNICA

Marcadores de estrés oxidativo en pacientes con esclerosis múltiple durante un brote y su remisión

 

Ada Paloma Soto-Brambila1a, Genaro Gabriel Ortiz2a, Ana Laura Briones-Torres3b, Paloma Rivero-Moragrega4a, Celso Cortés-Romero5b, Fermín Paul Pacheco-Moisés*5b

1 Maestra en Ciencias con especialidad en Genética Humana.
2 Doctor en Ciencias con especialidad en Ciencias Biomédicas.
3 Maestra en Ciencias con especialidad en Química.
4 Graduada en Medicina.
5 Doctor en Ciencias con especialidad en Bioquímica.
a Laboratorio de Mitocondria‐Estrés Oxidativo y Patología. División de Neurociencias. Centro de Investigación Biomédica de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social. Sierra Mojada 800, C.P. 44340. Guadalajara, Jalisco, México.
b Departamento de Química. Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías. Blvd. Marcelino García Barragán 1421. C.P. 44430. Guadalajara, Jalisco, México.
* Autor para correspondencia.

Correspondencia Dr. FERMÍN PAUL PACHECO-MOISÉS Departamento de Química Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías Universidad de Guadalajara Blvd. Marcelino García Barragán #1421, esq. Calzada Olímpica C.P. 44430. GUADALAJARA, Jalisco, México Correo electrónico: ferminpacheco@hotmail.com


Resumen

La esclerosis múltiple remitente-recurrente (EM-RR) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central. A fin de entender la asociación del estrés oxidativo a nivel periférico con la recaída de la enfermedad se determinaron los niveles de marcadores de estrés oxidativo en plasma de pacientes en la recaída o brote y una semana después de la misma. Se analizaron muestras de 60 personas (20 pacientes con recaída, 20 pacientes sin recaída y 20 controles sanos). Se cuantificaron mediante métodos espectrofotométricos las actividades enzimáticas de óxido nítrico sintasa (ONS), glutatión peroxidasa (GPx), los niveles de lipoperóxidos y nitritos-nitratos y la fluidez de membrana. En el brote de la enfermedad aumentan significativamente los niveles de las actividades enzimáticas de ONS y GPx y los niveles de nitritos-nitratos y lipoperóxidos (p<0,01 en todos los casos), al ser comparados con los de individuos sanos. Dichos parámetros disminuyeron significativamente una semana después de iniciado el brote. Además, los parámetros evaluados se mantuvieron elevados en pacientes que no experimentaron un brote de la enfermedad cuando se los comparó con individuos sanos. La fluidez de membrana en los pacientes con y sin brote fue similar a la de los controles. En conclusión, el estrés oxidativo es un componente importante en los pacientes con esclerosis múltiple.

Palabras clave: Esclerosis múltiple; Estrés oxidativo; Recaída; Óxido nítrico sintasa; Lipoperóxidos; Nitritos-nitratos.

Abstract

Oxidative stress markers in patients with multiple sclerosis during an outbreak and its remission

Recurrent-remitting multiple sclerosis (RR-MS) is a demyelinating disease of the central nervous system. In order to understand the association of oxidative stress at the peripheral level with the relapse of the disease, the levels of oxidative stress markers in plasma of patients in the relapse or outbreak and one week after relapse were determined. Samples of 60 subjects were analyzed (20 patients in relapse, 20 patients without relapse, and 20 healthy controls). The enzymatic activities of nitric oxide synthase (NOS), glutathione peroxidase (GPx), lipoperoxides and nitrite-nitrate levels and membrane fluidity were quantified by spectrophotometric methods. In relapse, the levels of enzymatic activities of NOS and GPx, and the levels of lipoperoxides and nitrites-nitrates were significantly increased (p<0.01, in all cases), compared with healthy individuals. These parameters decreased significantly 1 week after the start of the outbreak. In addition, the parameters evaluated remained high in patients who did not experience an outbreak of the disease compared to healthy subjects. The membrane fluidity in the patients with and without outbreak was similar to that of the controls. In conclusion, oxidative stress is an important component in patients with multiple sclerosis.

Keywords: Multiple sclerosis; Oxidative stress; Relapse; Nitric oxide synthase; Lipoperoxides; Nitrites-nitrates.

Resumo

Marcadores de estresse oxidativo em pacientes com esclerose múltipla durante um surto e sua remissão

A esclerose múltipla recorrente-remitente (EM-RR) é uma doença desmielinizante do sistema nervoso central. Para compreender a associação do estresse oxidativo a nível periférico com a recaída da doença foram determinados os níveis de marcadores de estresse oxidativo em plasma de doentes na recaída ou surto e uma semana após a recaída. Foram analisadas a amostras de 60 pessoas (20 pacientes com recaída, 20 pacientes sem recaída e 20 controles saudáveis). As atividades enzimáticas de óxido nítrico sintase (ONS), glutationa peroxidase (GPX), os níveis de lipoperóxidos e nitritos-nitratos e a fluidez de membrana foram quantificadas por métodos espectrofotométricos. No surto da doença aumentam em forma significativa os níveis da atividade enzimática de ONS e GPX, e os níveis de nitritos-nitratos e lipoperóxidos (p<0,01 em todos os casos), em comparação com os indivíduos saudáveis. Esses parâmetros diminuíram significativamente uma semana após o início do surto. Além disso, os parâmetros avaliados permaneceram elevados em pacientes que não experimentaram um surto da doença quando comparados com indivíduos saudáveis. A fluência de membrana nos pacientes com e sem surto foi semelhante à dos controles. Em conclusão, o estresse oxidativo é um componente importante nos pacientes com esclerose múltipla.

Palavras-chave: Esclerose múltipla; Estresse oxidativo; Recaída; Óxido nítrico sintase; Lipoperóxidos; Nitritos-nitratos.


 

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es la más común de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes del sistema nervioso central (SNC) y se caracteriza por procesos inflamatorios idiopáticos que destruyen selectivamente la mielina con preservación relativa de los axones. Su etiología es desconocida pero en su patogénesis el sistema inmunitario juega un papel fundamental, por lo que se considera una enfermedad autoinmune (1). Aproximadamente el 85% de los pacientes experimenta una serie de ataques (brotes o exacerbaciones). El brote es la aparición de síntomas o signos nuevos de disfunción neurológica, de duración superior a 24 horas, o el deterioro significativo de síntomas preexistentes que se habían estabilizado o permanecido ausentes durante un período de 30 días. Generalmente, el comienzo es subagudo y tras un período estacionario, los síntomas suelen mejorar o desaparecer (remisión). A esta forma clínica se la conoce como esclerosis múltiple remitente-recurrente (EM-RR) (2). Habitualmente, las exacerbaciones se producen por eventos exógenos tales como infecciones virales, trauma o por lesiones penetrantes en el SNC, lo que estimula la secreción de citoquinas por las células inmunes (3).
La EM como trastorno autoinmune e inflamatorio presenta ruptura de la barrera hematoencefálica, reclutamiento de linfocitos, macrófagos y microglía a los sitios de la lesión. Las lesiones múltiples se ubican en el tronco cerebral, médula espinal y pueden ser perivasculares. Existe desmielinización, gliosis y remielinización parcial, así como presencia de inmunoglobulina G en el SNC y en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Los linfocitos activados en la periferia se infiltran en el SNC para desencadenar una respuesta inmune local que en última instancia daña la mielina y los axones (4). El entorno inflamatorio en las lesiones desmielinizantes conduce a la generación de radicales de oxígeno y nitrógeno, así como de citoquinas proinflamatorias que contribuyen al desarrollo y la progresión de la enfermedad. La inflamación puede conducir a estrés oxidativo y viceversa (5)(6). El objetivo del trabajo fue determinar los niveles de los marcadores de estrés oxidativo (lipoperóxidos, catabolitos del óxido nítrico, fluidez de membrana áticas de óxido nítrico sintasa y glutatión peroxidasa) en plasma de pacientes que experimentaron un brote y después durante la remisión de la enfermedad.

Materiales y Métodos

Pacientes
Se incluyeron pacientes diagnosticados con esclerosis múltiple remitente-recurrente, que acudieron a la consulta de la clínica de esclerosis múltiple del Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) en Guadalajara, Jalisco. Este estudio se realizó de acuerdo con el reglamento de la Ley General de Salud en materia de investigación para la salud y la declaración de Helsinki (7). Los participantes en este estudio firmaron la carta de consentimiento informado, de acuerdo con las normas éticas de la institución. Se usaron códigos de identificación para asegurar la confidencialidad de los pacientes. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación local. Los criterios de inclusión fueron: edad de 18-55 años, puntaje en la escala expandida del estado de discapacidad (EDSS) menor o igual a 5, cumplir con los criterios de Mc Donald actualizados en 2010, al menos la presencia de una recaída en el año previo, diagnóstico definitivo de EM-RR y tratamiento farmacológico con interferón beta 1-b (250 μg tres veces por semana). Se incluyeron 40 pacientes y 20 individuos clínicamente sanos de edad similar como grupo control.
Los criterios de exclusión de los pacientes fueron: ingesta de antioxidantes o de suplementos alimenticios, presencia de enfermedades crónico-degenerativas (i.e. diabetes mellitus, hipertensión arterial), falla renal o hepática, consumo de drogas, alcohol o tabaco.

Toma de muestras sanguíneas
De cada paciente se tomaron dos muestras de sangre para evaluar los niveles de los marcadores de estrés oxidativo: una cuando los pacientes presentaron el brote de la enfermedad y otra durante el período de remisión (7 días después del brote). Tanto a los pacientes que no experimentaron un brote de la enfermedad como a los controles sanos se les tomó una muestra de sangre para su análisis.
Las muestras de sangre se obtuvieron en ayunas entre las 7:00 y las 10:00 h y se extrajeron de una vena en la fosa antecubital con una aguja de calibre 19. El torniquete fue cuidadosamente liberado después de su aplicación y se recogió la sangre en tubos que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante. En seguida la muestra se centrifugó a 310 g durante 10 min a 4 °C para obtener el plasma. El plasma se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Determinación de la actividad de óxido nítrico sintasa
La actividad de óxido nítrico sintasa se cuantificó mediante la diazotación del ácido sulfanílico por el óxido nítrico a pH ácido y la subsiguiente formación de un complejo con N-(1-naftil)etilendiamina, de acuerdo con el método propuesto por Durack et al (8). Para esto, el plasma se diluyó 1:1 con amortiguador (o buffer) que contenía Tris–HCl 20 mM (pH 7,5), EDTA 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM, leupeptina y aprotinina 10 μg/μL. Enseguida se centrifugó a 14.000 g durante 15 min. La mezcla de reacción contenía 0,1 mL de sobrenadante, 0,2 mL de arginina 0,2 M, NADPH 1 mM y se incubó a 37 °C durante una hora. A continuación se añadieron 0,2 mL de HCl 10 mM, ácido sulfanílico 100 mM, y N-(1-naftil)etilendiamina 60 mM. Se leyó la absorbancia de las muestras a 540 nm.

Actividad de glutatión peroxidasa
La actividad de glutatión peroxidasa se evaluó mediante la cinética de la oxidación del co-sustrato NADPH y considerando su coeficiente de absortividad molar (9). El medio de reacción contenía: fosfato de potasio 50 mM (pH 7), EDTA 1 mM, NADPH 0,2 mM, glutatión reductasa 1 U/mL y glutatión reducido 1 mM. El procedimiento realizado en esta prueba fue el siguiente: en una placa de 96 pozos se colocaron 10 L de muestras y 180 µL de medio de reacción y se incubaron durante 5 min a 37 °C. A continuación se añadieron 20 µL de hidroperóxido de cumeno y se registró el cambio de absorbancia a 340 nm cada 15 s durante 3 min en un espectrofotómetro UV/VIS (Benchmark Plus Microplate de BioRad (Hercules, CA, EE.UU.) para microplacas. Los resultados se expresaron como nmoles de glutatión oxidado/min.

Cuantificación de lipoperóxidos de membrana
Los productos finales de la lipoperoxidación se cuantificaron como la suma de malondialdehído + 4-hidroxialquenos, mediante su reacción con el reactivo cromógeno N-metil-2-fenilindol. En este método una molécula de malondialdehído o 4-hidroxialquenos reacciona con dos moléculas de N-metil-2-fenilindol para producir un cromóforo estable con una absorbancia máxima a 586 nm. Brevemente, a 200 μL de plasma se agregaron 455 μL de N-metil-2-fenilindol 10,3 mM en acetonitrilo-metanol (3:1) y 105 μL de ácido metansulfónico. A continuación las muestras se incubaron durante una hora a 45 °C y se centrifugaron a 15.000 g durante 15 min. Se leyó la absorbancia del sobrenadante a 586 nm en un espectrofotómetro UV/VIS para microplacas. La curva estándar se efectuó con concentraciones conocidas de 1,1,3,3-tetrametoxipropano en amortiguador (o buffer) tris(hidroximetil) aminometano 50 mM (pH 7,4).

Determinación de nitritos/nitratos
La concentración de los catabolitos del óxido nítrico se determinó como la suma total de nitritos + nitratos para lo cual se desproteinizó el plasma mediante la adición de 6 mg de sulfato de zinc a 400 µL de muestra. Luego la muestra se agitó brevemente y se centrifugó a 14.000 g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante fue tratado con cloruro de vanadio para convertir los nitratos a nitritos y posteriormente, por medio del reactivo de Griess se cuantificaron estos últimos. Se leyó la absorbancia de las muestras a 540 nm en un espectrofotómetro UV/VIS para microplacas. Se usó una curva estándar con concentraciones conocidas de nitrato de sodio (10).

Determinación de fluidez de membrana
ómediante espectroscopía de fluorescencia de dipirenilpropano (DPiP) incorporado en las membranas celulares de las muestras. En un espectrofluorómetro Perkin-Elmer LS 50B (Norwalk, CT, EE.UU.) se registraron las emisiones de fluorescencia del excímero y del monómero de DPiP. El procedimiento fue el siguiente: en una celda de policarbonato se añadieron 2 mL de solución amortiguadora Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), 10 µL de muestra y 2 µL de DPiP. Se registraron las lecturas de emisión de fluorescencia del monómero y del excímero de DPiP después de 4 h de incubación de la muestra con DPiP. A las lecturas de fluorescencia de las muestras en presencia de DPiP se les restó la lectura de fluorescencia de la muestra sin DPiP. Así, con los valores obtenidos se calculó el cociente de fluorescencias de excímero a monómero (Ie/Im). Dicho cociente está directamente relacionado con la fluidez de membrana, es decir a mayor valor del cociente mayor fluidez de la membrana (11).

Resultados

Características de la población de estudio
Del total de pacientes con EM-RR que participaron en este estudio, 20 tuvieron un brote de la enfermedad, de corta duración, en el transcurso de febrero a agosto de 2017. Se seleccionaron también 20 individuos clínicamente sanos y 20 pacientes que no experimentaron un brote de la enfermedad durante los meses previos a la toma de muestra y durante la toma de muestra. Como se indica en la Tabla I los grupos de pacientes y el grupo control tenían tanto edades como índices de masa corporal similares. Además, el grupo de pacientes que tuvieron un brote presentó un mayor puntaje en la escala de discapacidad y una tasa de recaída anual mayor que los individuos que no tuvieron un brote (Tabla I). Los datos del perfil bioquímico de bioseguridad (biometría hemática, análisis de lípidos y pruebas de función renal y hepática) muestran que dichos parámetros se encontraban dentro de los valores normales en los grupos de estudio, excepto en la actividad de aspartato aminotransferasa (AST) en el grupo de EM-RR sin brote al ser comparada con el grupo de individuos sanos. En el grupo de EM-RR con brote hubo mayor cantidad de leucocitos, concentración de glucosa y actividad de deshidrogenasa láctica (DHL) respecto del grupo control y del grupo de EM-RR sin brote (Tabla II).

Tabla I. Características demográficas de los controles y pacientes incluidos en el estudio

Tabla II. Características clínicas de los sujetos control y pacientes incluidos en el estudio

Marcadores bioquímicos
Las actividades enzimáticas de óxido nítrico sintasa y glutatión peroxidasa y los niveles de los catabolitos del óxido nítrico y lipoperóxidos en el plasma de los pacientes con EM-RR que no tuvieron un brote se incrementaron significativamente en comparación con el grupo control. Dichos valores, a excepción de la actividad de la glutatión peroxidasa, aumentaron aún más en los pacientes que experimentaron un brote de la enfermedad (muestra inicial). En las muestras finales de los pacientes que tuvieron un brote y que se tomaron 7 días después de iniciado el mismo, dichos parámetros tendieron a disminuir. En tanto que la fluidez de las membranas no se modificó en los diferentes grupos de estudio (Tabla III).

Tabla III. Resultados de parámetros bioquímicos en plasma de controles y pacientes incluidos en el estudio

Discusión y Conclusiones

En este trabajo se detectaron incrementos significativos en los niveles plasmáticos de los lipoperóxidos y los catabolitos del óxido nítrico en plasma de pacientes que experimentaron un brote de la enfermedad. Esto puede atribuirse a un aumento importante en la actividad de óxido nítrico sintasa en plasma. El óxido nítrico es una molécula con múltiples funciones. En condiciones fisiológicas, el óxido se produce a partir de L-arginina por la actividad de la óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS) y juega un papel importante en la regulación inmune. El óxido nítrico regula negativamente la producción del factor de necrosistumoral alfa (TNF-α) y la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad clase II en macrófagos, induce la apoptosis en células CD4+, regula la actividad de la citocromo oxidasa mitocondrial, e inhibe la presentación antigénica, la adhesión y la migración de leucocitos (12)(13). Sin embargo, durante las reacciones inflamatorias, la exposición de los macrófagos al interferón gamma y al TNF-α conduce a la activación de la forma inducible de la óxido nítrico sintasa, una enzima que produce, por períodos de tiempo más largos, hasta 10 veces más óxido nítrico y superóxido que la cNOS. El óxido nítrico, en altas concentraciones, es una especie reactiva del nitrógeno con comportamiento similar al de un radical libre que causa el bloqueo de la conducción, especialmente en los axones desmielinizados y estimula la apoptosis. La inhibición de la citocromo oxidasa mitocondrial ocasionada por el óxido nítrico disminuye significativamente la síntesis de ATP. Como consecuencia, la actividad de Na+/ K+-ATPasa se reduce, produciendo así una alteración en los transportadores de glutamato dependientes de Na+. Estas alteraciones generan sobreexpresión de los receptores de glutamato, lo que desencadena la entrada masiva de Ca++ en la célula. Esto activa las proteasas y conduce a una alteración grave del citoesqueleto y del flujo axonal. Además, el óxido nítrico reacciona rápidamente con el anión superóxido para formar peroxinitrito, una molécula mucho más reactiva que sus precursores. El peroxinitrito reacciona con residuos de tirosina en proteínas y forma nitrotirosina; los residuos de ésta se encuentran en macrófagos y astrocitos a causa del estrés oxidativo (15). Las lesiones activas en pacientes con EM-RR se asocian con inflamación, lipoperoxidación y oxidación en el ADN. En estos pacientes se observó un incremento en los marcadores de estrés oxidativo como la actividad de glutatión peroxidasa, lipoperóxidos y catabolitos del óxido nítrico al ser comparados con individuos sanos (16). En oligodendrocitos, el óxido nítrico afecta el metabolismo energético y ocasiona daño del ADN mitocondrial, la estructura de la membrana mitocondrial y los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (17).
La actividad de la glutatión peroxidasa plasmática también muestra un aumento notable durante el brote de la enfermedad y tiende a disminuir conforme los pacientes se recuperan del brote. Sin embargo, no disminuye a los valores de los controles sanos. Previamente se informó que la glutatión peroxidasa en eritrocitos y leucocitos (18) y en LCR (19) de pacientes con esclerosis múltiple está disminuida en relación a muestras de controles sanos. Por el contrario, se ha registrado actividad normal en leucocitos de pacientes con EM (20). El aumento significativo que se detectó en la actividad de esta enzima en plasma de pacientes puede atribuirse a una respuesta compensatoria para reducir los hidroperóxidos unidos a las membranas y, por lo tanto, disminuir el daño celular causado por las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Esto es interesante dado que en ese trabajo se encontró que la fluidez de las membranas del plasma se mantiene en valores normales durante el brote de la enfermedad y su recuperación.
En conclusión, los marcadores de estrés oxidativo analizados en este trabajo se incrementaron en los pacientes durante el brote de la enfermedad, a excepción de la fluidez de membrana; sin embargo, los niveles de dichos marcadores aún se mantienen altos en la ausencia de un brote.

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Recibido: 7 de noviembre de 2018
Aceptado: 9 de mayo de 2019

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