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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.53 no.2 La Plata jun. 2019

 

PARASITOLOGÍA

Larvas recién nacidas de Trichinella spiralis: cinética de agregación eritrocitaria

 

Patricia Ponce de León*1a, Paola Bergia2a, Hebe Bottai3b

1 Doctora en Ciencias Biomédicas.
2 Pasante Área Parasitología.
3 Bioquímica.
a Área Parasitología. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.
b Área Estadística y Procesamiento de Datos. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario. Argentina.
* Autor para correspondencia.

Correspondencia Dra. PATRICIA PONCE DE LEÓN Área Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas Universidad Nacional de Rosario. Suipacha 531 2000 ROSARIO, Argentina Correo electrónico: tefu1958@hotmail.com


Resumen

El objetivo de este trabajo fue estudiar la cinética de agregación eritrocitaria producida por dos concentraciones de larvas recién nacidas (LRN) de Trichinella spiralis. Se trabajó con 5 suspensiones eritrocitarias incubadas con 500 y 1.000±100 LRN/mL durante 120 minutos, con tomas de muestra al tiempo inicial y cada 15 minutos. Los respectivos controles se incubaron de la misma manera con solución salina. Se aplicaron el método de titulación por Polibrene calculando el CexpST y la técnica de análisis de la variancia con las comparaciones múltiples según Tukey. Los resultados mostraron para ambas concentraciones de LRN, que el coeficiente promedio disminuyó con el aumento del tiempo de incubación. En el tratamiento con 1.000 LRN/mL, el coeficiente promedio no presentó diferencias significativas a tiempo 0 y 15 minutos, ni entre 60 y 75 minutos, mientras que con 500 LRN/mL no hubo diferencias entre los tiempos 0, 15 y 30 minutos. Todas las restantes diferencias fueron significativas para ambas concentraciones larvales. El valor promedio de CexpST no difirió significativamente entre los dos tratamientos a tiempo 0 y 15 minutos, pero a todos los otros tiempos fue menor a mayor concentración de larvas. La experiencia realizada indicaría que in vivo, la cantidad de LRN y el tiempo que permanecen en circulación determinan el grado de desializacion eritrocitaria, y por lo tanto el riesgo de activación T y de alteraciones hemorreológicas en el hospedador.

Palabras clave: Larvas recién nacidas; Trichinella spiralis; Agregación eritrocitaria; Cinética.

Abstract

Newborn larvae of Trichinella spiralis: kinetics of erythrocyte aggregation

The aim of this work was to study the kinetics of erythrocyte aggregation produced by two concentrations of Trichinella spiralis newborn larvae (NL). Work was performed with 5 erythrocyte suspensions incubated with 500 and 1000 ± 100 NL/mL for 120 minutes, taking samples at the initial time and every 15 minutes. The respective controls were incubated in the same way with saline solution. The Polybrene titration method calculating the CexpST and the variance analysis technique with the multiple comparisons according to Tukey were applied. The results showed that the average coefficient decreased with the rise in incubation time for both NL concentrations. The average coefficient did not present significant differences between the initial time and 15 minutes, nor between 60 and 75 minutes in the treatment with 1000 NL/mL, while there were no differences between 0,15 and 30 minutes in the treatment with 500 NL/mL. All other differences were significant for both larval concentrations. The average value of CexpST did not differ significantly between the two time treatments at zero time and 15 minutes, but at all other times it was less at a higher concentration of larvae. The experience carried out would indicate that in vivo, the amount of NL and the time that they remain in circulation determines the degree of erythrocyte desialylation, and therefore, the risk of T activation and hemorrheological alterations in the host.

Keywords: Newborn larvae; Trichinella spiralis; Erythrocyte aggregation; Kinetics.

Resumo

Larvas recém-nascidas da Trichinella spiralis: cinética de agregação eritrocitária

O objetivo desse trabalho foi estudar a cinética de agregação eritrocitária produzida por duas concentrações de larvas recém nascidas (LRN) de Trichinella spiralis. O trabalho foi feito com 5 suspensões eritrocitárias incubadas com 500 e 1.000 ± 100 LRN/mL por 120 minutos, colhendo amostras no tempo inicial e a cada 15 minutos. Os respectivos controles foram incubados da mesma forma com solução salina. Foi aplicado o método de titulação por Polibreno e se calculou CexpST. e a técnica de análise da variância com as comparações múltiplas de acordo com Tukey. Os resultados mostraram, para ambas as concentrações de LRN, que o o coeficiente médio diminuiu com o aumento do tempo de incubação. No tratamento com 1.000 LRN/mL o coeficiente médio não mostrou diferenças significativas no tempo 0 e 15 minutos ou entre 60 e 75 minutos, ao passo que não houve diferenças com 500 LRN/mL entre tempos 0, 15 e 30 minutos. Todas as restantes diferenças foram significativas para ambas as concentrações de larvas. O valor médio de CexpST não diferiu significativamente entre os dois tratamentos no tempo de 0 e 15 minutos, mas em todos os outros tempos foi menor em maior concentração de larvas. A experiência realizada indicaria que in vivo a quantidade de LRN e o tempo que permanecem em circulação determina o grau de dessialização dos eritrócitos e, portanto, o risco de ativação T e de alterações hemorreológicas no hospedeiro.

Palavras-chave: Larvas recém-nascidas; Trichinella spiralis; Cinética; Agregação eritrocitária.


 

Introducción

La triquinosis es una enfermedad zoonótica cosmopolita de origen alimentario. El agente causal es un nematodo que pertenece al género Trichinella que abarca varias especies con diferente distribución geográfica, siendo Trichinella spiralis la que causa la mayoría de los casos de infección humana en todo el mundo. El descubrimiento de esta especie fue realizado por James Paget en Londres, quien la observó en el músculo del diafragma de un albañil que había muerto de tuberculosis (1).
El ciclo de vida de este nematodo es de tipo autoheteroxeno lo que significa que el mismo hospedador alberga a las formas adultas, a las larvales recién nacidas y a las larvales musculares que serán infectantes para un nuevo hospedador. Las hembras ovovivíparas del parásito depositan larvas recién nacidas (LRN) en la mucosa intestinal aproximadamente a los 7 días de la infección, las cuales se distribuyen por todo el cuerpo mediante la circulación linfática y sanguínea, pero solamente aquellas que llegan al músculo estriado pueden continuar su evolución para alcanzar la capacidad infectante (2)(3).
La patogenicidad de T. spiralis es mayor que la del resto de las especies del género debido a que las hembras producen el número más alto de LRN (4).
Experiencias previas comunicaron que el contacto de los eritrocitos con concentrados de LRN provoca la disminución de ácido siálico globular, y ocasiona alteraciones en la agregación eritrocitaria y en el comportamiento hemorreológico de la sangre (5)(6), así como también exposición del antígeno críptico T (7)(8).
El objetivo de este trabajo fue estudiar la cinética de agregación eritrocitaria producida por dos concentraciones distintas de LRN.

Materiales y Métodos

Muestras
LARVAS RECIÉN NACIDAS de T. spiralis (LRN)
Se trabajó con ratones CBi infectados con T. spiralis, provistos por el Bioterio del Instituto de Genética Experimental de la Facultad de Ciencias Médicas (UNR). Entre los 6 y 13 días posinfección, se obtuvieron hembras grávidas del intestino delgado de los ratones por
cirugía, las cuales fueron incubadas en 100 μL de medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino y 250 μg/mL de gentamicina durante 18 horas a 37 ºC en atmósfera de CO2 al 5%. Posteriormente, las LRN fueron separadas de las hembras adultas y recolectadas en el mismo medio (9). Se realizó el recuento, por duplicado, en microscopio óptico y se prepararon concentrados larvales de 500±100 LRN/mL y 1.000±100 LRN/mL.
Los protocolos para la obtención de LRN son los utilizados en líneas de investigación de las Facultades de Ciencias Médicas y de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR), los cuales han sido aprobados por los Comités de Bioética de ambas instituciones.

GLÓBULOS ROJOS EN MEDIO SALINO (GR)
Se trabajó con suspensiones de eritrocitos frescos provenientes de dadores humanos sanos y voluntarios, lavados 3 veces en solución salina.

Métodos
Incubación de los GR
Se realizaron 5 experiencias en las cuales se incubaron 200 µL de eritrocitos con igual volumen de cada uno de los dos concentrados de LRN (GR tratados) durante 120 minutos, a 37 ºC con agitación controlada, tomando 20 µL de muestra al tiempo inicial (tiempo 0) y cada 15 minutos (tiempo 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 y 120). Los respectivos controles (GR control) se incubaron de la misma manera con solución salina.
Al finalizar cada tiempo, los GR control y tratados se lavaron en solución salina y se prepararon suspensiones al 20% a partir de cada uno de los sedimentos, para aplicación del método de titulación de la agregación.
Método de titulación de la agregación por Polibrene en los GR control
El método se aplicó simultáneamente en los GR control y en los mismos eritrocitos incubados con los dos concentrados de LRN. Se hicieron diluciones seriadas progresivas de Polibrene en solución salina (puro, 1:2; 1:4; 1:8……1:128). Posteriormente se colocaron en una placa de vidrio, una gota de la suspensión eritrocitaria al 20% y una gota de cada una de las diluciones de Polibrene. Se mezcló con varilla de vidrio y se homogeneizó por movimientos circulares de la placa durante un minuto, hasta que se produjo la agregación entre los eritrocitos con carga negativa y el policatión Polibrene (10).
Se evaluó la carga aniónica del control y de los GR incubados con las LRN, determinando el título como la última dilución del policatión que presentó agregación. Se consideró significativa una diferencia de título ≥2 diluciones entre ambos (11). A los fines de comparar la agregación de los glóbulos incubados con LRN, en relación a la del respectivo control, se la semicuantificó con cruces (4+, 3+; 2+: 1+; +/-; -) y se asignó un score a cada una según Goudemand y Marsalet (12), de acuerdo con la siguiente escala:
4 + 10
3 + 8
2 + 5
1 + 2
+/-1 (agregación apenas visible)

Se determinó el coeficiente experimental de agregación (CexpST) como el cociente entre el score total de la agregación de los eritrocitos incubados con las LRN y el score total de la agregación de los eritrocitos control (11).
Este coeficiente fue igual a 1 cuando no hubo modificación en la agregación globular por acción del parásito y fue igual a 0 cuando no se observó agregación por efecto del tratamiento, o sea que se habría producido una remoción total de la carga aniónica eritrocitaria.

Análisis estadísticos
Se aplicó la técnica de análisis de la variancia para un modelo longitudinal mixto considerando como factores fijos: concentración de larvas del parásito a dos niveles (500 LRN/mL y 1.000 LRN/mL) y tiempo de incubación a 9 niveles (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 y 120 minutos) y como factor aleatorio: dador (5 dadores voluntarios sanos). Luego fueron aplicadas comparaciones múltiples según Tukey, con CexpST como la variable respuesta. Se consideró significativo cuando p<0,05 (13).

Resultados

Los resultados del análisis estadístico concluyeron que existe efecto significativo de la interacción tratamiento-tiempo (p=0,001), por lo que se efectuaron las comparaciones entre tiempos para cada tratamiento y entre tratamientos para cada tiempo.
Al efectuar las comparaciones entre tiempos para cada tratamiento, se observó que para ambas concentraciones de LRN el valor promedio de CexpST disminuyó significativamente con el aumento del tiempo de incubación.
En el tratamiento con 1.000 LRN/mL el coeficiente promedio no presentó diferencias significativas entre el tiempo 0 y 15 minutos, ni entre 60 y 75 minutos, mientras que en el tratamiento con 500 LRN/mL no hubo diferencias significativas entre el valor promedio del coeficiente entre los tiempos 0, 15 y 30 minutos. Todas las restantes diferencias fueron significativas para las dos concentraciones larvales.
La comparación entre tratamientos para cada tiempo, mostró que a tiempo 0 y 15 minutos el valor promedio de CexpST no difirió significativamente entre los dos tratamientos, pero que a todos los otros tiempos estudiados fue significativamente menor a mayor concentración de larvas, indicando que a los 30 minutos de incubación y hasta el final de la experiencia, la agregación disminuyó a mayor cantidad de larvas utilizadas.
En la totalidad de los GR tratados con 1.000 LRN/mL, el título de la agregación disminuyó significativamente en relación al del control a partir de los 30 minutos de incubación, mientras que en los GR tratados con 500 LRN/mL, solo lo hicieron 4 de las 5 suspensiones a partir de los 90 minutos.

Discusión y Conclusiones

La migración de las LRN por diferentes tejidos puede causar alteraciones por su estadía transitoria y/o por los daños causados en la microcirculación (14-17).
Los resultados obtenidos en este trabajo se correlacionaron con los de experiencias previas en las que se comunicó, en eritrocitos tratados con LRN, que el aumento del tiempo de incubación produjo la disminución de la carga aniónica (18), y que la agregación globular observada a los 60 minutos de contacto fue mayor que al tiempo 0, y a los 120 minutos mayor que a los otros dos tiempos (5).
Las dos concentraciones larvales estudiadas en esta experiencia provocaron en el total de las muestras la disminución de la agregación eritrocitaria con el aumento del tiempo de tratamiento, lo cual se reflejó en la disminución significativa del valor promedio del CexpST a partir de los 15 minutos con 1.000 LRN/mL y a partir de los 30 minutos con la menor concentración larval.
La comparación del efecto de la concentración de LRN en la pérdida de carga aniónica eritrocitaria, mostró que a los dos primeros tiempos no hubo diferencias significativas en el valor medio del coeficiente entre los tratamientos con 500 o 1.000 LRN/mL, pero a partir de los 30 minutos ya fue significativa la disminución de la agregación debido a la concentración de larvas utilizadas en la incubación de los glóbulos.
La experiencia realizada permite concluir que los resultados obtenidos in vitro indicarían que in vivo la cantidad de LRN y el tiempo que permanecen en circulación, determinan el grado de desialización eritrocitaria, y por lo tanto el riesgo de autoaglutinación eritrocitaria, hemólisis, trombocitopenia y trombosis en el paciente adulto por activación T (7)(8)(19), así como también la intensidad de las alteraciones hemorreológicas en el hospedador (6).


Figura 1
. Valor del CexpST en los 9 tiempos estudiados para cada uno de los 5 tratamientos realizados con las dos concentraciones de LRN.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 29 de noviembre de 2018
Aceptado: 12 de marzo de 2019

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