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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.54 no.2 La Plata jun. 2020

 

MICROBIOLOGÍA

Arcobacter butzleri, un agente zoonótico en leche bovina

 

Diana Inés Hualpa Salinas1a, Rosa Janneth Simaluiza Masabanda2a*, William Rodrigo Sauca Poma3a, Heriberto Fernández Jaramillo4b

1 Magíster, Ingeniera en Industrias Agropecuarias.
2 Magíster, Bioquímico Farmacéutico.
3 Bioquímico Farmacéutico.
4 Ph.D., Licenciado en Tecnología Médica.
a Universidad Técnica Particular de Loja, Departamento Ciencias de la Salud, Ecuador.
b Instituto de Microbiología Clínica. Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
* Autor para correspondencia.
Correspondencia Dra. ROSA JANNETH SIMALUIZA-MASABANDA Universidad Tecnica Particular de Loja Departamento Ciencias de la Salud. San Cayetano Alto s/n. LOJA, Ecuador Correo electronico: rjsimaluiza1@utpl.edu.ec


Resumen

Para la búsqueda de especies de Arcobacter fueron estudiadas 50 muestras de leche bovina obtenidas de los centros de acopio de la empresa láctea Ecolac, de las provincias de Loja y Zamora Chinchipe, Ecuador, y se aisló un total de ocho cepas de Arcobacter butzleri (16%). Esta frecuencia de aislamiento concuerda y está dentro de los rangos descriptos en la literatura. Todas las cepas aisladas fueron sensibles a gentamicina. Se encontró alta frecuencia de resistencia a tetraciclina (6/8 cepas) y a ciprofloxacina (4/8 cepas). Se verificó la ocurrencia de multirresistencia en tres de las ocho cepas aisladas.

Palabras clave: Arcobacter; Zoonosis; Leche.

Abstract

Arcobacter butzleri, a zoonotic agent in bovine milk

A total of 50 samples of bovine milk obtained from bulk tanks milk of the collection centers belonging to the company ECOLAC, of the provinces of Loja and Zamora Chinchipe, Ecuador, were studied for Arcobacter species diagnosis, being isolated 8 strains of Arcobacter butzleri (16%). This frequency of isolation agrees and falls within the ranges described in the literature. All the isolated strains were susceptible to gentamicin. High resistance levels to tetracycline and ciprofloxacin were found with 6/8 and 4/8 resistant strains respectively. Multi-resistance was found in three of the eight isolated strains.

Keywords: Arcobacter; Zoonosis; Milk.

Resumo

Arcobacter butzleri, um agente zoonótico em leite Bovino

Foram estudadas, para a pesquisa de espécies de Arcobacter, 50 amostras de leite bovino, obtidas dos centros de coleta da empresa de laticínios ECOLAC, das províncias de Loja e Zamora Chinchipe, Equador, sendo isoladas em total 8 cepas de Arcobacter butzleri (16%). Esta frequência de isolamento concorda e está dentro dos níveis descritos na literatura. Todas as cepas isoladas foram sensíveis à gentamicina. Foi encontrada alta frequência de resistência à tetraciclina (6/8 cepas) e à ciprofloxacina (4/8 cepas), sendo verificada a ocorrência de multirresistência em três das oito cepas isoladas.

Palavras-chave: Arcobacter; Zoonoses; Leite.


 

Introducción

Los primeros aislamientos de especies del genero Arcobacter fueron realizados a partir de fetos bovinos y porcinos en 1977 y 1978 pero fueron descriptos, inicialmente como Vibrio/Spirillum. Mas tarde se les denomino “aerotolerant Campylobacter-like microorganisms” para, finalmente, ser incluidos en 1991 dentro del genero Arcobacter, perteneciente a la familia Campylobacteraceae (1).
Desde entonces, el genero Arcobacter ha experimentado una gran expansion y actualmente comprende 27 especies. Once de ellas han sido aisladas de muestras ambientales, siete de mariscos y moluscos y nueve de animales (aves y mamiferos) y de alimentos de origen animal (1). De entre las ultimas nueve especies, solo Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii y A. thereius han sido reconocidas como especies zoonoticas emergentes y a la vez, como patogenos de transmision alimentaria capaces de producir diarrea y otros procesos infecciosos en el ser humano. Tambien han sido asociadas a abortos, mastitis y diarrea en animales domesticos (1-4).
A. butzleri
es la especie de este genero mas frecuentemente aislada, tanto de muestras clinicas como ambientales, de animales y de alimentos de origen animal, lo que demuestra su alto nivel de adaptacion a diferentes nichos (5). En los ultimos anos su frecuencia de aislamiento desde casos clinicos ha ido en aumento y ha llegado a ser considerado como un riesgo para la salud humana (2). Por otro lado, A. butzleri ha sido aislado con relativa alta frecuencia de materia fecal de animales sanos, incluyendo bovinos, los cuales pueden ser reservorio y fuente de contaminacion de esta bacteria para alimentos de origen animal, como la leche por ejemplo (3) (4) (6).
Diversos estudios han demostrado la presencia de A. butzleri en leche con tasas de aislamiento que fluctuan entre el 5,8 y el 46% (3) (6) (7), como tambien se ha demostrado que su capacidad de supervivencia en leche es de seis dias, tanto a 4 como a 10 °C, reforzando la posibilidad de que este alimento pueda ser vehiculo de transmision de A. butzleri para el ser humano (8). Considerando que A. butzleri esta adquiriendo cada vez mas importancia en la salud publica y que el conocimiento a este respecto es reducido en America Latina, el objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia y los niveles de resistencia antimicrobiana de A. butzleri aislado de leche bovina en el sur de Ecuador.

Materiales y Métodos

Fueron estudiadas 50 muestras de leche bovina de 100 mL cada una, obtenidas de los centros de acopio de la empresa lactea ECOLAC, de las provincias de Loja y Zamora Chinchipe, Ecuador. Las muestras fueron transportadas al laboratorio de microbiologia en recipientes esteriles y bajo refrigeracion hasta su posterior analisis.
Las muestras de leche fueron homogeneizadas en una proporcion de 1:10 (9) colocando una alicuota de 12,5 mL de leche en 112,5 mL de Arcobacter Enrichment Broth adicionado de suplemento CAT (cefoperazona, anfotericina B, teicoplanina), extracto de levadura al 1% y sangre al 5%, el cual fue incubado a 30 °C durante 72 horas en aerobiosis. Finalizado el periodo de enriquecimiento, una alicuota de 200 μL de cada caldo fue filtrada por membrana de triacetato de celulosa de 0,45 μm de poro sobre agar sangre enriquecido con 1% de extracto de levadura (metodo de filtracion pasiva) (4) (9). Las placas fueron incubadas por 48 a 72 horas a 30 °C en aerobiosis. Las cepas aisladas fueron identificadas preliminarmente por sus caracteristicas fenotipicas (bacilos gram negativos, moviles, oxidasa y catalasa positivos) (4). La identificacion definitiva fue realizada mediante la prueba de PCR multiple propuesta por Douidah et al (10) que caracteriza las cinco especies de Arcobacter mas comunmente asociadas al ser humano y a mamiferos (A. butzleri, A. cibarius, A. cryaerophilus, A. skirrowii y A. thereius).
La sensibilidad a gentamicina, ciprofloxacina, eritromicina, ampicilina y tetraciclina fue determinada por difusion con discos, utilizando el metodo estandarizado recomendado por el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing- EUCAST (11), adaptado a las condiciones de crecimiento de A. butzleri. Los antibiogramas fueron realizados en agar Mueller-Hinton adicionado de un 5% de sangre equina desfibrinada y 20 mg/L de â-NAD. Antes de ser inoculadas, las placas fueron puestas a secar, abiertas y a 35 °C por 15 min. La turbidez de cada inoculo fue ajustada al tubo 0,5 de la escala de McFarland. Una vez inoculadas y agregados los discos, las placas fueron incubadas a 35-37 °C, en aerobiosis por 24 h para realizar, posteriormente, la lectura de los resultados. Las placas que a las 24 h mostraron escaso desarrollo fueron incubadas por 24 h adicionales, bajo las mismas condiciones. Los halos de inhibicion fueron medidos por al anverso de la placa, sin tapa, utilizando un calibre y luz reflejada. Como control fue utilizada la cepa A. butzleri UACh 001, de sensibilidad conocida y de uso habitual en nuestros laboratorios.
Para definir sensibilidad o resistencia, fueron homologados para A. butzleri los puntos de corte de ciprofloxacina [S ≥26 mm, R <26 mm], eritromicina [S ≥20 mm, R <20 mm] y tetraciclina [S ≥30 mm, R <30 mm] (11) determinados por EUCAST en Campylobacter jejuni. Como las tablas actuales de EUCAST no proporcionan puntos de corte para gentamicina ni para ampicilina (11), en estos casos fueron utilizados los puntos de corte sugeridos el año 2019 por este Comite (gentamicina S ≥17 mm, R <17 mm; ampicilina S ≥19 mm, R <14 mm) (12). Fueron consideradas como multirresistentes, aquellas cepas que presentaron resistencia simultanea al menos a tres de los antimicrobianos ensayados (7).

Resultados

De las 50 muestras de leche estudiadas, ocho (16%) fueron positivas para Arcobacter. Todos los aislamientos correspondieron a la especie A. butzleri. A las cepas aisladas se les realizo antibiograma y se observo, como se indica en la Tabla I, que todas fueron sensibles a gentamicina. Solo una cepa (cepa N°8) fue sensible a todos los antibioticos ensayados mientras que las siete restantes presentaron diferentes grados de resistencia. Se observo una alta frecuencia de resistencia a tetraciclina (6/8 cepas), seguida por ciprofloxacina con 4/8 cepas y por eritromicina y ampicilina con 3/8 cepas cada una. Tres de las ocho cepas aisladas resultaron ser multirresistentes.

Tabla I. Sensibilidad a los antibióticos de ocho cepas de Arcobacter butzleri aisladas de leche bovina

Discusión y Conclusiones

La frecuencia de aislamiento de especies de Arcobacter desde leche cruda, reportada en varios paises, fluctua entre el 5,8 y el 46% (3)(6)(7). El 16% de muestras positivas encontradas en este estudio esta dentro del rango de los hallazgos hechos por otros autores y coincide con la frecuencia encontrada por Caruso et al. en Italia utilizando PCR como herramienta diagnostica (13). Coincidiendo con los estudios de Caruso et al. (13) y tambien con los de Parisi et al. (7) y de Serraino y Giacometti (14), la unica especie aislada fue A. butzleri la cual, en general, es la aislada con mayor frecuencia de varios tipos de muestra, incluyendo la leche (3) (5). En America Latina, la unica referencia sobre Arcobacter en leche se origino en Brasil, donde el 18,8% de las muestras fueron positivas para Arcobacter, y se aislaron las especies A. cryaerophilus (15,6%) y A. butzleri (3,1%) (9). Concordando con Collado y Figueras (3) pensamos que tal vez las diferencias observadas en la literatura con relacion a las tasas de aislamiento de Arcobacter en leche puedan deberse, no solo a la falta de protocolos estandarizados y universalmente aceptados, sino tambien a factores del entorno donde se toman las muestras, como son el nivel de higiene en el lugar de produccion, la presencia de otras aves e insectos, la calidad del agua utilizada, factores climaticos, la sanidad del rebano, entre otros.
Como se senala en la Tabla I, siete de las cepas aisladas presentaron resistencia al menos a uno de los antibioticos ensayados mientras que una fue sensible a todos ellos. Ninguna cepa fue resistente a gentamicina, pero un alto numero de ellas lo fue para tetraciclina (6/8) y ciprofloxacina (4/8). La presencia de resistencia a eritromicina y ampicilina fue mas baja. Adicionalmente, fueron aisladas cepas mutirresistentes (3/8). Estos resultados coinciden con los de Parisi et al. (7), quienes encontraron en cepas de A. butzleri aisladas
de leche, una alta frecuencia de genes de resistencia a fluoroquinolonas y tetraciclina, una frecuencia menor de determinantes geneticos de resistencia para eritromicina y ampicilina y la coexistencia de varios de ellos, denotando multirresistencia. Datos similares han sido presentados tambien por Shah et al. (15) en ganado bovino. La existencia de cepas de Arcobacter resistentes y multirresistentes en el ganado explica la presencia de este tipo de cepas en leche, de lo que se puede inferir, como ocurre con Campylobacter, que esta resistencia pueda ser atribuida al uso de estos antibioticos en medicina veterinaria (14).
Teniendo presente que i) A. butzleri se encuentra contaminando leche bovina destinada a consumo humano, ii) que tiene capacidad de sobrevivencia en leche (8) y de contaminar alimentos lacteos como diferentes tipos de quesos (9) y iii) que ademas presenta resistencia a varios antibioticos de uso clinico, se hace necesario realizar estudios de mas largo alcance para definir la real magnitud del problema de la resistencia a los antibioticos y de los aspectos epidemiologicos asociados a esta bacteria zoonotica emergente.

Fuentes de financiación

Proyecto PROY_CCSAL_1283

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 8 de julio de 2019
Aceptado: 27 de enero de 2020

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