INMUNOHEMATOLOGÍA

Titulación de hemolisinas en concentrados plaquetarios obtenidos a partir de buffy coat de donantes voluntarios de sangre de grupo “O” Rh D positivo

 

Sandy Carolina Jácome Mancheno^1a, Melba Noemí López Molina^1a, Martha Elizabeth Gabela Baquero^2c, Rosa F. Chiriboga-Ponce^3a,b*

¹ Bioquímica Clínica.
² Licenciada en Laboratorio Clínico.
³ Master en Salud Pública, Master en Medicina Transfusional y Terapia Celular.
^a Facultad de Medicina, carrera de Bioquímica Clínica, Pontificia Universidad Católica del Ecuador.
^b Centro de Investigación para la Salud en América Latina, Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Calle Pambahacienda y San Pedro, Campus Nayón-Quito, Ecuador.
^c Hospital de Especialidades Carlos Andrade Marín, Av. Universitaria, Quito 170103, Ecuador.
* Autor para correspondencia.
Correspondencia Master ROSA F. CHIRIBOGA-PONCE. Avenida 12 de octubre 1076 y Roca Quito - Ecuador Telefono: 593-22991680 593-969011129 Fax: 593-22991689 Correo electronico: rfchiriboga@puce.edu.ec

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Resumen

Los posibles efectos adversos que se producen en transfusiones incompatibles ABO son un riesgo latente en el uso de concentrados de plaquetas grupo O, por lo que la titulación de hemolisinas anti-A/B constituye una de las estrategias para su prevención. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de títulos de hemolisinas de isotipos IgG e IgM anti-A/B en donantes de sangre. Se trató de un estudio descriptivo, transversal y aleatorio simple con un tamaño muestral de 308 muestras. Se aplicó la metodología en tubo, gel salino y anti-inmunoglobulina IgG y, mediante soluciones seriadas, se evidenció el título. Adicionalmente, se realizó una encuesta sobre los posibles factores de riesgo para el aumento de estos títulos. Se aplicó estadística descriptiva mediante el uso del software informático SPSS versión 22.0 y la relación entre variables independientes a través del análisis estadístico de Chi-cuadrado y, para establecer la concordancia de las lecturas visuales de las tarjetas de gel, se aplicó el índice kappa. Se determinó la existencia de hemolisinas de isotipo IgG e IgM anti-A/B de títulos superiores a 1/64. Existió una relación estadísticamente significativa entre embarazos y títulos de IgG anti-A/B >1/128 y el aumento de hemolisinas de isotipo IgM y la ingesta de probióticos. Los resultados demostraron la necesidad de implementar la titulación de hemolisinas previo a la transfusión de concentrados plaquetarios no isogrupo, por lo que se recomienda una investigación de riesgo-beneficio y el seguimiento de pacientes con transfusiones de concentrados plaquetarios incompatibles ABO.

Palabras clave: Hemolisina; Titulación; Hemolisinas anti-A/B; Isotipos IgG-IgM; Incompatibilidad ABO.

Abstract

Titration of hemolysins in platelet concentrates obtained from buffy coat from voluntary donours of blood group“O” Rh D positive

The possible adverse effects that occur in incompatible ABO transfusions are a latent risk in the use of group O platelet concentrates, so the titration of anti-A/B hemolysins is one of the strategies for its prevention. The objective of this study was to determine the frequency of hemolysins titers IgG and IgM anti-A/B isotypes in blood donours. It was a simple randomized descriptive cross-sectional study with a sample size of 308 samples. The methodology was applied in tube, saline gel and anti-IgG anti-immunoglobulin and by means of serial solutions the title was verified. Additionally, a survey was conducted on the possible risk factors for the increase in securities. Descriptive statistics were used through the application of the SPSS version 22.0 software and the relationship between independent variables through the Chi-square statistical analysis and the kappa index was applied to match the visual readings of the gel cards. The existence of IgG and IgM anti-A/B isotype hemolysins of titers greater than 1/64 was determined. There was a statistically significant relationship between pregnancies and anti-A/B IgG titres>1/128; and the increase in IgM isotype hemolysins and probiotic intake. The results demonstrate the need to implement hemolysin titration prior to transfusion of non-isogroup platelet concentrates, so a risk-benefit investigation and follow-up of patients with transfusions of ABO incompatible platelet concentrates is recommended.

Keywords: Hemolysins; Titration; Anti A/B hemolysins; IgG-IgM isotypes; ABO incompatibility.

Resumo

Titulação de hemolisinas em concentrados de plaquetas obtidos a partir de buffy coat de doadores voluntários de sangue do grupo “O” Rh D positivo

Os possíveis efeitos adversos que ocorrem em transfusões incompatíveis ABO são um risco latente no uso de concentrados de plaquetas do grupo O, portanto a titulação de hemolisinas anti-A/B é uma das estratégias para sua prevenção. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência de títulos de hemolisinas de isotipos IgG e IgM anti-A/B em doadores de sangue. Trata-se de um estudo descritivo transversal aleatório simples, com tamanho de amostra de 308 amostras. A metodologia foi aplicada em tubo, gel salino e anti-imunoglobulina IgG e utilizando soluções em série, o título foi verificado. Além disso, foi realizada uma pesquisa sobre os possíveis fatores de risco para o aumento destes títulos. A estatística descritiva foi utilizada através da aplicação do software informático SPSS versão 22.0 e a relação entre variáveis independentes por meio da análise estatística do qui-quadrado e, para estabelecer a concordância com as leituras visuais dos cartões de gel, o índice kappa foi aplicado. Foi determinada a existência de hemolisinas de isotipo IgG e IgM anti-A/B de títulos maiores que 1/64. Existiu uma relação estatisticamente significante entre gestações e títulos de IgG anti-A/B>1/128; e o aumento de hemolisinas do isotipo IgM e a ingestão de probióticos. Os resultados demonstram a necessidade de implementar a titulação da hemolisina antes da transfusão de concentrados de plaquetas não isogrupo, por isso, recomenda-se uma investigação de risco-benefício e acompanhamento de pacientes com transfusões de concentrados de plaquetas incompatíveis com ABO.

Palavras-chave: Hemolisinas; Titulação; Hemolisinas anti A/B; Isotipos IgG-IgM; Incompatibilidade ABO.

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Introducción

En los servicios de medicina transfusional ecuatorianos se ha generalizado el uso terapeutico de concentrados plaquetarios no isogrupo debido a que, probablemente, existe un mayor numero de donantes de grupo O. Sin embargo, la transferencia de anticuerpos anti-A/B desde el concentrado plaquetario al receptor de un grupo sanguineo diferente puede desencadenar reacciones hemoliticas ⁽¹⁾. Las personas de grupo sanguineo “O” presentan anticuerpos naturales de isotipo IgM anti-A/B en titulos inferiores a 1/64; sin embargo, estos isotipos pueden aumentar o puede producirse la estimulacion de hemolisinas de tipo IgG como resultado de la exposicion a varios factores como embarazos, abortos, transfusiones o ingesta de probioticos ⁽²⁾. Mantener la compatibilidad ABO durante la transfusion de concentrados plaquetarios (CPQ) es clinicamente importante debido a que investigaciones recientes han determinado que existe un aumento en el titulo de hemolisinas, de isotipos IgM e IgG, que ocasionan hemolisis en pacientes de grupos sanguineo A o B. Sin embargo, otros autores mencionan que no ameritan su deteccion por no reportarse casos adversos. Algunas investigaciones han comprobado que a mayor titulo de anticuerpos la reaccion hemolitica es severa y que a titulos bajos el organismo es capaz de diluir estas sustancias y atenuar el efecto ^{(2) (3)}. El proposito de este estudio fue establecer la frecuencia de donantes de CPQ con titulos altos de anticuerpos anti-AB isotipos IgM e IgG y de esta manera determinar si es necesaria la implementacion de pruebas de deteccion de titulos de anticuerpos en CPQ utilizados en pacientes de grupo sanguineo AB.

Materiales y Métodos

Tipo de estudio
Se realizo un estudio descriptivo, transversal en donantes de sangre del Hospital de Especialidades Carlos Andrade Marin, Quito-Ecuador. Se determino un tamano muestral de 308 CPQ con un 95% de confianza y un 5% de error.

Aspectos éticos
Se solicitaron los permisos al Comite de Etica de la Investigacion en Seres 2018-19MB y a la Direccion Nacional de Inteligencia de la Salud – DNIS aprobacion MSP-DNGA-SG-10-2019-2706-E.

Metodología
Se utilizo la metodologia en gel, tarjetas Coombs lote: 50540.04.07, kits de celulas A y B, de la casa comercial Bio-Rad, Lote 45101.35.1. Titulación de hemolisinas anti-A y anti-B Se realizo en tecnica de tubo, mediante diluciones seriadas hasta 1:256, con 100 μL de suero del donante y 100 μL de solucion salina. Para ello se utilizaron pipetas calibradas y caracterizadas por ELICROM (acreditadas por SAE).

Detección de IgG e IgM por técnica en gel
En las tarjetas de gel, previamente rotuladas con el codigo de identificacion proporcionado por las investigadoras, se colocaron 50 μL de cada una de las diluciones (titulacion de hemolisinas), tanto en las tarjetas de Coombs IgG como en las de gel salino. Posteriormente se adicionaron 40 μL de celulas comerciales A1/B (Bio- Rad) en todos los pocillos. Para IgG la tarjeta de Coombs se llevo a incubacion a 37 ^oC por 15 minutos y se centrifugo a 1.030 r.p.m. por 10 min. Para IgM las tarjetas de gel salino se incubaron a temperatura ambiente por 15 minutos y se centrifugaron a 1.030 r.p.m. por 10 min. En ambos casos se determino hasta que dilucion presentaban una reaccion positiva. Para la interpretacion y el informe de resultados se utilizo la plantilla de lectura proporcionada por la casa comercial Bio-Rad.

Análisis estadístico
Se utilizo estadistica descriptiva y para la relacion de las variables se aplico la prueba de Chi 2 corregido (razon de verosimilitud) con un á de 0,05 y se aplico el indice kappa.

Control de calidad
Se utilizo el suero de una paciente multipara con titulos IgM (1/512) e IgG (1/256) verificados en tres replicas de cada dilucion realizada e interpretada por dos tecnicos, y de un donante masculino que no tomaba probioticos ni habia recibido transfusiones. Se obtuvieron titulos de IgM e IgG (1/32) bajo la misma metodologia de analisis. Se aplico el indice kappa de concordancia a la lectura de resultados y se obtuvo un grado de acuerdo inter-operador altamente significativo, con un valor entre 0,864 y 0,916.

Resultados

Se analizo un total de 308 muestras de donantes de CPQ, de las cuales el 50% provenian de mujeres y el 50% de hombres, de una muestra tomada al azar. Presencia de hemolisinas IgG anti-A/B Se identifico la existencia de hemolisinas de tipo IgG anti-A y anti-B con titulos de hasta 1/512 (3 CPQ); los mas frecuentes observados fueron 1/64 (125 CPQ) y 1/128 (115 CPQ), y el mas prevalente fue el isotipo anti-A (Fig. 1).

Figura 1. Presencia de hemolisinas isotipo IgG en muestras de donantes de concentrado de plaquetas.

IgM anti-A/B
Se determino que existian CPQ con titulos de 1/256 (57 CPQ) y 1/128 (98 CPQ) y unicamente 3 con titulo de 1/512 de anti-A. El titulo mas frecuente encontrado en este tipo de hemolisinas fue anti-B 1/256 (89 CPQ). (Fig. 2).

Figura 2. Presencia de hemolisinas isotipo IgM en muestras de donantes de concentrado de plaquetas.

Género
El analisis de la relacion entre la presencia de hemolisinas y el genero determino que el masculino presento el 35,96% (54 CPQ) anti-A de isotipo IgM con titulos de 1/128, mientras que en el femenino existia un porcentaje de 21,43% (33 CPQ) de anti-A IgM en titulos de 1/256. Sin embargo, esta relacion no fue estadisticamente significativa (p<0,005). Las hemolisinas anti-A/B de isotipo IgG presentaron titulos de 1/256 y 1/128 en el genero femenino. Los titulos de hemolisinas anti-A/B isotipo IgG 1/64 se identificaron mayoritariamente en hombres, y esta relacion fue estadisticamente significativa, p<0,005. (Tabla I). No existio relacion estadistica entre la presencia de hemolisinas con la edad.

Tabla I. Relación del género y la presencia de anti-A y anti-B de isotipo IgG.

Embarazos
La relacion entre embarazos y la existencia de hemolisinas anti-A y anti-B de isotipo IgG demostro una dependencia altamente significativa con un valor de p<0,005 (Tabla II).

Tabla II. Presencia de hemolisinas anti-A y anti-B de isotipo IgG en donantes que informan embarazos previos.

Abortos
No se obtuvo una relacion estadisticamente significativa entre la existencia de hemolisinas de isotipo IgM. Sin embargo, en las hemolisinas de isotipo IgG se identifico que, en la muestra de donantes multiparas, existia una mayor probabilidad de alcanzar titulos de hasta 1/512 de hemolisinas anti-B y 1/256 de anti-A, y esta diferencia fue significativa con un valor de p<0,005 (Tabla III).

Tabla III. Presencia de hemolisinas anti-A y anti-B de isotipo IgG en donantes que informan abortos.

Probiótico
El analisis de resultados establecio que el desarrollo de anticuerpos anti-A/B de isotipo IgM estaba relacionado a la toma de probioticos en forma semanal y no diariamente, resultados estadisticamente significativos con un valor de p<0,005 (Tabla IV). Esto contrasto con la presencia de hemolisinas isotipo IgG cuyo analisis no fue estadisticamente significativo (p=0,122), por lo que no estaria relacionado con el uso de probioticos.

Tabla IV. Relación entre los títulos de anti-A y anti-B de isotipo IgM con la ingesta de probióticos.

Discusión y Conclusiones

Las normas de la Asociacion Americana de Bancos de Sangre (AABB) han mencionado que el servicio de medicina transfusional deberia tener una politica relacionada a la transfusion de hemocomponentes no isogrupos que pudieran ocasionar reacciones transfusionales ⁽⁴⁾. La reduccion de este riesgo ha tomado especial interes en investigaciones relacionadas al uso de plasmas incompatibles. En esta investigacion se ha determinado la existencia de titulos elevados de hemolisinas isotipo IgG anti-A/B, asi como del isotipo IgM. En paises europeos existen politicas universales para prevencion de reacciones hemoliticas, sin embargo, no han sido implementadas de forma uniforme ⁽⁵⁾. En contraste, en los servicios de medicina transfusional ecuatorianos aun no existe una politica establecida.
Las investigaciones han determinado umbrales criticos de titulos de anticuerpos que van desde 1/64 para anti-A/B como prevencion o reduccion del riesgo de reacciones ^{(6) (3)}. En este estudio se tomaron como limites a titulos de 1/64 para isotipo IgM y 1/128 para isotipo IgG basados en investigaciones previas ^{(1) (2)}. Los isotipos IgM anti-A y anti-B son isoaglutininas naturales en las personas de grupo sanguineo “O”. Sin embargo, los de isotipo IgG pueden desarrollarse luego de recibir una transfusion sanguinea incompatible, durante el embarazo o vacunacion y como resultado se producen anticuerpos de tipo inmune o adquiridos ⁽⁷⁾. Los estudios sugieren que en ciertas poblaciones los factores ambientales, las bacterias entericas y los parasitos han modificado los titulos de anti-A y anti-B e incluso en poblaciones asiaticas y de raza negra, la picadura de mosquitos e infecciones parasitarias intestinales han elevado los titulos de hemolisinas ⁽⁸⁾.
En este estudio se relaciono la presencia de hemolisinas con el genero, embarazos y abortos. De esta manera se identifico que en mujeres existia una frecuencia elevada de isotipos IgG anti-A y anti-B, lo que se convierte en un factor de riesgo que debia ser considerado en los bancos de sangre. Datos similares fueron encontrados en el estudio realizado por Khampano et al., que determinaron que los titulos altos de hemolisinas se asociaban con donantes mujeres con embarazos previos, como resultado de la estimulacion inmune por incompatibilidad de grupo sanguineo entre madre e hijo ⁽⁸⁾. En el presente estudio se determino que la frecuencia de hemolisinas de isotipo IgG e IgM anti-A era mas elevada y prevalente que la de anti-B. Daniel-Johnson et al. describieron los primeros casos de reaccion hemolitica transfusional asociada a un concentrado de plaquetas por aferesis de grupo sanguineo A, y demostro que el anticuerpo implicado era el anti-B cuyo titulo elevado se debio a la ingesta de probioticos ⁽⁹⁾. Los probioticos previenen la colonizacion intestinal por patogenos y modulan la respuesta inmune estimulando la produccion de anticuerpos anti-A debido a que contienen antigenos de tipo B ⁽⁹⁾.
En el presente estudio se determino que los donantes de sangre que ingerian probioticos de 3 a 4 veces en la semana presentaban una mayor frecuencia de titulos elevados en el isotipo IgM anti-A y anti-B. Este hallazgo pone de manifiesto que en el cuestionario o interrogatorio se deberia preguntar al donante acerca del consumo de probioticos, y como manejar esta informacion para el diferimiento o reinsercion del donante al sistema de donacion de sangre ⁽⁹⁾. Las reacciones transfusionales hemoliticas en transfusiones de concentrados de plaquetas ABO incompatibles son un riesgo al que se enfrentan los servicios de medicina transfusional. En Estados Unidos, aproximadamente entre 10 y 40% de los servicios de hemoterapia mantienen la practica de transfundir plaquetas incompatibles, pero la frecuencia de reacciones adversas es baja (entre 1:2.000 y 1:46.176). Esto depende de la respuesta inmune del receptor, pues se conoce que los anticuerpos de isotipo IgM transfundidos pasivamente estimulan la respuesta inmune, mientras que los de isotipo IgG pueden bloquearla o reaccionar tardiamente. Otra consideracion es que no existe relacion entre reaccion adversa y el titulo de anticuerpos, ya que existen informes en los que titulos bajos (1/64) tambien ocasionaron hemolisis ^{(5) (10)}.
Los autores creen que es necesario determinar el titulo de hemolisinas en los donantes de plaquetas previo a su produccion, especialmente si van a ser utilizadas en pacientes de grupo sanguineo diferente. Sin embargo, el stock de concentrados de plaquetas isogrupo es limitado debido a que el grupo sanguineo “O” es prevalente en los donantes de sangre ecuatorianos disponibles, por lo que es imprescindible definir un titulo de hemolisinas y asi evitar reacciones hemoliticas. Diversos estudios e informes de casos indican que titulos de hemolisinas entre 1/32 y <1/512 estan implicados en reacciones transfusionales hemoliticas por lo que es necesaria la creacion de politicas y normas para el uso de concentrados de plaquetas que contengan anticuerpos ABO incompatibles ⁽¹⁾. Esto propiciara que las autoridades sanitarias promuevan nuevos examenes y estrategias de deteccion de hemolisinas para ofrecer una seguridad transfusional de plaquetas no isogrupo. En el estudio realizado por Romphruk et al. se utilizo como estrategia la disminucion de titulos anti-A/B en concentrados plaquetarios de un solo donante grupo O, por la adicion de plasma de grupo AB y la eliminacion del plasma del donante mediante centrifugacion y obtencion del sedimento de plaquetas. Mediante esta estrategia, se logro disminuir los titulos que inicialmente fueron de 1:1.024 a valores entre 1:8 y negativos, superando asi el riesgo de reaccion transfusional y logrando un mejor mantenimiento del stock de concentrados plaquetarios ⁽¹¹⁾.
Cualquier estrategia que conlleve a proteger tanto al receptor como al mantenimiento del stock de plaquetas debe ser analizada para su posible aplicacion. El debate en el uso de concentrados de plaquetas isogrupo ha sido extenso debido a la escasez de grupos sanguineos A, B o AB, o bien, a situaciones de emergencia y a la vida corta del hemocomponente ⁽¹²⁾. A pesar de ello es recomendable que se realicen estudios de riesgo-beneficio y seguimiento a pacientes que han sido transfundidos con concentrados de plaquetas de grupo sanguineo diferente.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo recibido del personal de banco de sangre del Hospital de Especialidades Carlos Andrade Marin para la realizacion de este estudio.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Referencias bibliográficas

1. Josephson CD, Castillejo MI, Grima KG, Hillyer CD. ABO-mismatched platelet transfusions: strategies to mitigate patient exposure to naturally occurring hemolytic antibodies. Transfus Apher Sci 2010; 42 (1): 83-8.         [ Links ]

2. Berséus O, Boman K, Nessen SC, Westerberg LA. Risks of hemolysis due to anti-A and anti-B caused by the transfusion of blood or blood components containing ABO-incompatible plasma. Transfusion 2013; 53 Suppl 1: 114S-123S.         [ Links ]

3. Josephson CD, Mullis NC, Van Demark C, Hillyer CD. Significant numbers of apheresis-derived group O platelet units have “high-titer” anti-A/A, B: implications for transfusion policy. Transfusion 2004; 44 (6): 805-8.

4. Cooling L. ABO and platelet transfusion therapy. Immunohematol 2007; 23 (1): 20-33.         [ Links ]

5. Karafin MS, Blagg L, Tobian AA, King KE, Ness PM, Savage WJ. ABO antibody titers are not predictive of hemolytic reactions due to plasma-incompatible platelet transfusions. Transfusion 2012; 52 (10): 2.087-93.         [ Links ]

6. Cooling LL, Downs TA, Butch SH, Davenport RD. Anti-A and anti-B titers in pooled group O platelets are comparable to apheresis platelets. Transfusion 2008; 48 (10): 2.106-13.         [ Links ]

7. Oyedeji OA, Adeyemo TA, Ogbenna AA, Akanmu AS. Prevalence of anti-A and anti-B hemolysis among blood group O donors in Lagos. Niger J Clin Pract May-Jun 2015; 18 (3): 328-32.         [ Links ]

8. Khampanon K, Chanprakop T, Sriwanitchrak P, Setthakarn M, Oota S, Nathalang O. The characteristics of ABO antibodies in group O Thai blood donors. J Clin Lab Anal 2012; 26 (4): 223-6.         [ Links ]

9. Daniel-Johnson J, Leitman S, Klein H, Alter H, Lee-Stroka A, Scheinberg P, et al. Probiotic-associated high-titer anti-B in a group A platelet donor as a cause of severe hemolytic transfusion reactions. Transfusion 2009; 49 (9): 1.845-9.         [ Links ]

10. De Santis GC, Garcia-Silva AC, Dotoli GM, de Castro PT, Simões BP, Covas DT. Higher Anti-A/B isoagglutinin titers of IgG class, but not of IgM, are associated with increased red blood cell transfusion requirements in bone marrow transplantation with major ABO-mismatch. Clin Transplant 2017; 31 (4).         [ Links ]

11. Romphruk AV, Cheunta S, Pakoate L, Kumpeera P, Sripara P, Paupairoj C, et al. Preparation of single donor platelet with low antibody titers for all patients. Transfus Apher Sci 2012; 46 (2): 125-8.         [ Links ]

12. Dunbar NM, Ornstein DL, Dumont LJ. ABO incompatible platelets: risks versus benefit. Curr Opin Hematol 2012; 19 (6): 475-9.         [ Links ]

Recibido: 23 de noviembre de 2019
Aceptado: 17 de marzo de 2020