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Acta bioquímica clínica latinoamericana

versión impresa ISSN 0325-2957versión On-line ISSN 1851-6114

Acta bioquím. clín. latinoam. vol.54 no.3 La Plata set. 2020

 

VIROLOGÍA

Apoptosis de neutrófilos en la infección asintomática por Virus de la Inmunodeficiencia Humana

 

Paula María Cooke1a*, Cinthya Caula1a, Miguel Ángel Orsilles2a

1 Doctora en Bioquímica. Bioquímica. Farmacéutica.
2 Doctor en Ciencias Químicas. Bioquímico.
a Universidad Católica de Córdoba, Unidad Asociada al CONICET, Área de Ciencias Agrarias, Ingeniería, Ciencias Biológicas y de la Salud. Córdoba. Argentina.
* Autora para correspondencia.
Correspondencia Dra. Paula Maria Cooke Facultad de Ciencias Quimicas. Universidad Catolica de Cordoba Avenida Armada Argentina 3555 (X5016DHK) CORDOBA, Argentina Tel: (54) 351 4938000 Correo electronico: paulamcooke@gmail.com


Resumen

En los últimos años se ha determinado que los neutrófilos son células altamente versátiles y sofisticadas, cuyas funciones van mucho más allá de la eliminación de los microorganismos. En la infección con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV), si bien el papel de los neutrófilos no está totalmente caracterizado, actualmente está claro que la relación entre los neutrófilos y el virus es mucho más compleja de lo que se pensaba. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar en pacientes con infección asintomática, y sin tratamiento antirretroviral, el efecto de la infección por el HIV sobre la muerte celular de los neutrófilos y la expresión de receptores de superficie. En pacientes seropositivos sin tratamiento hubo un aumento de la apoptosis temprana de los neutrófilos en relación a los grupos controles. Esta apoptosis aumentada no depende de la activación de la vía extrínseca o intrínseca. En estos pacientes hubo un aumento de la expresión de TLR2 que, unido al aumento de la apoptosis temprana, podría ser indicativo de un fenotipo activado de los neutrófilos. En conclusión, este trabajo aporta información sobre aspectos relacionados con la apoptosis de los neutrófilos en estadios tempranos de la infección por HIV, contribuyendo así a una mayor comprensión acerca del efecto de este virus sobre componentes de la respuesta inmune innata.

Palabras clave: HIV; Neutrófilos; Apoptosis; Infección asintomática.

Abstract

Neutrophil apoptosis in asymptomatic Human Immunodeficiency Virus infection

In recent years it has been determined that neutrophils are highly versatile and sophisticated cells whose functions go far beyond the elimination of microorganisms. In Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection, the role of neutrophils is not fully characterized but it is now clear that the relationship between neutrophils and HIV is much more complex than previously thought. The aims of this study were to evaluate the effect of HIV infection on neutrophil cell death and the expression of surface molecules on neutrophils in patients with asymptomatic infection and without antiretroviral treatment (ART). In HIV seropositive patients without antiretroviral therapy there was an increase in the early apoptosis of neutrophils in relation to the control groups. This increased apoptosis does not depend on the activation of the extrinsic or intrinsic pathway. In these patients there was an increase in the expression of TLR2 which, together with the increase of early apoptosis, could be indicative of an activated phenotype of neutrophils. In conclusion, this study provides information on aspects related to the apoptosis of neutrophils in early stages of HIV infection and therefore contributes to a better understanding of the effect of this virus on components of the innate immune response.

Keywords: HIV; Neutrophils; Apoptosis; Asymptomatic infection.

Resumo

Apoptose de neutrófilos na infecção assintomática pelo Vírus de Imunodeficiência Humana

Nos últimos anos, determinou-se que os neutrófilos são células altamente versáteis e sofisticadas, cujas funções vão muito além da eliminação dos microrganismos. Na infecção pelo HIV, embora o papel dos neutrófilos não esteja totalmente caracterizado, atualmente fica bem claro que a relação entre os neutrófilos e o vírus é muito mais complexa do que se pensava anteriormente. Os objetivos deste trabalho foram avaliar em pacientes com infecção assintomática, e sem tratamento antirretroviral, o efeito da infecção pelo HIV na morte celular dos neutrófilos e a expressão de receptores de superfície. Nos pacientes soropositivos sem tratamento, houve um aumento da apoptose precoce dos neutrófilos em relação aos grupos controle.Esta apoptose aumentada não depende da ativação da via extrínseca ou intrínseca. Nestes pacientes, houve um aumento da expressão de TLR2 que, juntamente com o aumento da apoptose precoce, poderia ser indicativo de um fenótipo ativado dos neutrófilos. Em conclusão, este trabalho fornece informações sobre aspectos relacionados com a apoptose dos neutrófilos em estágios precoces da infecção pelo HIV, contribuindo desse modo para uma maior compreensão sobre o efeito deste vírus nos componentes da resposta imune inata.

Palavras-chave: HIV; Neutrófilos; Apoptose; Infecção assintomática.


 

Introducción

Los neutrofilos constituyen la poblacion celular predominante del sistema inmune innato y tradicionalmente representaron la primera linea de defensa del organismo frente a lesiones e infecciones bacterianas y micoticas (1). Sin embargo, ademas de esta funcion, en los ultimos anos se ha demostrado que los neutrofilos son un componente del circuito regulatorio y efector del sistema inmune innato y adaptativo (2). Estas celulas abundan en las mucosas oral, genital e intestinal inflamadas (3) y tambien en los ganglios linfaticos de los pacientes infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV), lo que sugiere la importancia del estudio de la relacion entre este virus y los neutrofilos (4).
El papel de los neutrofilos en la infeccion por HIV no esta totalmente caracterizado, sin embargo, actualmente esta claro que la relacion entre los neutrofilos y el HIV es mucho mas compleja de lo que se pensaba. El HIV tiene la capacidad de unirse a los neutrofilos debido a que estas celulas poseen un alto nivel de expresion del correceptor de este virus, el receptor de quimiocinas CXCR4 (5), ademas de un amplio repertorio de receptores de superficie capaces de reconocer otras clases de macromoleculas (6). Por otro lado, los estimulos inflamatorios por infecciones concomitantes aumentan la capacidad de union del HIV a los neutrofilos. Esta union afecta a casi todas las funciones de estas celulas (quimiotaxis, fagocitosis, estallido respiratorio y muerte de microorganismos), particularmente en los estadios avanzados de la infeccion, y la funcion anormal de los neutrofilos podria predisponer a una mayor susceptibilidad a desarrollar infecciones bacterianas y/o infecciones oportunistas (7) (8).
El HIV cuenta con diversas estrategias para activar la apoptosis en celulas infectadas y no infectadas, induciendo asi la muerte de celulas efectoras del sistema inmune (4). La contribucion de la apoptosis en la progresion de la infeccion ha sido documentada en varios modelos experimentales tanto in vitro como in vivo. Asi, la muerte celular acelerada activada por el virus o sus componentes es considerada como clave en la declinacion progresiva de las celulas del sistema inmune, lo que conduce a la disfuncion no solo de los elementos de la inmunidad adquirida, sino tambien a una parte importante de componentes de la inmunidad innata (9). Aunque la inmunidad antiviral ha sido clasicamente estudiada en terminos de la respuesta inmune adaptativa, existen muchas pruebas que sugieren que la inmunidad innata juega un papel muy importante desde las etapas tempranas de la infeccion (10).
Por lo mencionado anteriormente, el objetivo general de este trabajo fue evaluar el efecto de la infeccion por HIV sobre neutrofilos, determinando el nivel de apoptosis y la expresion de receptores de superficie, en pacientes con infeccion por HIV que cumplimentaban los siguientes criterios de inclusion: infeccion asintomatica, sin previas manifestaciones clinicas o eventos asociados a SIDA, sin coinfeccion con otros agentes virales, sin tratamiento antirretroviral (TAR) al momento de la evaluacion y sin compromiso inmunologico o con un compromiso moderado.

Materiales y Métodos

Pacientes y controles
Grupo de estudio
Se estudiaron 38 pacientes con infeccion asintomatica por HIV y sin TAR de ambos sexos (23 mujeres y 15 varones; edad: 19 a 54 anos) provenientes de la poblacion de pacientes atendidos en el Hospital Rawson de la ciudad de Cordoba, con serologia previa negativa segun evaluacion clinica y epidemiologica realizada por los medicos. El diagnostico de la infeccion se realizo mediante la tecnica de ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA, del ingles enzyme-linked immunosorbent assay) para detectar anticuerpos y se confirmo con la tecnica de Western blot (11). El periodo medio de la seroconversion fue de 12 meses.
La inclusion de los pacientes se realizo a traves de un muestreo no probabilistico discriminado. En todos los pacientes, un medico infectologo realizo el examen clinico que, junto con el nivel de LT-CD4+, permitio determinar el estadio de la infeccion.

Control negativo
El grupo control negativo fue el grupo de personas sanas o sin infeccion, constituido por 40 individuos de ambos sexos (20 mujeres y 20 varones) dadores de sangre, de entre 18 y 58 anos provenientes del Banco de Sangre del Instituto de Hematologia y Hemoterapia de la Universidad Nacional de Cordoba con serologia negativa para VHB, VHC, HTLV1 y 2, HIV 1 y 2, Chagas, sifilis y brucelosis.

Control positivo
El grupo control positivo estuvo constituido por 40 pacientes con infeccion asintomatica por el HIV (13 mujeres y 27 varones, edad: 28 a 58 anos) y con TAR consistente en la administracion de dos inhibidores de la transcriptasa inversa analogos de nucleosidos asociados a un inhibidor de la integrasa o un inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleosido o un inhibidor de la proteasa potenciado. El periodo medio del TAR fue de 56 meses (1 a 156 meses) y todos los pacientes tenian una carga viral indetectable.
Los pacientes firmaron el consentimiento escrito de participacion en el trabajo, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comite Institucional de Etica de la Investigacion en Salud (CIEIS Polo Hospitalario de la Provincia de Cordoba).

Muestras biológicas
Suero, plasma, sangre entera anticoagulada con EDTA-K3 (DVS), neutrofilos aislados de sangre periferica mediante un gradiente de densidad sobre Ficoll- Hypaque (Sigma-Aldrich, San Luis, Estados Unidos) (12) y posterior sedimentacion en Dextran (Sigma-Aldrich, San Luis, Estados Unidos) al 6%.

Métodos

Hemograma
El hemograma fue realizado en sangre entera anticoagulada con EDTA-K3 con un contador hematologico (Cell Dyn 3200 Abbott, Abbott Park IL, Estados Unidos) de 18 parametros. El conteo leucocitario diferencial fue realizado en extendidos de sangre sobre 200 elementos sanguineos.

Cuantificación de linfocitos T (LT)-CD4+ y LT-CD8+
La cuantificacion de linfocitos T (LT)-CD4+ y LTCD8+ se realizo en sangre entera anticoagulada con EDTA-K3 con marcacion con 4 fluorocromos BD multitest en tubos Trucount CD3/CD8/CD45/CD4 (BD Bioscience FITC, PE, PerCP, APC, respectivamente,) en plataforma unica en un citometro de flujo Facscalibur (Becton Dickinson Argentina SRL) con software MultiSET V2.2.

Carga viral
La cuantificacion del acido ribonucleico (ARN) del HIV-1 fue realizada en plasma por la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT- PCR) cuantitativa en tiempo real (COBAS TaqMan HIV-1 test, version 2.0, Roche Diagnostics, Branchburg, NJ, Estados Unidos) con un limite de deteccion de 34 copias/mL.

Estudios citomorfológicos del proceso de muerte celular por apoptosis
Se realizo coloracion con May-Grunwald Giemsa de neutrofilos aislados y de sangre entera. Las improntas se observaron en microscopio de luz visible con un aumento de 100x (Primo Star, Karl ZeissR, Alemania) y las celulas apoptoticas fueron definidas por la presencia de nucleo condensado y perdida simultanea del aspecto polisegmentado del mismo.

Translocación de la fosfatidilserina por citometría de flujo
Se utilizo un equipo comercial (BD Pharmingen™, San Jose, CA, Estados Unidos) en el cual la anexina V esta conjugada con ficoeritrina (PE). La deteccion de apoptosis se realizo en neutrofilos aislados y en sangre entera siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las celulas positivas con anexina V y negativas con 7-AAD se consideraron apoptoticas tempranas. Se realizaron controles de celulas sin marcar, celulas con monomarca de cada monoclonal, celulas incubadas con anticuerpos monoclonales irrelevantes del mismo isotipo conjugados con los fluorocromos correspondientes y celulas control positivo de apoptosis. Se adquirieron 100.000 eventos en cada muestra en un citometro de flujo FACScan Canto II (Becton Dickinson Argentina SRL). La poblacion de neutrofilos fue identificada por sus propiedades fisicas: tamano celular (FSC, del ingles Forward Scatter) y granularidad o complejidad citoplasmatica (SSC, del ingles Side Scatter) confirmada marcando la region alrededor de la poblacion CD11b+-APC (BD Bioscience). De la poblacion de neutrofilos asi seleccionada (20.000 a 50.000 eventos) se evaluo el nivel de apoptosis mediante la deteccion de anexina V-PE (con un filtro de excitacion para 585 nm y otro de emision de 578 nm) y de 7-AAD (con un filtro de excitacion para 670 nm y otro de emision de 675 nm). Para cuantificar la apoptosis de los neutrofilos, se determino el porcentaje de celulas marcadas positivas para anexina V-PE y la intensidad media de fluorescencia (IMF). El analisis de los datos se realizo utilizando el software FlowJo 5.7.2 (Tree Star, Inc).

Actividad de caspasa-8 y caspasa-9 por Western blot
Brevemente, se obtuvieron los extractos proteicos a partir de 1x10 6 neutrofilos con buffer Laemmli 1X. La concentracion de proteinas de las muestras se cuantifico utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos). La absorbancia se midio a 595 nm en el lector de placas MultiPlate Reader (Bio-Rad). Posteriormente, las proteinas fueron separadas mediante electroforesis SDS-PAGE (13). Una vez concluida la separacion, las proteinas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 10 cm x 10 cm (Tecnolab S.A), de 0,45 μm de tamano de poro en un equipo de transferencia (Bio-Rad). A continuacion, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario anticaspasa-8 o anticaspasa-9 (Cell SignalingTechnologyR) en una dilucion 1:1.000 en solucion de bloqueo, a temperatura ambiente durante 60 minutos en agitador de balanceo. Luego de realizar tres lavados con TBST, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante diluido 1/2.000 en solucion de bloqueo, durante 60 minutos a temperatura ambiente en agitador. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces con TBST y la deteccion se realizo mediante el sistema de quimioluminiscencia ECL con el kit ECLTM Western Blotting Detection Reagents (Amersham Pharmacia, Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) y la impresion se realizo en una pelicula de autorradiografia (Agfa Curix RP2 Plus, Agfa HealthCare Argentina), que se revelo en el equipo Agfa Curix 60.

Ensayo de caspasa-3 activa
Este ensayo fue realizado en muestras de 1x10 6 celulas con un equipo comercial (PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit, BD Pharmingen™) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras fueron analizadas en un citometro de flujo FACScan Canto II Becton Dickinson, con la adquisicion de 50.000 eventos. El analisis de los datos se realizo utilizando el software FlowJo 5.7.2 (Tree Star, Inc).

Expresión de los receptores de superficie TLR2 y CD95
La expresion de estos receptores de superficie en neutrofilos fue determinada por citometria de flujo a partir de muestras de sangre entera. Para la marcacion de CD95 se utilizo el anticuerpo anti-CD95-FITC (BD Pharmingen™) y para TLR2, el anti-CD282 (Alexafluo ®488, BD Pharmingen™). Las muestras fueron analizadas en un citometro de flujo FACScan Canto II Becton Dickinson y se adquirieron 50.000 eventos. El analisis de los datos se realizo utilizando el software FlowJo 5.7.2 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, Estados Unidos).

Análisis estadístico
El analisis univariado descriptivo de las variables continuas incluyo la media, la mediana, la desviacion estandar, el coeficiente de variacion, el error estandar, el rango intercuartilico (RIC) y los valores minimos y maximos. Los coeficientes de correlacion lineal se estimaron por el coeficiente de correlacion de Pearson o Spearman. La asuncion de distribucion normal para las variables continuas se comprobo mediante pruebas graficas y la prueba de Kolmogorov-Smirnov con la correccion de la significacion de Lilliefors. Cuando se asumio normalidad se utilizo la prueba t de Student para comparar las medias de las variables cuantitativas. En caso de no aceptarse la hipotesis de normalidad de la variable cuantitativa se utilizo la prueba no parametrica U de Mann-Whitney. Todos los analisis estadisticos se realizaron con el programa MedCalc version 16.8. La significacion estadistica se ajusto a p<0,05.
El analisis multivariado se realizo mediante un analisis de regresion logistica buscando el mejor modelo para obtener una medida ajustada del efecto del estado inmunologico y virologico sobre el riesgo de niveles elevados de mediadores solubles de la inflamacion. Los datos fueron analizados por el programa R Development Cores Team (2008).

Resultados

En el grupo de estudio se incluyeron 38 pacientes con infeccion asintomatica por HIV sin TAR al momento de la evaluacion. Previamente, ninguno presento manifestaciones clinicas o eventos asociados a SIDA, ni coinfeccion con otros agentes virales. Los pacientes fueron categorizados segun el sistema de clasificacion de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) de Atlanta, Estados Unidos, del ano 2014 (14). Las caracteristicas clinicas e inmunologicas de los distintos grupos incluidos se muestran en la Tabla I.

Tabla I. Características de controles sanos y pacientes con infección por HIV asintomáticos sin y con TAR.

Evaluación del nivel de apoptosis de neutrófilos
La anexina V es una proteina de 35-36 kDa que se une con alta afinidad a la fosfatidilserina en presencia de Ca2+, lo que posibilita identificar celulas apoptoticas mediante la incubacion de las celulas con anexina V unida a ficoeritrina (PE). De esta manera se puede detectar apoptosis en estadios mas tempranos que en otros ensayos basados en los cambios que experimenta el nucleo de la celula, como la fragmentacion del ADN y se evidencia antes que se produzca la perdida de la integridad de la membrana en las etapas finales de muerte de la celula, ya sea por apoptosis o necrosis (15). La perdida de la integridad estructural de la membrana plasmatica, caracteristica distintiva de la necrosis, representa la etapa final en la que una celula no puede mantener su identidad independiente de la del entorno. Bioquimicamente, puede manifestarse por entrada a la celula de colorantes vitales como 7-amino- actinomicina (7-AAD). Por lo tanto, mediante esta doble marcacion se pueden diferenciar por citometria de flujo: celulas viables (anexina V-/7-AAD-), celulas en apoptosis temprana (anexina V+/7-AAD-), celulas en apoptosis tardia (anexina V+/7-AAD+) y celulas necroticas (anexina V-/7-AAD+).
En pacientes HIV seropositivos asintomaticos y sin TAR, el nivel de apoptosis total de neutrofilos de sangre circulante fue significativamente mayor al detectado en neutrofilos de los grupos controles (8,73}2,15% vs. pacientes con TAR: 5,10}2,13% y controles sanos: 0,97}1,02%, p<0,05, respectivamente). No hubo diferencias significativas entre los niveles de apoptosis obtenidos en muestras de sangre entera y en neutrofilos aislados. La intensidad media de fluorescencia (IMF) de anexina V-PE unida a los neutrofilos, mostro un aumento significativo en pacientes HIV seropositivos sin TAR, respecto a pacientes con infeccion por HIV con TAR y controles no infectados (Fig. 1). Se determino que el mayor nivel de apoptosis ocurria durante la etapa temprana de este proceso (Tabla II). Las caracteristicas citomorfologicas de la apoptosis de los neutrofilos fueron observadas mediante microscopia optica observandose el clasico encogimiento celular, la membrana celular intacta, condensacion de la cromatina y presencia de cuerpos apoptoticos.


Figura 1
. Apoptosis de neutrófilos de pacientes HIV seropositivos.
Translocación de la fosfatidilserina mediante marcación con anexina V-PE y 7-AAD en (A) un control sin infección y (B) en un paciente HIV seropositivo asintomático sin TAR. (C) Porcentaje de apoptosis de neutrófilos de pacientes HIV seropositivos y controles no infectados: las cajas representan la mediana y los rangos intercuartilos y las barras de error, los valores mínimo y máximo * p<0,0001 respecto a controles sanos; ** p<0,05 respecto a pacientes HIV con TAR. Valores de p obtenidos con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (test de comparación múltiple de Dunn).

Tabla II. Nivel de apoptosis de neutrófilos de pacientes HIV seropositivos sin TAR y controles en las distintas etapas del proceso de muerte.

Actividad de caspasas
Con el fin de valorar la expresion de las caspasas iniciadoras de la via extrinseca e intrinseca, se analizo la expresion de caspasa-8 y caspasa-9, respectivamente. Tanto en neutrofilos de pacientes HIV seropositivos sin TAR como de pacientes con TAR, en los immunoblots solamente se observo la expresion de la proforma de caspasas-8 y -9 (o forma entera) sin expresion de las proformas clivadas (Fig. 2). Estos hallazgos sugieren una posible falta de activacion de las vias intrinseca o extrinseca en el proceso de muerte celular de los neutrofilos de pacientes sin TAR, lo que deberia ser confirmado en estudios posteriores utilizando otras metodologias. En base a los resultados anteriores, se procedio a determinar, por citometria de flujo, si habia activacion de la caspasa-3, ya que es una proteasa clave en la muerte celular por apoptosis que es activada durante los estadios tempranos del proceso. En los neutrofilos de pacientes con infeccion asintomatica por HIV sin TAR se evidencio un aumento de la actividad de caspasa-3 respecto a controles sanos y a pacientes con infeccion por HIV tratados (Fig. 3). El porcentaje de neutrofilos con caspasa-3 activa fue significativamente mayor en pacientes sin TAR respecto a pacientes con TAR e individuos sanos (6,00}3,16% vs. 2,0}1,33% y 0,57}0,85%, respectivamente, p<0,05).


Figura 2
. Análisis de caspasa-9 por Western blot.
Setenta microgramos de proteínas totales, obtenidos del lisado de neutrófilos, fueron separados en un gel de poliacrilamida- SDS y marcados con un anticuerpo monoclonal anticaspasa-9. 1) Neutrófilos de control sano, 2) Neutrófilos de un paciente con infección por HIV sin TAR, 3) Neutrófilos sometidos a cambios de temperatura.


Figura 3
. Actividad de caspasa-3.
Los parámetros se representan en escala lineal para el número de células y escala logarítmica para caspasa-3 Activa-PE. Se señala la población de neutrófilos con marcación positiva para caspasa-3-Activa en los tres grupos: controles sanos (A), pacientes HIV sin TAR (B) y pacientes HIV con TAR (C).

Relación entre apoptosis, carga viral y compromiso inmunológico
Mediante un analisis de correlacion se estudio el grado de asociacion entre apoptosis, carga viral y compromiso inmunologico. No hubo correlacion entre apoptosis temprana y niveles de LT-CD4+ (r=-0,28; p=0,47) ni con la carga viral (r=0,10; p=0,79). Sin embargo, el hecho que en los pacientes HIV seropositivos con TAR los niveles de neutrofilos muertos por apoptosis temprana desciendan significativamente, sugiere que el aumento de apoptosis en los pacientes HIV sin TAR podria estar relacionado con los niveles mas altos de carga viral que estos presentan. Por otro lado, el aumento de la apoptosis de los neutrofilos de pacientes con infeccion por HIV asintomatica sin TAR podria justificar el valor absoluto de neutrofilos disminuido (2,67}0,50 x 109/L) en estos pacientes, respecto a controles sanos (4,35}0,69 x 109/L) y pacientes HIV seropositivos con TAR (3,43}1,28 x 109/L).

Expresión de los receptores de superficie TLR2 y CD95
Con el fin de evaluar la participacion de los receptores TLR2 (16), (17) y CD95 (18) (19) (20) como posibles inhibidores o inductores, respectivamente, de la apoptosis de neutrofilos, se analizo el nivel de su expresion en pacientes HIV seropositivos respecto a controles sanos. En pacientes con infeccion por HIV sin TAR se detecto un aumento significativo del porcentaje medio de neutrofilos que expresan TLR2 respecto a controles sanos (media } DE=96,80}1,81% vs. 92,90}1,81%; p<0,05). Los porcentajes medios de expresion de TLR2 fueron similares en pacientes sin y con TAR (96,8}1,81% y 95,90}2,75%, respectivamente). Por otro lado, cuando se evaluo el numero de moleculas de TLR2 en los neutrofilos, se detecto en pacientes HIV sin TAR, una mayor intensidad media de fluorescencia TLR2-Alexa FlourR 488 (IMF}DE=10,89}1,17) que en los controles sanos (IMF}DE=10,89}2,75) y menor que en los pacientes HIV con TAR (IMF}DE=14,81}8,03), aunque las diferencias no fueron estadisticamente significativas (Fig. 4).


Figura 4
. Niveles de expresión de TLR2 en neutrófilos de sangre periférica de pacientes HIV seropositivos sin TAR.
A) Porcentaje de neutrófilos que expresan TLR2. B) Intensidad media de fluorescencia de TLR2- Alexa Flour® 488 en neutrófilos. Las barras representan: controles sanos (blanco), pacientes HIV sin TAR (negro) y pacientes HIV con TAR (gris). Valores expresados como media ± DE. * p<0,05 obtenida con el test no paramétrico de Kruskal-Wallis (prueba de comparación múltiple de Dunn).

Con respecto a la expresion de CD95, en pacientes HIV sin TAR, el porcentaje de neutrofilos que expresaron este antigeno (media}DE=98,60%}1,10) y la cantidad de moleculas (IMF}DE=10,60}2,20) fueron similares a los de los controles sin infeccion (media} DE=98,80%}0,4; IMF}DE=10,80}1,90) y superiores a los niveles expresados en pacientes HIV con TAR (media}DE=95,90%}4,50; IMF}DE=8,70}2,30), pero en ningun caso las diferencias fueron estadisticamente significativas (Fig. 5). No hubo correlaciones entre la expresion de estos receptores y el estado inmunologico y virologico de los pacientes sin TAR.


Figura 5
. Niveles de expresión de CD95 en neutrófilos de sangre periférica de pacientes con infección por HIV sin TAR.
A) Porcentaje de neutrófilos que expresan CD95. B) Intensidad media de fluorescencia de CD95-FITC en neutrófilos. Las barras representan: controles sanos (blanco), pacientes HIV sin TAR (negro) y pacientes HIV con TAR (gris). Valores expresados como media ± DE.

Discusión y Conclusiones

Los estudios previos de apoptosis de neutrofilos en individuos infectados con HIV han informado un aumento de este tipo de muerte celular aunque incluyeron un escaso numero de individuos, principalmente en estadios avanzados de la infeccion, con un sistema inmunologico muy comprometido y con cargas virales muy disimiles (21) (22). Por estos motivos, se decidio abordar el estudio de la apoptosis de neutrofilos en la infeccion por HIV teniendo en consideracion los siguientes criterios: infeccion asintomatica, sin previas manifestaciones clinicas o eventos asociados a SIDA, sin coinfeccion con otros agentes virales, sin TAR al momento de la evaluacion y sin compromiso inmunologico o con un compromiso moderado.
El Comite de Nomenclatura sobre la Muerte Celular (23) ha propuesto que la clasificacion y caracterizacion de los distintos tipos de muerte celular deberian basarse unicamente en criterios morfologicos, porque no siempre existe una correspondencia clara entre los cambios ultraestructurales y las caracteristicas bioquimicas de la muerte celular (24). Considerando estos conceptos, se incluyeron tecnicas complementarias, basadas tanto en las caracteristicas morfologicas como en las bioquimicas, ya que ninguna puede hacerlo por si sola (15). Si bien puede considerarse que la tecnica de May-Grunwald Giemsa consume mucho tiempo y depende del operador, es una tecnica de microscopia optica clasica para la identificacion de los parametros tempranos relacionados a la muerte celular, como es la condensacion de la cromatina. Sin embargo, algunos autores creen que podria llegar a subestimar el porcentaje de apoptosis debido a que en las etapas tempranas del proceso no se suelen identificar cambios morfologicos severos (25).
En otros estudios, como el de Pitrak et al. (21), realizado en individuos infectados con HIV, se determino un aumento de la apoptosis de neutrofilos de pacientes con SIDA (<200 LT-CD4+/μL), siendo este un defecto intrinseco y no un efecto de factores sericos endogenos (21). Resultados similares fueron informados por Mastroianni et al. (22) en pacientes con SIDA antes de iniciar el TAR con inhibidores de la proteasa y por Salmen et al., en pacientes con infeccion asintomatica pero con recuentos de LT-CD4+/μL ≥200 (26). Por otro lado, Elbim et al. (27) quienes trabajaron con el modelo de primates con macacos Rhesus infectados con Virus de la Inmunodeficiencia Simiana (VIS) demostraron una exacerbacion de la apoptosis temprana de neutrofilos en la fase aguda de la infeccion, coincidente con el pico de replicacion viral. Estos autores postularon que la muerte temprana incrementada puede tener relacion con la disminucion de neutrofilos circulantes que ocurre en la etapa inicial de la infeccion por el VIS, lo que tendria importantes implicancias en la replicacion viral y en la progresion de la enfermedad.
El aumento de la apoptosis de los neutrofilos de los pacientes con infeccion asintomatica por HIV sin TAR, podria justificar el valor absoluto disminuido de neutrofilos hallados en este trabajo, respecto a controles sanos y pacientes HIV seropositivos con TAR. La relacion entre aumento de apoptosis y neutropenia ha sido documentada por varios autores (25) (28) (29), quienes han reportado que el aumento de la apoptosis de neutrofilos podria explicar, en parte, la neutropenia observada cuando los pacientes son diagnosticados con SIDA (28). En este trabajo se demostro una disminucion del numero absoluto de neutrofilos desde los estadios iniciales de la infeccion, o sea desde la etapa asintomatica, y que podrian condicionar la instauracion de infecciones oportunistas y ser responsables de alguna de las manifestaciones clinicas iniciales.
La apoptosis de los neutrofilos comparte numerosas similitudes con la de otros tipos celulares, pero tambien exhibe caracteristicas distintas en la ejecucion del programa de muerte (30). El mecanismo molecular de la apoptosis es muy complejo y puede implicar la activacion de distintas caspasas (cistein-proteasas) que intervienen en la iniciacion, propagacion y ejecuciónde la apoptosis (31). En relacion a la participacion de las caspasas en la muerte por apoptosis de neutrofilos, se evidencio un aumento significativo de la actividad de caspasa-3 en los pacientes HIV asintomaticos sin TAR, respecto de controles sanos y pacientes HIV con TAR. Sin embargo, no se encontro activacion de caspasa-8 (caspasa iniciadora de la via extrinseca de la apoptosis) ni de la caspasa-9 (iniciadora de la via intrinseca). Estos resultados indican que la apoptosis de los neutrofilos de pacientes con infeccion asintomatica por HIV y con un corto tiempo de seroconversion (12 meses), podria no ser dependiente de la activacion de la via extrinseca o intrinseca, lo que deberia ser confirmado con metodologias adicionales. La apoptosis de neutrofilos aumentada que se demostro en este trabajo, sin activacion de caspasas-8 y -9, sugiere otros mecanismos de induccion de esta muerte celular que podrian activarse durante el curso de la infeccion. Estos resultados coinciden en parte con lo demostrado por Salmen et al. (32) quienes informaron que en la infeccion cronica por HIV, con un tiempo medio de seroconversion de 67,9 meses, la apoptosis espontanea de neutrofilos es dependiente de caspasa-3, pero independiente de caspasa-8, lo que sugiere que la via intrinseca estaria involucrada en esta muerte celular. Por su parte, Anita et al. (24) afirmaron que la apoptosis puede ser independiente de caspasas. Si bien se ha demostrado que la activacion de caspasas es esencial en la apoptosis inducida por ligandos, aun no esta claro si lo es en la apoptosis espontanea de neutrofilos. Existen discrepancias en los resultados obtenidos en la evaluacion de caspasas y en los niveles de apoptosis, debido quizas a las diferentes muestras de donde se obtuvieron los neutrofilos, a los metodos utilizados para purificarlos, a las tecnicas empleadas para medir apoptosis, al tiempo transcurrido en el procesamiento de las muestras y/o a la fuente de obtencion y a la concentracion de inhibidores de caspasas utilizados en los ensayos para inhibir la apoptosis (33).
Entre otros mecanismos propuestos acerca de la apoptosis de neutrofilos en pacientes HIV sin TAR, Lichtner et al. (34) demostraron que la apoptosis de neutrofilos de pacientes con SIDA esta mediada por calpainas. Por lo expuesto, aun no han sido totalmente dilucidados los mecanismos involucrados en la apoptosis de neutrofilos en pacientes con infeccion por HIV. Por lo tanto, los hallazgos realizados en este trabajo permiten delinear futuros estudios para evaluar vias de activacion de la apoptosis en neutrofilos en etapas tempranas de la infeccion por HIV.
Si bien no hubo correlacion entre apoptosis, niveles de LT-CD4+ y carga viral, el hecho que en los pacientes HIV seropositivos con TAR los niveles de neutrofilos muertos por apoptosis temprana desciendan significativamente, sugiere que el aumento de apoptosis en los pacientes sin TAR podria estar relacionado con la replicacion viral. Pitrak et al. (21) y Salmen et al. (26) (29) demostraron que en la infeccion por HIV, la mayor muerte espontanea de los neutrofilos no se correlaciona con los niveles de carga viral ni con el numero de LT-CD4+. Por otro lado, Elbim et al. (35) observaron que en primates el aumento temprano de muerte de los neutrofilos, en la fase aguda de la infeccion por VIS, coincidia con el pico de la replicacion viral y que el nivel de neutrofilos muertos era mayor en los primates que progresaron mas rapido a la etapa SIDA, coincidiendo con la neutropenia.
En la infeccion por HIV el rol de los Receptores de Reconocimiento de Patrones (RRP), incluyendo los TLR, aun no ha sido aclarado; poco se sabe acerca de la expresion y funcionamiento de los TLR en la respuesta mediada por neutrofilos expuestos al HIV (36). El trabajo publicado por Giraldo et al. (37), quizas sea el primero en demostrar in vitro la expresion y funcionamiento de los TLR de neutrofilos expuestos al HIV, lo que sugiere una posible interaccion neutrofilo/HIV a traves de TLR. Asimismo, estos autores informaron una disminucion de la expresion genica de TLR2 en neutrofilos de individuos sanos estimulados con HIV in vitro. Seguidamente, Hernandez et al. (38) publicaron los resultados de sus investigaciones sobre el nivel de expresion genica de RRP y la produccion de citoquinas luego de la activacion de neutrofilos de pacientes HIV seropositivos, individuos seronegativos expuestos al HIV y controles sanos. TLR2 (39) y TLR4 son los principales TLR que participan, aunque de distintas maneras, en la regulacion de la supervivencia de los neutrofilos (40). Hernandez et al. (38) hallaron una disminucion significativa de la IMF de expresion de TLR2 en la superficie de neutrofilos de nueve pacientes infectados con HIV (4 pacientes sin TAR y 5 pacientes con TAR), respecto de controles sanos, pero no informaron la expresion en porcentaje de neutrofilos. Algunos autores sugieren que el HIV puede desarrollar estrategias para evadir la respuesta inmune innata dependiente de TLR o regular la expresion de TLR para aumentar la diseminacion viral, como se ha observado con otros virus (41). Respecto a la relacion entre TLR y sobrevida o muerte de los neutrofilos, Sabroe et al. (40) reportaron que TLR2 y TLR4 serian los principales reguladores.
A nuestro conocimiento, el presente trabajo seria el primer estudio en medir la expresion de TLR2 en la superficie de los neutrofilos en sangre de 38 pacientes con infeccion por HIV asintomatica sin TAR y 40 con TAR, analizados por separado. En los neutrofilos de pacientes con infeccion por HIV sin TAR, sin ningun otro estimulo, se observo aumento de expresion de TLR2, alteracion de la expresion de moleculas de superficie y aumento de la apoptosis temprana. Esto estaria indicando que en estos pacientes, el HIV podria estar regulando la expresion de TLR2, como asi tambien su funcion, induciendo el fenotipo activado de los neutrofilos y ejerciendo un efecto muy bajo o nulo para evitar la apoptosis temprana.
Dado que la apoptosis de neutrofilos puede ser inducida mediante la activacion de CD95 por entrecruzamiento con anticuerpos anti-Fas o mediante la interaccion con FasL, este fue uno de los mecanismos originariamente propuesto para explicar la apoptosis constitutiva de los neutrofilos (26). Los neutrofilos de individuos sanos expresan constitutivamente el receptor CD95/Fas/ApoI que al activarse es capaz de mediar la apoptosis de varias celulas. Nuestros resultados respecto a los niveles expresion de CD95 (en porcentaje de neutrofilos e IMF) en pacientes HIV sin TAR, concuerdan con lo informado por Salmen et al. (26), quienes encontraron niveles basales altos de expresion constitutiva de CD95 en neutrofilos de pacientes con infeccion por HIV asintomatica y en controles sanos. No encontraron diferencias de expresion de CD95, en porcentaje y en densidad, entre pacientes HIV asintomaticos y controles sanos.
La importancia biologica del sistema Fas/FasL (42) ha sido ampliamente documentada en la apoptosis de linfocitos T, ya que intervienen en la eliminacion de celulas autorreactivas y activando el suicidio inducido. Sin embargo, en la infeccion por HIV, los mecanismos intracelulares que conducen a la muerte de neutrofilos por apoptosis espontanea o inducida por Fas/FasL, no han sido totalmente definidos. Si bien parecen ser diferentes, no puede descartarse la posibilidad de que ambas ocurran simultaneamente, contribuyendo a la neutropenia y al desarrollo de infecciones secundarias con la evolucion de la enfermedad (19).
En conclusion, estos resultados que son parte de un trabajo de tesis doctoral (43), indican que desde los estadios iniciales de la infeccion por HIV hay un aumento de la apoptosis temprana de neutrofilos, con activacion de caspasa-3, que se relaciona con la disminucion del numero absoluto de neutrofilos. Este hecho podria condicionar la instauracion de infecciones oportunistas y ser responsable de algunas manifestaciones clinicas iniciales. Asimismo, el aumento de la expresion de TLR2, unido a la alteracion de la expresion de moleculas de superficie y al aumento de la apoptosis temprana, podria ser indicativo de un fenotipo activado de los neutrofilos. Una mayor comprension acerca de como la infeccion por HIV impacta en la inmunidad innata, en particular en los neutrofilos, resulta de gran importancia debido a que podria contribuir al desarrollo de nuevas medidas profilacticas y estrategias que complementen y sinergicen el abordaje terapeutico de esta infeccion centrado en la restitucion de la respuesta adaptativa (9).

Agradecimientos

Los autores agradecen a las Dras. Paula Abadie y Pilar Crespo del CIBICI, Facultad de Ciencias Quimicas de la Universidad Nacional de Cordoba, quienes asistieron en la realizacion de los estudios por citometria de flujo.

Fuente de financiación

Secretaria de Investigacion y Vinculacion Tecnologica, Universidad Catolica de Cordoba.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

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Recibido: 10 de octubre de 2019
Aceptado: 10 de marzo de 2020

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