Influencia de la concentración salina y la temperatura en la composición de ácidos grasos de membrana de Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3

G. N. Pucci, C. Härtig, O. H. Pucci^*

CEIMA, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Gerónimo Maliqueo 164, 9000 Comodoro Rivadavia, Chubut, Argentina
^*Correspondencia. Tel: 0297-4471732. E-mail: ohpucci@yahoo.com

RESUMEN
Las bacterias responden a los cambios ambientales modificando su composición, para evitar el daño que dichos cambios podrían ejercer. Una de las modificaciones más importantes es la variación de la composición de los ácidos grasos de las membranas celulares, que le permite mantener la homeoviscosidad ante situaciones de estrés. Trabajos previos han estudiado la acción de la temperatura, presión hidrostática y diferentes solventes sobre cepas de Pseudomonas putida. En este trabajo se estudió la acción conjunta de la temperatura y la salinidad sobre la composición de ácidos grasos de membranas celulares de Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3, una cepa bacteriana aislada de un hábitat contaminado con petróleo. Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3 respondió a las variaciones de temperatura modificando los ácidos grasos de sus membranas de manera similar a lo descripto en otros integrantes de su género: ante el aumento de temperatura se observó un incremento de ácidos grasos saturados y una disminución de los ácidos grasos insaturados. En el rango de concentraciones salinas ensayadas las variaciones de los ácidos grasos mayoritarios fueron en general erráticas. La respuesta de los ácidos grasos ciclo propano pudo expresarse con ecuaciones matemáticas que permitieron predecir el porcentaje de estos ácidos en relación a la concentración de cloruro de sodio.
Palabras clave: Pseudomonas fluorescens, ácidos grasos, temperatura, salinidad.

SUMMARY
Influence of salinity and temperature on fatty acid composition of Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3 membrane. The bacteria respond to environmental changes modifying their composition. One of the most important modifications is the variation on fatty acid composition of cellular membranes to maintain the homeoviscosity. The action of temperature, hydrostatic pressure and solvents on Pseudomonas putida has been thoroughly studied. In this paper, the combined action of the temperature and salinity on fatty acid composition of cellular membranes of Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3, a bacterial strain isolated from a petroleum contaminated habitat, was studied. The modifications in the fatty acid composition of Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3 membrane were similar to those described for other members of Pseudomonas: an increase in saturated fatty acids and a decrease in unsaturated fatty acids were observed with the increase of the temperature. Variations of main fatty acids were in general erratic in the range of assayed saline concentrations. The variation of cycle propane fatty acids could be expressed with mathematic equations that allowed to predict their percentage in relation to sodium chloride concentration.
Key words: Pseudomonas fluorescens, fatty acids, temperature, salinity.

INTRODUCCIÓN

Los métodos biológicos son sumamente efectivos para eliminar contaminantes orgánicos del medio ambiente. (26, 27, 28). En suelos hay parámetros como humedad, concentración y calidad de sales presentes y los metales pesados que influencian estos procesos (28, 31), y uno de los factores más importantes que determinan la actividad de los microorganismos es la actividad de agua (12). Generalmente en suelos saturados, el potencial de agua está comprendido casi exclusivamente por el potencial de solutos, pero en suelos secos el potencial resultante del agua de la matriz del suelo se transforma en el factor predominante que contribuye al potencial de agua total del suelo (14, 19).
Los estudios bacterianos sobre la adaptación a las modificaciones osmóticas causadas por solutos permeables que bajan el potencial de agua en el medio de cultivo se efectúan generalmente en base a mecanismos genéticos y fisiológicos (6). La deshidratación de membranas a temperatura constante causa una transición de fase gel a fase cristalina-líquida, la deshidratación produce un aumento en la temperatura de transición (4, 24). Una deshidratación extensa puede causar una transición de las membranas de bicapa laminar a una fase II hexagonal invertida en que hay fosfolípidos que forman una micela que se intercala entre la bicapa (2, 5, 19). Las bacterias que se exponen a bajos potenciales de agua deben ajustar la composición de ácidos grasos de su membrana o efectuar otras adaptaciones para minimizar los efectos de solidificación de los lípidos por efectos de la deshidratación, que sería análogo a la adaptación homoviscosa de la fluidez de la membrana en cambios de temperatura (18, 34, 35, 36) o presión hiperbárica (7, 16). Se han demostrado cambios de los perfiles de ácidos grasos de fosfolípidos durante condiciones de inanición y desecación en medios porosos, pero es dificultoso separar los efectos de ambos, subse-cuentemente estos dos fenómenos de estrés (inani- ción y desecación) pueden ocurrir simultáneamente durante los procesos que se presentan en medios porosos (17).
Nichols y col (23) han discutido el rol potencial de la temperatura y de la salinidad en bacterias seleccionadas de ambientes marinos helados, y han sugerido que el conocimiento de la respuesta fisiológica de bacterias psicrófilas estresadas simultáneamente por temperatura y salinidad, es muy importante para el conocimiento de la adaptación de las comunidades bacterianas de agua marina helada. Las fluctuaciones en la salinidad que afectan la composición de las poblaciones microbianas de estuarios y otros ecosistemas han sido estudiadas por varios autores (9, 30). Tales fluctuaciones producen adaptaciones que son muy importantes para la supervivencia y viabilidad de bacterias psicrófilas marinas (15, 20, 21, 36). Estos cambios de salinidad también ocurren en aguas de la Antártida y están asociados a ciclos de formación y fusión del hielo. Se ha comunicado el intento de relacionar los cambios en los parámetros fisicoquímicos a un mecanismo fisiológico para el crecimiento sólo en estudios de bacterias psicrófilas (10, 12, 21, 22, 37).
Los suelos de la Patagonia central son frágiles ecosistemas con reiteradas contaminaciones por hidrocarburos provenientes de la explotación petrolera y están sufriendo un importante proceso de salinización en zonas bajas donde también se acumula el petróleo derramado en accidentes de oleoductos e instalaciones. Si bien se han estudiado ecosistemas patagónicos contaminados con petróleo y con éste y metales pesados, se han realizado procesos de biorremediación tanto en laboratorio (25, 27) como a campo (26, 28, 31), no existen estudios de adaptación a la temperatura (muy variable en la meseta patagónica) y a las salinidades crecientes que se presentan en muchos puntos de la Patagonia. En varios de los procesos de biorremediación antes mencionados se han aislado integrantes del género Pseudomonas, una de ellas ha sido Pseudomonas fluorescens. La cepa GNP-OHP-3 se eligió por su velocidad y cinética de desarrollo utilizando hidrocarburos como fuente de carbono y energía, y el tipo de hidrocarburos que utiliza.
No hay comunicaciones sobre estudios de adaptación de bacterias que utilizan hidrocarburos como fuente de carbono y energía a diferentes salinidades y temperaturas en ecosistemas de suelos.
El objetivo de este trabajo fue determinar la variación que se produce en la composición de los ácidos grasos de membrana en Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3 como respuesta a variaciones de temperatura y salinidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepa
La cepa Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3 proviene de un suelo de “landfarming” y se obtuvo a partir de un enriquecimiento a 10ºC y una posterior selección con mezcla de hidrocarburos (hexano + heptano + isooctano).

Aislamiento e identificación
La cepa se aisló en medio Bushnell Haas agarizado (sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro cálcico 0,02 g, fosfato monopotásico 1 g, fosfato dipotásico 1 g, nitrato amónico 1 g, cloruro férrico 0,05 g, agar 15 g) en aerobiosis, en atmósfera de hexano: heptano: isoctano (1:1:1) en bolsas de polipropileno herméticamente selladas.
Para la identificación se utilizaron dos sistemas: uno por caracteres fenotípicos metabólico-fisiológicos, sistema de identificación automatizado BIOLOG (Biolog, Inc, Hayward, Calif.) Microbial ID Inc., Newark, Del., U.S.A. y el sistema API 20NE de Biomérieux, Marcy-l’Étoile-Francia. El otro sistema fue quimiotaxonómico, por medio de metil ésteres de ácidos grasos de membranas, sistema Sherlock de MIDI. El mejor nivel de identificación se logró con ese último, correspondiendo a Pseudomonas fluorescens.

Extracción y análisis de ácidos grasos
Las bacterias fueron cultivadas durante 24 h en cada una de las condiciones de este ensayo (temperaturas de 14, 28 y 35°C y concentraciones salinas de 0,5; 1,5; 2,5 y 3,5% de NaCl, para cada una de las temperaturas) en medio TSBA (tripteina soya agar adicionado de 2,5 g/l de glucosa).
La extracción de ácidos grasos se realizó por tratamiento de aproximadamente 40 mg (peso húmedo) de células crecidas en la tercera estría a las 24 h, efectuando una saponificación con alcohol metílico-hidróxido de sodio-agua (150 ml, 45 g,150 ml) seguida de una metilación con ácido clorhídrico 6N y alcohol metílico (325 ml: 275 ml) y a continuación una extracción con n-hexano-metil terbutil eter (1:1) y lavado con hidróxido de sodio- agua (10.8 g-900 ml), de acuerdo con el procedimiento del sistema de identificación SHERLOCK (MIDI Newark, Del., USA)
Los ácidos grasos se determinaron como metil ésteres por cromatografía gaseosa, usando una columna capilar Ultra 2 de 25 m de longitud, 0,2 mm de diámetro, el análisis se llevó a cabo con un cromatógrafo HP 5890 series II GC (inyección “splitless”; presión inicial 10 psi; programa de temperatura: 170-260°C a 5°C/min, 260-310°C a 40°/min, 1,5 min. de permanencia a 310°C, detector por ionización de llama) controlado por HP 3365 (Hewlett Packard), La integración de los picos se efectuó mediante HP 3365 Chem Station, los ácidos grasos fueron identificados utilizando Sherlock Midi.

Definiciones de agrupamientos de ácidos grasos
n:0= Sumatoria de todos los porcentajes ácidos grasos saturados que no poseen otra función, (sumatoria de: 9:0, 10:0, 11:0, 12:0, 13:0, 14:0, 15:0, 16:0, 17:0, 18:0, 19:0, 20:0).
n:0 OH= Sumatoria de los porcentajes de ácidos grasos saturados (n:0) que poseen una función OH en posición 2 ó 3.
n:1= Sumatoria de los porcentajes de ácidos grasos con una insaturación en posición cis.
n:0 ciclo= Sumatoria de todos los porcentajes de los ácidos grasos saturados que contienen ciclo propano en 7, 8 o 10.
Largo total= Promedio del número de carbonos de todos los ácidos grasos.
S= Sumatoria de todos los porcentajes de los ácidos grasos saturados independientemente de que contengan otros grupos funcionales.
ciclo/cis= Razón entre los porcentajes de ácidos grasos ciclo y cis.
sat/insat-totales= Razón entre los porcentajes de ácidos grasos saturados y mono insaturados totales.
n:0/n:1= Razón entre los porcentajes de ácidos grasos saturados e insaturados.
Todas las determinaciones se efectuaron por triplicado y se utilizaron los promedios para la confección de tablas y figuras.

RESULTADOS

La identificación se basó en el perfil de ácidos grasos efectuado con el sistema Sherlock de Midi y coincidió con Pseudomonas fluorescens
La cepa utilizó los siguientes sustratos como única fuente de carbono y energía en el sistema Biolog: a-ceto butírico, a-ceto glutárico, a-ceto valérico, D,L-láctico, malónico, propiónico quínico, D-sacárico, ácido succínico, bromo succínico, ácido sucinámico, glucuronamida, alaninamida, D-alanina, L-alanina, L-alanil-glicina, L-asparagina, L-aspártico, L-glutámico, glicil-L-glutámico, L-leucina, L-ornitina, L-prolina, L-piroglutámico, D-serina, L-serina, L-treonina, D,L-carnitina, g-amino butírico, urocánico, inosina, uridina, 2-amino etanol, 2,3-butanediol, glicerol, glucógeno, tween 40, tween 80, L-arabinosa, D-arabitol, D-fructosa, D-galactosa, a-D-glucosa, m-inositol, D-manitol, D-manosa, psicosa, D-sorbitol, D-trehalosa, metil piruvato, mono metil succinato, ácido acetico, cis-aconitato, ácido citrico, ácido fórmico, D-galactónico, lactona, D-galacturónico, D-glucónico, D.glucosamínico, D-glucurónico, a-hidroxi butírico, b-hidroxi butírico.
No utiliza los siguientes sustratos como única fuente de carbono y energía: a-ciclodextrina, dextrina, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosamina, adonitol, celobiosa, l-eritritol, L-fucosa, gentiobiosa, a-D-lactosa, lactulosa, Maltosa, D-melibiosa, b-metil D-glucósido, D-rafinosa, L-ramnosa, sacarosa, turanosa, xilitol, g-hidroxi butírico, p-hidroxi fenilacético, itacónico, sebácico, glicil-L-aspártico, L-histidina, hidroxi L-prolina, L-fenilalanina, timidina, fenil etilamina, putrescina, D,L-a-glicerol fosfato, glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato.
La composición en ácidos grasos de la cepa en estudio en condiciones estándar (definidas como crecimiento en Agar TSBA, a 28°C, durante 24 h) se presenta en el Cuadro 1.

 

Efecto de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre la composición de los ácidos grasos saturados (n:0) de membranas bacterianas
Las modificaciones, a temperatura constante, en respuesta al incremento de la salinidad muestran que los porcentajes de n:0 son prácticamente iguales entre 0,5 y 2,5% NaCl. Existen cambios, que dependen de la temperatura, a concentraciones de 3,5% NaCl, a 14ºC disminuyen, a 28ºC se aumentan y a 35ºC permanecen invariables (Figura 1). La longitud de la cadena de carbonos de los ácidos grasos, no se modifica con la salinidad a 35°C. A 28°C no hay modificación de la longitud a salinidades de 0,5 y 1,5 bajando de un promedio de 15,4 a 14,8 desde salinidades de 1,5 a 3,5%. Para temperatura de 14ºC, aumenta la longitud en salinidades de 0,5 a 2,5% y disminuye a 3,5 % NaCl, hay una disminución del largo promedio a 28ºC. La cepa estudiada tiene un comportamiento errático del porcentaje de ácidos grasos saturados como en su longitud de cadena con relación a la variación de concentración del cloruro de sodio.

Figura 1. Influencia de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre la composición en ácidos grasos saturados en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3. A. Porcentaje de los ácidos grasos n:0 a temperatura constante. B. Porcentaje de los ácidos grasos n:0 a salinidad constante.

Para este grupo de ácidos grasos el comportamiento de Pseudomonas fluorescens GNP-OHP-3 frente a la temperatura (con salinidades constantes) sigue una estrategia esperable, aumenta la saturación, que eleva el punto de fusión de ácidos grasos, para mantener la homeoviscosidad, pero sigue modelos que también dependen de la concentración salina. Hasta salinidades del 2,5% el comportamiento es muy similar pero a una concentración a 3,5% NaCl perturba la estrategia. Al aumentar la temperatura se incrementa el porcentaje de ácidos grasos saturados mayormente 16:0 (Figura 1), siguiendo una ecuación de segundo grado para las concentraciones de cloruro de sodio utilizadas [% de n:0 _{(0,5% NaCl)}= 0.0152T2^{- 0.0436T + 20.04; % de n:0 _{(1,5 % NaCl)}= 0.034T2 0.975T + 29.13; % de n:0 _{(2,5% NaCl)} = 0.0397T2 - 1.2371T + 33.653; % de n:0 _{(3,5 % NaCl)}= -0.0537T2} + 3.6986T - 24.417 {T = temperatura en °C}]. Este incremento se efectúa a expensas de los ácidos grasos monoinsaturados cis (figura 3.b) (n:1 cis, ⎜:1 w7cis]) su disminución también sigue ecuaciones polinómicas de segundo orden.

Figura 3. Influencia de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre la composición en ácidos grasos n:1 cis en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3. A. Porcentaje de los ácidos grasos n:1 cis a temperatura constante. B. Porcentaje de los ácidos grasos n:1 cis a salinidad constante.

La longitud en átomos de carbono en respuesta al aumento de temperatura en las cuatro salinidades no presentan un comportamiento predecible o que siga un modelo matemático determinado (datos no mostrados).

Efecto de la concentración de cloruro de sodio y de la temperatura sobre el porcentaje de los ácidos grasos saturados totales
El efecto de la concentración salina es similar al que ésta ejerce sobre los n:0 pero existe una diferencia muy notoria a 14°C en que la salinidad al 3,5% incrementa notablemente el porcentaje de estos ácidos en vez de disminuirlo como en n:0 (Figura 2). La acción de la temperatura para las concentraciones de 0,5 a 2,5% tiene un patrón similar de comportamiento, incrementando el porcentaje. La concentración del 3,5% tiene un comportamiento distinto con una leve disminución. (Figura 2). El promedio de longitud de los ácidos grasos saturados totales se incrementa en las dos concentraciones extremas (0,5 y 3,5%), con valores mucho mayores para 3,5%, para las dos concentraciones medias primero disminuye levemente a 28°C, para incrementarse a 35°C (Cuadro 2).

Figura 2. Influencia de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre la composición en ácidos grasos saturados totales en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3. A. Porcentaje de los ácidos grasos saturados totales a temperatura constante. B. Porcentaje de los ácidos grasos saturados totales a salinidad constante.

Efecto de la concentración de cloruro de sodio y de la temperatura sobre el porcentaje de los ácidos grasos insaturados (n:1 cis) de membranas bacterianas
La acción de la salinidad sobre el porcentaje de n:1 cis depende de las temperaturas de ensayo. El porcentaje de n:1 cis tiene una tendencia a la disminución a medida que aumenta la salinidad para las temperaturas de 14 y 35°C. A 28°C los porcentajes se mantienen prácticamente iguales, salvo para salinidades del 3,5% que hay una disminución de aproximadamente el 10% (Figura 3). El aumento de temperatura induce una disminución del porcentaje de estos ácidos grasos con variaciones mínimas en cuanto a la salinidad (Figura 3).
Los modelos que sigue la disminución de temperatura son:(n:1 cis _{(0,5% NaCl)} = 0,0369 T² – 2,6986 T + 92,313); n:1 cis_{(1,5% NaCl)} = 0,0511 T² – 1,3186 T + 47,913; n:1 cis_{(2,5% NaCl)} = 0,0727 T² – 2,0829 T + 43,6; n:1 cis_{(3,5% NaCl)} = 0,0840 T² – 3,447 T + 10,627.
La longitud promedio de los ácidos grasos n:1 cis se modifica con la temperatura. Estas modificaciones dependen de la concentración salina, para concentraciones 3,5%, aumenta en todo el rango de temperatura (2 átomos de carbono). Para 1,5% no se modifica y para 0,5 y 2,5% se incrementa de 28 a 35ºC (Cuadro 3).

Efecto de la concentración de cloruro de sodio y de la temperatura sobre el porcentaje de los ácidos grasos saturados/insaturados (N:0/N:1) de membranas bacterianas
La salinidad afecta este índice de acuerdo con la temperatura de crecimiento, a 14°C no hay modificaciones importantes, a 28°C hay una estabilidad del índice para las tres primeras concentraciones incrementándose con la mayor concentración de sal. A 35°C hay un incremento constante entre 0,5 y 2,5% y se mantiene constante entre 2,5 y 3,5% (Figura 4). La relación saturados/insaturados se incrementa con la temperatura, siendo mayor la relación con el 3,5% de salinidad y menor con salinidad del 0,5% (Figura 4).

Figura 4. Influencia de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre en la relación saturados – insaturados en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3. A. Índice saturados/insaturados a temperatura constante. B. Índice saturados/insaturados a salinidad constante.

Efecto de la concentración de cloruro de sodio y de la temperatura sobre el porcentaje de los ácidos grasos ciclo
La temperatura modifica la composición de los ácidos grasos ciclo siguiendo ecuaciones lineales [% 17:0 ciclo _(35°C) = 4.307T + 1.7785 (r ² = 0.9897) ; % 17:0 ciclo _(28°C) = 1.409T + 1.3745 (r ²= 0.8347); % 17:0 ciclo (14°C) = 0.501T - 0.3395 (r ² = 0.6442)]. (Figura 5).

Figura 5. Influencia de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre el porcentaje 17:0 ciclo en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3. A. Porcentaje de los ácidos grasos 17:0 ciclo a temperatura constante. B. Porcentaje de los ácidos grasos 17:0 ciclo a salinidad constante.

Las diferentes concentraciones salinas utilizadas modifican el porcentaje de estos lípidos siguiendo ecuaciones exponenciales, que dependen también de la temperatura [% 17:0 ciclo _{(3,5 % NaCl)} = 0.4264e0.1026T (r ²= 0.9899); % 17:0 ciclo _{(2,5 % NaCl)} = 0.0248e0.1824T (r ² = 0.9929); % 17:0 ciclo _{(1,5 % NaCl)} = 0.0295e0.1575T (r² = 0.9997); % 17:0 ciclo _{(0,5 % NaCl)} = 0.194T - 2.5321 (r ² = 0.9989) (Figura 5).

Efecto de la concentración de cloruro de sodio y de la temperatura sobre el porcentaje de los ácidos grasos relación ciclo/cis
Estarelación se incrementa con la salinidad, con modificaciones cuantitativas en las tres temperaturas ensayadas. A 14°C la relación se incrementa poco. A 28ºC el incremento se establece en 1 y 3,5% y a 35°C el índice sufre un incremento casi lineal a partir de la 0,5%. La temperatura produce un incremento casi lineal entre 14 y 35°C para un agregado de cloruro de sodio del 0,5%, para salinidades mayores el incremento es mayor produciéndose en dos intervalos, entre 14 y 28°C el incremento es relativamente bajo pero crece abruptamente para el intervalo 28-35°C siendo mayor cuanto mayor es la salinidad.

Efecto de la concentración de cloruro de sodio y de la temperatura sobre el porcentaje de los ácidos grasos saturados (n:0 OH) de membranas bacterianas
La acción de la concentración salina presenta diferentes respuestas en los porcentajes de los n:0 OH, a 14°C entre 0,5 y 2,5 g % de cloruro de sodio no hay variaciones, pero a 3,5 se produce un incremento de aproximadamente el 200%. El comportamiento en 28 y 35°C fue muy similar y sólo se produce un incremento a salinidades 1,5 g % cloruro de sodio, para volver a los valores similares a la mas baja salinidad, a concentraciones de 2,5 y 3,5 % (Figura 6).

Figura 6. Influencia de la temperatura y concentración de cloruro de sodio sobre la composición en ácidos grasos n:0 OH en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3. A. Porcentaje de los ácidos grasos n:0 OH a temperatura constante. B. Porcentaje de los ácidos grasos n:0 OH a salinidad constante.

La longitud promedio de este grupo de ácidos grasos disminuye a concentraciones del 1,5% y se incrementa a partir de esa concentración, teniendo mayor pendiente en el intervalo 2,5 – 3,5%. La temperatura influencia la modificación de los porcentajes de los ácidos grasos n:0 OH, pero no sigue un patrón determinado. Con las concentraciones de 0,5% no hay modificaciones con la temperatura. Para 1,5 y 2,5% la temperatura de 14°C deprime el porcentaje y se mantiene igual a 28 y 35°C. La variación más notable se produce con la concentración del 3,5% que produce una disminución abrupta del 39% al 15% y luego a 11% con el aumento de temperatura (Figura 6).
La longitud promedio de los ácidos grasos tiene una tendencia al incremento en todas las concentraciones salinas entre 14 y 28°C teniendo diferentes tendencias entre las temperaturas 28 y 35°C, con 0,5% continúa un incremento similar al segmento anterior, para 1,5 y 2,5% se mantienen prácticamente iguales y caen para el 3,5%

DISCUSION

La cepa tiene un buen potencial de utilización de sustratos (61 sobre 94 ensayados) utilizando ácidos orgánicos, aminoácidos, azúcares y alcoholes. Este elevado potencial de utilización de fuentes de carbono es concordante con su potencial de utilización de hidrocarburos, y tiene especial importancia la capacidad de crecer a expensas de hidrocarburos de bajo peso molecular como los que se utilizaron para su selección (hexano, heptano, isoctano).
Los ácidos grasos mayoritarios tienen 16 átomos de carbono 16:0 (24,68%) y 16:1 (32,15%) y son los que contribuyen en mayor medida en la adaptación de la membrana a la temperatura. Un ácido graso derivado de este último, el 17:0 ciclo adquiere relevancia tanto en la adaptación a la temperatura como a la salinidad. Los ácidos grasos ciclo se han mencionado como elementos de adaptación de las membranas celulares a procesos de estrés. (1, 29)
Los resultados del reordenamiento que se produce con los ácidos grasos n:0 de membrana siguen un patrón de comportamiento definido por ecuaciones matemáticas, que son sólo válidas entre las dos temperaturas, máxima y mínima, ensayadas. El aumento de la insaturación de ácidos grasos con la disminución de temperatura se produce para mantener la fluidez de la membrana (32). Con esta modificación (saturación-desaturación) se mantiene la homeoviscocidad de la membrana celular y su funcionalidad a lo largo del rango de temperaturas de crecimiento.
Russell (33) ha comunicado que los cambios que produce la temperatura sobre la membrana es una alteración en la composición de los ácidos grasos y que los cambios en la parte polar de los fosfolípidos es generalmente menor. Los cambios observados en la bacteria en estudio, en cuanto a la modificación de los ácidos grasos, con la temperatura coinciden con esta comunicación.
Cronan (3) ha publicado la acción del aumento de la temperatura sobre la estructura de ácidos grasos en bacterias de este género, en condiciones en que no se permitía la síntesis de novo, en esos casos las bacterias respondían modificando la estereoisomería de cis (n:1 cis) a trans (n:1 trans) mediante la enzima cis-trans isomerasa en Pseudomonas putida, esta estructura tiene una rigidez semejante a una estructura saturada (n:0). Estas modificaciones son transitorias hasta que la bacteria pueda sintetizar nuevos ácidos grasos con estructuras más estables.
En las condiciones de este trabajo a las bacterias les fue posible sintetizar de novo sus ácidos grasos, sin embargo han utilizado la vía de la desaturación como forma principal de mantener su homeoviscocidad, y no el aumento del número de átomos de carbono como forma de aumentar el punto de fusión de los ácidos grasos de membrana. Este resultado es coincidente con el obtenido por Dubois-Brissonnet y col (8) en Pseudomonas aeruginosa en distintos estados fisiológicos y a diferentes temperaturas, quienes también proponen una ecuación polinómica para explicar el comportamiento. En contraposición con estos autores no se ha encontrado en Pseudomonas fluorescensgnp-ohp-03, modificaciones importantes en el ácido graso 12:0 (promedio 3,47% - desviación estándar 0,57).
La formación de ácidos grasos con ciclo propano en su molécula ha sido comunicada como ampliamente difundida entre las bacterias, y se produce por la enzima ciclopropano ácido graso sintetasa que depende de un donante de metilos, la S-adenosin metionina (11). El ácido graso ciclo-propano presente en Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3 es el 17:0 ciclo. El porcentaje de éste en condiciones estándar (28ºC – 24 h de incubación en medio TSBA) es bajo (2,82%) pero el promedio para todos los tratamientos es de 5,08% con una desviación estándar de 5,24% lo que indica la gran variabilidad en la cantidad de este ácido graso, juega un papel importante tanto en la respuesta a las modificaciones de salinidad como de temperatura. Estos ácidos grasos están presentes en otras bacterias en las que también tienen funciones en el mantenimiento de la homeoviscosidad de membrana, hay comunicaciones de modificaciones en los porcentajes de ácidos grasos ciclo propano en bacterias como Escherichia coli y en Streptococcus mutans. como respuesta a variaciones de pH, en Lactococcus lactis que responde estrés osmótico aumentando el 19:0 ciclo, a partir del 18:1 cis, siendo esta modificación la única que presenta Lactococcus lactis en sus ácidos grasos de membrana al estrés osmótico. (1, 13, 29)
Valderrama y col (38) encontraron que Halomonas salina, bacteria moderadamente halófila, modificaba su porcentaje de ácidos grasos ciclo en detrimento de los ácidos grasos monoinsaturados, produciendo un notorio incremento cuando estos ácidos grasos se determinan en la fase exponencial de crecimiento.
En el caso de Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3 las modificaciones de membrana se comportan siguiendo ecuaciones lineales con la temperatura y exponenciales con la concentración salina. Pseudomonas fluorescens cepa GNP-OHP-3 tiene un comportamiento en la modificación de ácidos grasos como respuesta a las variaciones de temperatura que comparte con otros integrantes de su género. Aumenta sus ácidos grasos saturados y disminuye los ácidos grasos insaturados con el aumento de la temperatura. Las variaciones que se producen por las concentraciones salinas ensayadas son en general erráticas para los ácidos grasos mayoritarios, pero para ácidos grasos ciclo propano hay modelos matemáticos que permiten predecir el porcentaje de ácidos grasos que contienen ciclo propano como respuesta a la concentración de cloruro de sodio.

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Recibido: 1/04/03.
Revisado: 7/1/04.