Desarrollo de un antígeno para diagnóstico del parvovirus de las ratas (virus Kilham) por la técnica de inhibición de la hemaglutinación

M.A. Ayala¹, J. Laborde¹, S. Milocco¹, C. Carbone¹, V. Cid de la Paz², C.M. Galosi^2*

¹Cátedra de Animales de Laboratorio, y ²Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, Calle 60 y 118, 1900 La Plata, Argentina.
^*Correspondencia. E-mail: cmgalosi@fcv.unlp.edu.ar

RESUMEN
Se desarrolló un antígeno (Ag) para el diagnóstico de la infección por parvovirus Kilham de las ratas (KRV) por la técnica de inhibición de la hemaglutinación (IHA). Para su elaboración se utilizaron cultivos primarios de fetos de ratas, infectados con KRV, los que fueron cosechados a diferentes tiempos posinfección, centrifugados y cada sedimento celular resuspendido en un volumen 100 veces menor al original. Cada muestra fue posteriomente sonicada, centrifugada y el sobrenadante (Ag) fue titulado por hemaglutinación (HA). El Ag elaborado a partir de células al 5to día posinfección ofreció el mejor título hemaglutinante. La especificidad del mismo fue confirmada por IHA con sueros específicos de referencia positivo y negativo a KRV y positivos a otros agentes infecciosos virales y bacterianos. Se analizaron 98 sueros por IHA y los resultados coincidieron con los obtenidos por un laboratorio de referencia. El Ag producido resultó específico, sensible, de fácil elaboración y de gran utilidad para el control de las colonias de ratas de producción y experimentación del país.
Palabras clave: diagnóstico, inhibición de la hemaglutinación, parvovirus de las ratas (virus Kilham).

SUMMARY
Development of an antigen for the diagnosis of Kilham rat parvovirus by hemagglutination inhibition test. An antigen of rat parvovirus (Kilham virus) was developed for the diagnosis of viral infection in rat colonies by using hemagglutination inhibition (HAI) test. Primary cell cultures from rat embryos were infected with Kilham rat virus. Infected cells obtained at different time post infection were scraped, centrifuged, concentrated one hundred times, sonicated and centrifuged again. The supernatants obtained were titrated by hemagglutination. The specificity was confirmed with positive and negative reference sera. Ninety eight serum samples were studied by using HAI test. The results coincided with those obtained in a reference laboratory. Kilham rat parvovirus antigen obtained from 5 days-infected-cells was specific, sensitive, easy to prepare, with a high yield and it is useful to detect this virus in experimental and production rat colonies.
Key words: diagnosis, hemagglutination inhibition, Kilham rat parvovirus.

El virus Kilham de las ratas (KRV) es un parvovirus aislado de varios tumores de ratas por Kilham y Olivier (5) en la década del 50. Posteriormente, se aisló un segundo parvovirus (H1) a partir de líneas celulares derivadas de un tumor humano (7, 10). Actualmente se reconoce la existencia del RPV-1“a”, un tercer serogrupo de parvovirus que afecta a las ratas (2, 13). El KRV generalmente causa infecciones de tipo subclínico; sin embargo, las ratas adultas expuestas a condiciones de estrés pueden desarrollar manifestaciones clínicas. Los principales signos que se observan incluyen ataxia, hipoplasia cerebelar, encefalopatías en general, cianosis escrotal, deshidratación de ratas jóvenes y muerte súbita.
Este patógeno es de amplia distribución en las colonias siendo su prevalencia muy alta, ya que se considera que el 80% de ratas convencionales se encuentran infectadas por este virus (9). Cuando el KRV infecta una colonia disminuyen rápidamente los nacimientos debido a que se producen reabsorciones embrionarias y muertes fetales (4, 12). El KRV -como otros parvovirus- puede interferir en las investigaciones en las que se utilizan ratas como modelo experimental o cultivos celulares derivados de ratas, por lo que la identificación de los animales infectados es muy importante para evitar el impacto de este virus (11).
La potencial capacidad de transmisión vertical como también la notable resistencia de este agente al medio ambiente hace que su detección y control sea de especial importancia en la producción de animales de laboratorio (6). De las técnicas serológicas que se utilizan para el diagnóstico, la fijación de complemento y la inmu-nodifusión son las menos sensibles. La inmunofluo-rescencia (IF) al igual que el ELISA, a pesar de ser más sensibles, son de menor especificidad y es mayor el riesgo de reacciones cruzadas, por lo que se utilizan normalmente como técnicas de tamizaje (1, 8, 13). La seroneutralización (SN) y la inhibición de la hemaglu-tinación (IHA) son técnicas altamente específicas. La SN requiere de varios días para obtener un resultado, mientras que la IHA es de rápida realización y permite analizar un número significativo de muestras en un lapso relativamente breve. Los tres parvovirus que afectan a las ratas (KRV, H1 y RPV 1 “a”) presentan reacción cruzada por IF. Sin embargo, son antigénicamente diferentes y no presentan reacciones cruzadas por IHA (12). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un antígeno (Ag) con capacidad hemaglutinante, cuya obtención fuera de fácil realización y de alto rendimiento para ser utilizado en el control de las colonias de experimentación y producción de ratas en nuestro país.
Para el desarrollo del Ag se utilizaron cultivos primarios derivados de fetos de ratas WKAH/Hok. Las madres fueron certificadas como libres de patógenos específicos (SPF) y serológicamente negativas para antígenos de KRV, por el Instituto Central de Experimentación Animal-Kawasaki-Japón (CIEA), al fundarse la colonia del Bioterio de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata (B-FCV-UNLP). La colonia es mantenida desde su fundación, en expansión en área limpia, bajo barreras sanitarias y es controlada cada tres meses con monitoreos microbiológicos y serológicos siguiendo las normas internacionales establecidas por el ICLAS (International Council for Laboratory Animal Science) para ratas SPF (12). Los controles microbioló-gicos se realizan en el B-FCV-UNLP y los controles serológicos para infecciones virales los realiza el Centro de Referencia de ICLAS, sito en el Bioterio de la Universidad de Campinas-San Pablo-Brasil (CEMIB-UNICAMP).
Para la producción de los cultivos primarios se sacrificaron ratas de aproximadamente 13 días de gestación, de acuerdo con las normativas internacionales de eutanasia, en cámara de inyección lenta de CO₂. Los fetos fueron extraídos en forma aséptica, separados de la placenta y colocados con perlas de vidrio estériles en una mezcla formada por partes iguales de tripsina al 0,25% en solución tamponada de fosfatos pH 7,2 (PBS) y ácido etilendiaminotetracético (EDTA) al 0,2% en PBS. Una vez disgregado el tejido se inactivó la acción de la tripsina con suero fetal bovino (SFB), se filtró a través de gasa estéril y se centrifugó a 1000 rpm durante 10 min. El sedimento celular obtenido se resuspendió en medio mínimo esencial (MEM) con 10% de SFB, se sembraron frascos de cultivo a razón de 1-2 x 106 células/ml y se incubaron a 37°C en atmósfera controlada de CO₂. A las 18 h de desarrollo, los cultivos fueron infectados con multiplicidad de infección @ 1 con la cepa 308 de KRV (CIEA); se dejaron en adsorción durante 1 h a 37°C y posteriormente continuaron su desarrollo con la adición de MEM + 10% de SFB. Las monocapas celulares infectadas, junto con el medio de cultivo, se cosecharon individualmente a las 36 h, 2, 3, 4, 5 y 6 días posinfección (PI) y se centri-fugaron a 5000 rpm durante 20 min. Cada sedimento celular se lavó tres veces con PBS y se resuspendió en un volumen 100 veces menor que el volumen original de cada cultivo. Posteriormente, cada muestra fue sonicada tres veces por 15 seg en frío ( Heat Systems Ultrasonic. Inc. Model W-220F) y finalmente fue centrifugada a 8000 rpm durante 15 min. Cada uno de los sobrenadantes obtenidos, considerados como Ag, se conservaron fraccionados en pequeños volúmenes a –70°C y posteriormente fueron titulados por hemaglutinación (HA) en microplacas de acuerdo al método convencional, utilizando diluciones en base 2 a partir de la dilución ½ y glóbulos rojos de cobayo (GRC) al 1% (6). Como diluyente de los Ag y GRC se utilizó solución de PBS con 0,1% de seroalbúmina bovina (PBS-BSA). La experiencia de elaboración de cada uno de los Ag a diferentes períodos PI se repitió cinco veces consecutivas.
La especificidad del Ag fue determinada por IHA con sueros de referencia positivo y negativo para KRV (cedidos por el CEMIB-UNICAMP) y 5 sueros positivos para sialodacryoadenitis, virus Sendai, Micoplasma sp, Car-bacillus y Enfermedad de Tyzzer (cedidos por el Instituto Nacional de Salud de Japón), respectivamente. La técnica de IHA se desarrolló de acuerdo con el método citado por Robey y col (6) utilizando 8 unidades HA. Se analizaron 98 sueros de ratas: a) mantenidas bajo barreras sanitarias en el B-FCV-UNLP (n=50); b) de dos bioterios convencionales de Argentina (n=24); c) del CEMIB-UNICAMP con diagnóstico serológico previo de KRV (n=24). Todos los sueros se inactivaron a 56°C durante 30 min y se diluyeron 1/5 con PBS-BSA. Las muestras duplicadas de los mismos sueros se trataron con una suspensión de Kaolín al 25% en PBS (concentración final 1/5). Los sueros del grupo a y b fueron remitidos además al CEMIB-UNICAMP para su análisis como contraprueba.
Del análisis de los diferentes Ag obtenidos a diferentes períodos de tiempo PI, se determinó que el Ag elaborado con células al 5to día PI ofrecía los mejores títulos en la reacción (Cuadro 1), por lo que para el análisis de los sueros por IHA se utilizaron 8 UHA (dilución 1:2000) de un Ag HA de título @ 1 /16000. El título IHA de los sueros fue expresado como la mayor dilución de los mismos que inhibió completamente la HA y los resultados obtenidos se citan en el Cuadro 2.

Las técnicas serológicas para la detección de KRV deben ser sensibles y específicas. La técnica de ELISA y la IF, que son las más sensibles, pierden especificidad debido a que los anticuerpos (Ac) reaccionan en forma cruzada con proteínas no estructurales conservadas entre todos los parvovirus que afectan a las ratas. La SN y la IHA son por eso consideradas de elección por ser técnicas más específicas, ya que detectan Ac contra proteínas estructurales de la cápside viral (1, 2). La IHA para la detección de anticuerpos anti KRV ya ha sido desarrollada en otros países con el uso de diferentes Ag. Algunos autores citan la utilización de suspensiones virales purificadas por columna de agar (13) o por ultracentrifugación (2). Otros, como el CEMIB-UNICAMP, utilizan directamente los sobrenadantes de cultivos celulares infectados con la desventaja de que no existe homogeneidad entre los diferentes lotes (comunicación personal, Dr Rovilson Gilioli, Director del Departamento de Salud Animal, CEMIB-UNICAMP).
El Ag elaborado en este trabajo demostró reprodu-cibilidad (100%) de los resultados por HA en las cinco pruebas realizadas (3), resultó específico, de alto rendimiento, y su preparación fue de alta practicidad. Este método implicó que no fuera necesario mantener el desarrollo de cultivos celulares infectados en forma constante lo que constituye una ventaja metodológica. La IHA es una técnica cuyos resultados pueden verse afectados por la presencia de inhibidores inespecíficos y debido a ello los sueros generalmente deben ser tratados para la remoción de dichos inhibidores. Por lo tanto debe considerarse que muchas veces estos tratamientos resultan en detrimento de la detección de bajos niveles de Ac (4, 8). Para el análisis de KRV muchos autores utilizan el tratamiento de los sueros con kaolín o la adsorción con GRC, mientras que otros no lo encuentran necesario (4). En este trabajo se utilizó PBS-BSA como diluyente de los sueros (8) y además se realizó el tratamiento con kaolín a los duplicados de las muestras con el objeto de mantener idénticas condiciones que el laboratorio de contraprueba. En ambos sistemas no se presentaron reacciones inespecíficas y se encontraron títulos IHA similares en los sueros tratados y en los no tratados. Por eso se consideró que PBS-BSA como diluyente de los sueros puede ser utilizado rutinariamente para el análisis disminuyendo de esta manera el tiempo de realización de la prueba. Los títulos de anticuerpos IHA hallados por nosotros en los sueros coincidieron en su mayoría con los hallados por el laboratorio de referencia. Sólo se encontró una mínima diferencia de título (una dilución) en un suero del lote b y dos del lote c lo que pudo haberse debido a variaciones metodológicas individuales. El porcentaje de positivos hallados en los sueros de los dos bioterios de ratas convencionales del país es de un valor @ 41, lo que se encuentra bastante alejado de aquel que se cita como prevalencia habitual (70%) para este tipo de bioterios (12). Para presentar un valor más exacto de prevalencia deberán analizarse un mayor número de muestras lo que será objetivo de un próximo trabajo.
El diagnóstico de infección por KRV de manera precisa y rápida en las colonias de experimentación y producción de ratas es un paso muy importante en la prevención y control de esta infección. Nuestros resultados han demostrado que el Ag producido es sensible, de fácil elaboración y de gran utilidad para un diagnóstico serológico específico de aplicación en las colonias de nuestro país.

Agradecimientos. CMG y VCP son miembros de la Carrera de Investigador y Profesional de Apoyo, respectivamente, de la Comisión de Investigaciones Científicas (CIC) de la Pcia de Buenos Aires. Este estudio fue parcialmente financiado por la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de La Plata. Los autores agradecen la colaboración de la Bacterióloga Pilar Cagliada, del Lic. Fabricio Maschi, del Med. Vet. Christian Alberto y de la técnica Srta María del C. Mondragón.

BIBLIOGRAFÍA

1. Ball-Goodrich LJ, Hansen G, Dhawan R, Paturzo FX, Vivas Gonzalez BE (2002) Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of mouse parvovirus infection in laboratory mice. Comparative Medicine 52: 160-166.         [ Links ]
2. Besselsen DG, Besch-Williford CL, Pintel DJ, Franklin CL, Hook JR Jr, Riley LK (1995) Detection of H-1 parvovirus and Kilham rat virus by PCR. J. Clin. Microbiol. 33: 1699-1703.         [ Links ]
3. Gardner IS, Greiner M (1998) Manual for the First International Course on Advanced methods for test validation and interpretation in veterinary medicine. Joint Cooperation between the Freie Universitat Berlin and The University of California Davis. January 20-22, Berlín, Alemania.         [ Links ]
4. Jacoby RO, Bhatt PN, Jonas AM (1979) Viral Disease (Chapter 11). En: Baker HJ, Lindsey JR., Weisbroth SH (Ed), The laboratory rat, Vol 1: Biology and Diseases, Academic Press, New York, p. 272-283.         [ Links ]
5. Kilham L, Olivier LJ (1959) A latent virus of rats isolated in tissue culture. Virology 7: 428-437.         [ Links ]
6. Robey RE, Woodman DR, Hetrick FM (1968) Studies on the natural infection of rats with Kilham rat virus. Am. J. Epidemiol. 88 : 139-143.         [ Links ]
7. Salzman LA, Jori LA (1970) Characterization of the Kilham rat virus. J. Virol. 5 : 114-122.         [ Links ]
8. Singh SB, Lang CM (1984) Enzyme-linked immunosorbent assay in the diagnosis of Kilham rat virus infection in rats. Laboratory Animals 18:364-370.         [ Links ]
9. Taylor K, Copley CG (1994) Diagnosis of Kilham rat virus using PCR . Laboratory Animals 28: 26-30.         [ Links ]
10. Toolan HW, Dalldorf G, Barclay M, Chandra S, Moore AE (1960) An unidentified filterable agent isolated from transplanted human tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 1256-1259.         [ Links ]
11. Wan C-H, Söderlund-Venermo M, Pintel DJ, Riley LK (2002) Molecular characterization of three newly recognized rat parvoviruses. J. Gen. Virol. 83: 2075-2083.         [ Links ]
12. Weisbroth SH (1994) Rat parvovirus. En: Waggie K, Kagiyama N, Allen AM, Namura T (Ed), Manual of Microbiologic Monitoring of Laboratory Animals 2nd Edition, NIH Publication 94-2498, Maryland, USA, p. 93-98.         [ Links ]
13. Whitman JE, Hetrick FM (1977) Purification of the Kilham rat virus. Appl. Microbiol. 15: 62-66.        [ Links ]

Recibido: 20/05/03.
Revisado: 22/12/03.