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Revista argentina de microbiología

versión impresa ISSN 0325-7541versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.36 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./mar. 2004

 

Detección de meticilino-resistencia en Staphylococcus aureus: Comparación de métodos convencionales y aglutinación con mrsa-Screen latex

R. Soloaga1*, A. Corso2, P. Gagetti2, D. Faccone2, M. Galas2, Grupo Colaborador MRSA3

1Maestría en Microbiología Clínica, Pontificia Universidad Católica Argentina, Buenos Aires, 2 Servicio de Antimicrobianos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI), ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, Buenos Aires, 3Grupo Colaborador MRSA: L. Guelfand, Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia (FLENI) e Instituto Cardiovascular de Buenos Aires (ICBA), Buenos Aires; H. Lopardo, Htal. de Pediatría Prof. Dr. J. P. Garrahan, Buenos Aires; J. Pace, Clinica Bazterrica, Buenos Aires; S. Kauffman, Htal. J. A. Fernandez, Buenos Aires; M. Tokumoto, Sanatorio Modelo Quilmes, Prov. Buenos Aires y Fundación Favaloro, Buenos Aires; A. Famiglietti, Htal. de Clínicas Gral. San Martín, Buenos Aires; M. Altschuler, Htal. Sor Maria Ludovica, La Plata, Prov. Buenos Aires; J. Smayevsky, Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas Dr. N. Quirno (CEMIC), Buenos Aires; P. Vidal, Instituto de Cardiología - Htal. Español, Buenos Aires; N. Checa Martínez, Htal. A. Padilla, Tucumán; A. Di Bella, Htal. Nacional Prof. Dr. A. Posadas, Prov. Buenos Aires; E. Mendes, Htal. José María Cullen, Santa Fe; B. Irigoyen, Htal. Dr. J. Perrando, Chaco; A. M. Zaloff Dakoff, Htal. Pediátrico Avelino Castelán, Chaco; M. Vazquez, Htal. de Niños Dr. Ricardo Gutierrez, Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: rnsoloaga@yahoo.com

RESUMEN
Staphylococcus aureus meticilino-resistente (MRSA) es un patógeno que ha emergido en las últimas cuatro décadas causando tanto infecciones nosocomiales como de la comunidad. La rápida y precisa detección de MRSA es relevante para guiar una apropiada terapia antibiótica y evitar la diseminación nosocomial de MRSA.En este trabajo se evaluó la eficiencia de métodos convencionales para la detección de meticilino-resistencia como difusión por discos, CIM en medio sólido, screening de oxacilina, y el nuevo test de aglutinación MRSA-Screen latex sobre 100 aislamientos de S. aureus, 79 mecA positivos y 21 mecA negativos. El test de aglutinación MRSA-Screen latex (Denka Seiken, Niigata, Japón) detecta la presencia de la PLP-2a, producto del gen mecA en cepas de S. aureus. La detección del gen mecA por PCR se utilizó como gold standard para comparar los resultados de los diferentes métodos. La sensibilidad y especificidad fueron 97 y 100 % para el método de difusión, 97 y 95 % para la CIM en medio sólido, 100 y 100 % para el screening de oxacilina y 100 y 100 % para MRSA-Screen latex. Todos los métodos presentaron alta sensibilidad y especificidad, pero el “MRSA-Screen latex” mostró la ventaja de poder brindar un resultado confiable, equivalente a la PCR, en sólo 15 minutos.
Palabras clave: Staphylococus aureus, resistencia a meticilina, aglutinación con latex.

SUMMARY
Methicillin resistance detection in Staphylococcus aureus: Comparison between conventional methods and Mrsa-Screen latex agglutination technique. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a significant pathogen that has emerged over the last four decades, causing both nosocomial and community-acquired infections. Rapid and accurate detection of methicillin resistance in S. aureus is important for the use of appropriate antimicrobial therapy and for the control of nosocomial spread of MRSA strains. We evaluated the efficiency of conventional methods for detection of methicillin resistance such as the disk diffusion, agar dilution, oxacillin agar screen test, and the latex agglutination test MRSA-Screen latex, in 100 isolates of S. aureus, 79 mecA positive and 21 mecA negative. The MRSA-Screen latex (Denka Seiken, Niigata, Japón), is a latex agglutination method that detects the presence of PLP-2a, product of mecA gene in S. aureus. The PCR of the mecA gene was used as the “gold standard” for the evaluation of the different methods tested. The percentages of sensitivity and specificity were as follows: disk difusión 97 and 100 %, agar dilution 97 and 95 %, oxacillin agar screen test 100 and 100 %, and MRSA-Screen latex, 100 and 100 %. All methods presented high sensitivity and specificity, but MRSA-Screen latex had the advantage of giving a reliable result, equivalent to PCR, in only 15 minutes.
Key words: Staphylococcus aureus, methicillin resistance, latex agglutination test.

INTRODUCCION

Staphylococcus aureus meticilino-resistente (MRSA) es un patógeno importante que ha emergido en las últimas cuatro décadas causando infecciones tanto nosocomiales como de la comunidad. Acorde a los datos del Programa WHONET, la prevalencia de MRSA en Argentina oscila entre 40 y 50% (19).
La rápida y exacta detección de MRSA es relevante para guiar una apropiada terapia antibiótica y evitar la diseminación nosocomial de MRSA. El mecanismo reponsable de meticilino-resistencia en S. aureus está basado en la producción de una proteína ligadora de penicilina adicional de baja afinidad (PLP 2a), la cual es codificada por el gen mecA (3, 4). Errores en la detección de la meticilino-resistencia tienen consecuencias graves, un resultado de falsa sensibilidad puede provocar falla de tratamiento, y un resultado de falsa resistencia implica un alto costo por tener al paciente aislado y por el uso innecesario de glicopéptidos, con el consecuente riesgo de selección de resistencia (3, 4). Recientemente, se ha desarrollado un test de aglutinación por látex (Denka Seiken, Niigata, Japón) para la rápida detección de la PLP2a en aislamientos de S. aureus, denominado MRSA-Screen latex.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la sensibilidad y especificidad de tres métodos convencionales para la detección de meticilino-resistencia en 100 aislamientos de S. aureus, difusión por discos, concentración inhibitoria mínima (CIM) en medio sólido y screening de oxacilina, y el nuevo test de aglutinación MRSA-Screen latex para detección de PLP 2a, en comparación con la PCR del gen mecA, la cual fue considerada como el método “gold standard”.

MATERIALES Y METODOS

Origen de los aislamientos
Para realizar este estudio se seleccionaron 100 cepas de S. aureus previamente caracterizadas, 79 cepas mecA positivas (+) y 21 mecA negativas (-). Los aislamientos provenían del cepario del Servicio Antimicrobianos (SA) del INEI, del Laboratorio de Microbiología de Rockefeller University (RU), NY, EU., y de Centers for Diseases Control (CDC), GA, EU. También se incorporaron al estudio las cepas de referencia S. aureus ATCC 43300 (meticilino-resistente heterogéneo) y S. aureus ATCC 29213 (meticilino sensible). Las 79 MRSA mecA (+) estudiadas fueron las siguientes: 2 heterogéneas de grado 1, CDC1 (RU) y M2839 (SA); 1 heterogénea de grado 2, NYHB3 (RU); 1 heterogénea de grado 3, BN 79 (RU); 2 homogéneas, COL1 (RU) y M2120 (SA); un representante de cada uno de los clones internacionales epidémicos de MRSA (5): clon Arcaico, ATCC BAA-38 (RU); clon Húngaro, ATCC BAA-39 (RU); clon Portugués, ATCC BAA-40 (RU); clon Nueva York, ATCC BAA-41 (RU); clon Pediátrico, ATCC BAA-42 (RU); clon Brasileño, ATCC BAA-43 (RU) y clon Ibérico, ATCC BAA-44 (RU); 10 MRSA sin resistencia acompañante (SA): M2670, M2822, M2826, M2828, M2829, M2831, M2832, M2847, M2848 y M2894; y 56 aislamientos provenientes de 14 hospitales.

Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Se determinó la sensibilidad a oxacilina por los siguientes métodos: difusión por discos (17), concentración inhibitoria mínima (CIM) por dilución en agar (17), y screening en agar Mueller Hinton con 6 mg/ml de oxacilina y 4% de NaCl (17).

Determinación de PLP 2a por medio de MRSA-Screen latex
Fue realizada acorde a las instrucciones del fabricante. Se enfrentó un cultivo fresco (3 ansadas de 1ml) de 24 h de S. aureus con el primer reactivo de extracción, luego se calentó en baño maría a 95ºC durante 3 min, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se agregó una gota del segundo reactivo de extracción, se mezcló, posteriormente se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y se recuperó el sobrenadante. Finalmente se enfrentó sobre una tarjeta de fondo negro, 50 ml del sobrenadante y 50 ml del reactivo que contiene anticuerpos monoclonales contra la PLP 2a; en otro cuadrante de la tarjeta se hizo lo mismo pero enfrentando el sobrenadante de la cepa con un látex control. La reacción de aglutinación fue leída a los 3 min, como indica el fabricante.

PCR
La detección del gen mecA por PCR fue usada como “gold standard” para comparar los resultados con las otras metodologías. La extracción del ADN se realizó a partir de un cultivo de la cepa, proveniente de una placa con 18 h de incubación. Se resuspendieron en tubo eppendorf, 4 o 5 colonias de la bacteria en 100 µl de agua destilada estéril. Se sometieron a ebullición durante 10 min, y luego se centrifugaron 2 min a 12000 rpm, recuperándose el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf estéril. Se utilizaron 5 ml del sobrenadante como ADN molde para la reacción de PCR. Dicha reacción además contenía 200 mM desoxinucleotidos trifosfato, 10mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 50 pmol de primers y 1,25 U de Taq DNA polimerasa (Promega). Los primers utilizados amplifican una región altamente conservada del gen mecA de 310 bp: mecA-Plus = 5’- TGG CTA TCG TGT CAC AAT CG -3’ y mecA-Minus = 5’- CTG GAA CTT GTT GAG CAG AG -3’ (30). Como control de extracción de ADN, a cada muestra se le realizó PCR de una región de 370 bp del gen ribosomal 16S, los primers utilizados fueron: 16S Plus = 5’ – AGG AGG TGA TCC AAC CGC A – 3’ y 16S Minus = 5’ – AAC TGG AAG AAG GTG GGG AT – 3’ (10). La amplificación se realizó en un termociclador Biometra (Whatman Biometra GmbH, Göttingen, Germany) según el siguiente esquema: desnaturalización a 94°C por 5 min, seguido de 30 ciclos a 94°C por 30 seg, 52°C por 30 seg y a 72°C por 30 seg, y luego una extensión final a 72°C por 5 min. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% conteniendo bromuro de etidio para su posterior visualización con luz UV. Las condiciones de corrida fueron: 100 V durante 30 min.

Análisis estadístico
Sensibilidad:se realizó dividiendo el número de cepas resistentes detectadas por cada método, por el total de cepas que evidenciaron la presencia del gen mecA por PCR.
Especificidad: se dividió el número de cepas sensibles evidenciadas por cada método, por el total de cepas que no demostraron el gen mecA por PCR.
Correlación esencial (C): se determinó utilizando como referencia la presencia del gen mecA, mediante la siguiente fórmula:

donde N es el número de cepas estudiadas, VM son los errores “muy mayores” (resultados falsos sensibles) y M son los errores “mayores” (resultados falsos resistentes)

RESULTADOS

Se incluyeron 79 aislamientos mecA positivos y 21 mecA negativos. Las 79 cepas mecA positivas fueron detectadas por el screening de oxacilina y el MRSA-Screen latex, mientras que por los métodos de difusión por discos y CIM en medio sólido sólo se detectaron 77 de ellas. Las 21 cepas mecA negativas se pudieron detectar por los métodos de difusión por discos, screening de oxacilina y MRSA-Screen latex, en cambio la CIM en medio sólido detectó 20/21 aislamientos (Cuadro 1).

De las 79 cepas mecA(+), 10 mostraron halos de inhibición con el disco de oxacilina, con presencia de colonias intra-halo: 10 mm (M2831), 11 mm (ATCC BAA-42), 12 mm (M2828 y SOR11), 13 mm (CLI08), 14 mm (M2129, FER08 y BAZ13), 15 mm (M2839) y 16 mm (BAZ24). La cepa CDC1, con hetero-resistencia de grado 1, presentó un halo de oxacilina de 13 mm sin colonias intra-halo. Las 68 cepas mecA (+) restantes, no presentaron halo de inhibición con oxacilina: FLE 13, GAR 02, ICBA 02, ICBA 08, BAZ 36, FER 23, QUI 06, CLI 01, SOR 26, FAV 02, FAV 36, CEM 23, GAR 09, SOR 07, GAR 03, ICBA 16, FAV 34, ICBA 06, CEM 12, ICBA 07, QUI 04, ESP 27, PAD 02, PAD 17, ESP 02, FAV 33, PAD 19, POS 10, CLI 07, ICBA 01, POS 09, QUI 14, FLE 02, BAZ 04, BAZ 17, ICBA 14, BAZ 40, FER 35, BAZ 08, ESP 15, CEM 17, FLE 08, PAD 07, CLI 03, PAD 01, QUI 05, BAZ 20, CLI 10, GAR 19, SOR 32, M2670, M2822, M2826, M2829, M2832, M2847, M2848, M2894, M2120, NYHB3, BN79, COL, ATCC BAA-38, ATCC BAA-39, ATCC BAA-40, ATCC BAA-41, ATCC BAA-43 y ATCC BAA-44.
Las 21 cepas mecA (-) fueron8 “oxacilino-borderline”, con halos de oxacilina entre 13 y 15 mm, de mecanismo desconocido (SA): M2835, M2837, M2841, M2842, M4196, M4197, M4198, M4201; 7 con halos de oxacilina entre 16 y 17 mm (SA), M2833, M2834, M2836, M4069, M4096, M4195, M4199; 1 hiperproductor de ß-lactamasa con halo de oxacilina de 17 mm: WHO-15 (CDC); y 5 aislamientos de 3 hospitales con halos entre 18 y 24 mm: M2840, M4067, M 4068, M4092 y M4200.
Cabe destacar que ninguna de las cepas con halos de inhibición entre 16 y 17 mm fueron mecA positivas.
Los porcentajes de sensibilidad, especificidad y correlación esencial fueron los siguientes: 97, 100 y 98 para el método de difusión por discos; 97, 95 y 97 para la CIM en medio sólido; 100, 100 y 100 para el screening de oxacilina y 100, 100 y 100 para el MRSA Screen-latex.
En el Cuadro 2, se detallan las características de los aislamientos en los cuales se encontraron discrepancias entre los métodos fenotípicos y la PCR del gen mecA. Dos de estas cepas, M2839 y CDC1, fueron cepas con sensibilidad borderline a oxacilina por los métodos de difusión por discos y CIM, 15 mm y 2 µg/ml, respectivamente, pero PCR positiva para mecA. En el tercer caso en el que se detectó discrepancia se trataba de una cepa en la que la PCR para el gen mecA fue negativa y la CIM en medio sólido dio 4 µg/ml, es decir resistente.

DISCUSION

Dentro de las técnicas fenotípicas para determinar meticilino-resistencia se puede mencionar el screening de oxacilina en agar Mueller Hinton con 6 mg/ml de oxacilina y 4% de NaCl, el método de difusión por discos, CIM por dilución, E-test y métodos automatizados como las tarjetas de Vitek GPS-SA y los paneles MicroScan Pos Combo 12. El screening de oxacilina constituye el método fenotípico de referencia para determinar resistencia a meticilina en cepas de S. aureus (4, 7, 11, 14, 15, 17).
Las metodologías mencionadas anteriormente, por lo general, tienen limitaciones en diferenciar entre resistencia heterogénea de grado 1 a meticilina y la falsa resistencia debida a hiperproducción de beta lactamasas, alteración en PLPs 1, 2 y 4, hiperproducción de PLP 4 o producción de meticilinasa (1, 3, 4, 10, 25, 26). En el caso de la falsa resistencia, no hay evidencias clínicas que sugieran su relación con fracasos terapéuticos y de hecho en diferentes estudios en modelos animales se demostró que el tratamiento con penicilinas resistentes a penicilinasas es efectivo contra estas cepas (3, 4, 23).
Por otro lado, el MRSA-Screen latex, es una nueva metodología, que se basa en una reacción de aglutinación que por medio de anticuerpos monoclonales detecta la presencia de la PLP2a, producto del gen mecA, en aislamientos de S. aureus. Sakoulas y col (20), estudiando el método de aglutinación MRSA-Screen latex, encontraron sobre 310 aislamientos clínicos de S. aureus que incluían 6 cepas borderline y 8 con susceptibilidad disminuida a oxacilina, una sensibilidad y especificidad del 100 y 99,1%, respectivamente; y en las tres cepas que dieron falsos positivos, se descubrió que en realidad eran una mezcla de cepas meticilino-sensibles y resistentes. Swenson y col (22), analizando 55 cepas de S. aureus (19 heterogéneas de grado 1 o 2 y 36 mecA negativas), hallaron una especificidad del 100% y una sensibilidad del 100% cuando la aglutinación era leída a los 6 y 15 min, y del 90% cuando era leída a los 3 min. En algunas cepas aisladas de un brote en Zurich en 1999, con bajo nivel de meticilino resistencia, la sensibilidad del MRSA-Screen latex fue del 93%, siendo necesaria la previa inducción con cefoxitina para alcanzar valores del 100% (18). Otros autores también han sugerido realizar inducción previa con oxacilina, aumentar el inóculo o el tiempo de aglutinación para mejorar la sensibilidad (17, 29, 30). Sin embargo, en varios trabajos coinciden en que la sensibilidad del método es ³ 97% (2, 13, 16, 27, 28, 30).
Analizando 100 aislamientos de S. aureus, 79 mecA positivos y 21 mecA negativos, nosotros pudimos observar una excelente sensibilidad, especificidad y correlación esencial en todos los métodos estudiados (en porcentaje): 97, 100 y 98 para el método de difusión por discos; 97, 95 y 97 para la CIM en medio sólido; 100, 100 y 100 para el screening de oxacilina y 100, 100 y 100 para MRSA Screen-latex.
A pesar de que la determinación de la presencia del gen mecA por hibridación de ADN o por PCR es considerada como el gold standard (4, 5, 8, 9, 17, 24) en la detección de meticilino-resistencia tanto en S. aureus como en estafilococos coagulasa negativa, la realización rutinaria en laboratorios clínicos es poco práctica y de alto costo. En el año 2002, la NCCLS (17) ha aceptado que la detección de la PLP2a es un método alternativo para la evaluación de meticilino-resistencia en Staphylococcus spp., el cual correlaciona con la presencia o ausencia del gen mecA. El kit MRSA-Screen latex fue diseñado para la detección de PLP2a en aislamientos de S. aureus. En nuestra experiencia, el MRSA-Screen latex ha funcionado eficientemente en la detección de meticilino-resistencia en S. aureus siguiendo las instrucciones del fabricante y no fue necesario prolongar el tiempo de lectura del látex, ni inducir previamente con cefoxitina u oxacilina; para aumentar la sensibilidad y especificidad del método. La necesidad de utilizar la alternativa de inducción para el aumento de la sensibilidad, hubiera traído aparejado como inconveniente el retardo de 24 h en la obtención de un resultado.
El uso del MRSA-Screen latex en estafilococos coagulasa negativa ha demostrado tener baja sensibilidad, pero ésta se podría mejorar incorporando al protocolo original modificaciones tales como: tiempo de lectura, tamaño del inóculo o induccion previa con oxacilina o cefoxitina (6, 12, 21).
A pesar que todos los métodos analizados en este estudio tuvieron una excelente sensibilidad y especificidad en la detección de meticilino-resistencia, el MRSA-Screen latex presentó una ventaja en lo que respecta al tiempo de detección, ya que se pudieron obtener resultados en sólo 15 min. El método de aglutinación MRSA-Screen latex fue fácil de realizar e interpretar y podría representar, en los casos que se justifique, una alternativa para laboratorios clínicos donde la PCR o la hibridación de ADN para el gen mecA no se encuentra disponible y donde la comunicación eficiente de estos resultados rápidos al cuerpo médico, podría ayudar al uso racional y acotado de los antibióticos glicopéptidos.

Agradecimientos: Agradecemos al Prof. Alexander Tomasz y Prof. Herminia De Lencastre del Laboratorio de Microbiología de The Rockefeller University, NY, EU., y al Dr. Fred Tenover del Centers for Diseases Control. (CDC), GA, EU., por la gentil donación de las cepas de referencia.

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Recibido: 28/08/03.
Revisado: 6/11/03.

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