Aumento de la actividad panificante de levaduras comerciales por aplicación de condiciones de estrés durante su propagación

M. A. Galvagno^*, P. Cerrutti

Depto. de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, UBA, Ciudad Universitaria, Pabellón de Industrias, 1428 Buenos Aires, Argentina.
^*Correspondencia. E-mail: mag@di.fcen.uba.ar

RESUMEN
La actividad panificante valorada como producción de CO₂ de dos cepas comerciales de Saccharomyces cerevisiae pudo ser incrementada, principalmente en amasijos azucarados, por la aplicación de un esquema de "hambreado/ pulso» de melaza de caña de azúcar durante su propagación bajo la forma de lote alimentado. Dicho incremento fue dependiente de la cepa utilizada. Otras características relacionadas con el comportamiento industrial de las levaduras no se vieron afectadas, con excepción de la concentración intracelular de trehalosa.Se discute la aplicabilidad del método para la producción industrial de levaduras de panificación.
Palabras clave: levadura de panadería, actividad panificante, hambreado/pulsos de melaza.

SUMMERY
Increase of baking activity of commercial yeasts by application of stress conditions during their propagation. Baking activity determined as CO₂ production of two commercial strains of Saccharomyces cerevisiae could be increased mainly in sweet bread doughs by introducing a "starvation/ pulse feeding" schedule of sugar cane molasses during a fed-batch propagation . Such increase was strain dependent. Except for the trehalose intracellular level, other traits related to the yeast industrial performance were unaffected. Applicability of method for baker's yeast industrial production is discussed.
Key words: baker's yeast, baking activity, starvation/pulses of molasses.

INTRODUCCIÓN

Las levaduras de panificación, principalmente cepas de Saccharomyces cerevisiae, se encuentran sometidas a múltiples condiciones de estrés en forma secuencial, tanto durante el proceso productivo como durante su procesamiento "aguas abajo" y su utilización comercial. Entre las situaciones de estrés que enfrenta la levadura de panificación se pueden mencionar las temperaturas superiores e inferiores a las óptimas, oxidación, hiperos-molaridad, desecación/rehidratación, congelado/descongelado, etc (1). El hambreado de nutrientes, principalmente de la fuente de carbono, es un tipo de estrés que los microorganismos enfrentan generalmente en condiciones fisiológicas normales en cualquier tipo de ambiente, incluyendo aquéllos que encuentran durante sus aplicaciones industriales. La habilidad de una cepa de levadura para adaptarse a las distintas condiciones ambientales adversas para su crecimiento condiciona su utilidad y aplicabilidad industrial (2). De las diferentes situaciones de estrés subletales que encuentra la levadura, aquéllas que enfrenta durante su proceso de propagación pueden pre-adaptar al microrganismo para soportar las posteriores situaciones durante su utilización en el producto panificado.
El fenómeno por el cual una levadura sometida a un tipo de estrés subletal se hace tolerante al mismo o a otro tipo de estrés más severo, es conocido como tolerancia cruzada o co-tolerancia, y ya ha sido descripto en S. cerevisiae (4, 14, 18, 19). Esta relación aparente entre distintos tipos de estrés, puede implicar que exista alguna similitud en cuanto a su mecanismo de acción, tanto en el tipo de daño causado por los mismos, como en los mecanismos para proteger a las células de ellos, o los mecanismos para reparar los daños producidos (9).
El disacárido no reductor trehalosa ha sido señalado como un protector celular cuya síntesis se induce normalmente al entrar las células en fase estacionaria del crecimiento, y contribuye a la sobrervivencia de la levadura durante situaciones de estrés ambiental (16, 17). Más aún, los genes que codifican para el complejo trehalosa-sintetasa se inducen por estrés (6, 22).
El objetivo de este trabajo fue lograr el acondicionamiento fisiológico de cepas de S. cerevisiae para incrementar su actividad panificante (producción de CO₂). Para ello, dos cepas comerciales de levaduras habitualmente usadas en productos panificados fueron sometidas a condiciones de estrés durante el proceso de propagación de la biomasa en forma de lote alimentado, mediante el empleo de un esquema hambreado/ pulsos (h/p) de mosto de melaza de caña de azúcar.

MATERIALES Y METODOS

Cepas utilizadas
Se trabajó con dos cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas originalmente como cultivos axénicos a partir de sendos productos comerciales, indicadas para su utilización en productos panificados con alto contenido de azúcar (cepa A), y sin azúcar agregada exógenamente (cepa B).

Producción de las levaduras a escala sub-piloto
Todas las operaciones fueron realizadas en condiciones de esterilidad.
El desarrollo de las cepas de levadura se llevó a cabo simulando los diferentes estadíos de producción de la propagación industrial de la levadura de panificación.
I- Preparación del inóculo: las cepas fueron propagadas como cultivos en lote a 28 °C sin aireación, con agitación provista por un agitador de movimiento orbital excéntrico (120 rpm), en etapas sucesivas, comenzando con un volumen de 10 ml. En cada una de las etapas posteriores, se fue trasegando el cultivo previo a frascos Erlenmeyer conteniendo aproximadamente 5 a 10 veces el volumen del cultivo anterior. La fuente carbonada utilizada fue melaza de caña de azúcar, conteniendo 48,2 % p/p de azúcares fermentescibles, según informaciones del proveedor. El medio de cultivo utilizado (adaptado de un medio de propagación industrial) contenía por litro: 170 g de melaza; 12,8 g de (NH4)2SO4,; 0,9 g de KH2PO4; 0,3 g de MgSO4.7H2O; 0,1 g Zn SO4. 7H2O; 30 mg de Fe SO4 .7H2O; 10 mg de CuSO4.5H2O; 20 mg de MnSO4. H2O; 0,4 mg de pantotenato de Ca y 0,4 mg de clorhidrato de tiamina. El pH se ajustó a 5,5-5,7 unidades. El período de incubación de cada etapa fue de aproximadamente 24 h, y el número de etapas se extendió hasta alcanzar la cantidad de biomasa requerida para inocular la fermentación lote alimentado.
II- Producción de levadura mediante un cultivo lote alimentado: Tratamiento control: Para el desarrollo del cultivo lote alimentado se utilizó como fuente carbonada melaza de caña de azúcar. Previamente a ser incorporada al medio, la melaza se diluyó al 60% p/v utilizando agua de canilla. El pH de esta solución se ajustó a 4,0- 5,0 con H2SO4 (50% v/v) y se calentó a 80 °C durante 45 min. Luego se enfrió a temperatura ambiente y se centrifugó a 6.800 x g durante 20 min. El sobrenadante se esterilizó a 118 °C durante 20 min, constituyendo así el mosto de melaza (MMz). En el volumen inicial del fermentador de 7,0 l se agregaron 87 g de melaza, 230 g de (NH4)2SO4 g; 25,4 g de KH2PO4; 3,5 g MgSO4.7H2O; 1,1 g de Zn SO4. 7 H2O y 40 mg de pantotenato de Ca. El fermentador se inoculó con 134 g de materia seca de levadura de cada cepa estudiada.
Para el esquema de alimentación de lote alimentado de melaza se adoptó el protocolo propuesto por White (20), levemente modificado para 15 h de fermentación. Durante la hora 15 no se suministró MMZ al cultivo (maduración). El volumen de MMz agregado incrementalmente fue de 3,6 l. La cantidad total de melaza agregada al fermentador durante la propagación fue de 2,2 kg. Durante la fermentación, el pH se mantuvo entre 5,0-6,0 ± 0,1 unidades ( 0 a 7 h) y entre 6,0-6,3 ± 0,1 unidades (8 a 15 h) y se ajustó manualmente a los valores establecidos utilizando una solución de H2SO4 (50 % v/v) o de Na₂CO₃ (20 % p/v) cuando fue necesario. La temperatura se mantuvo entre 30-32 °C entre las 0-7 h y entre 33-34 °C entre las 8-14 h. En la hora de maduración la temperatura fue de 32 °C. El oxígeno se suministró bajo la forma de aire comprimido y se distribuyó mediante un agitador de turbina a disco. La concentración de oxígeno disuelto se midió con un electrodo Broadley James. La aireación y la agitación se modificaron entre 8 y 16 l/min y entre 300-800 rpm respectivamente durante la fermentación, para mantener la concentración de etanol en el medio de cultivo dentro de los valores fijados: 0,15-0,20 % (v/v) al comienzo de la fermentación, disminuyéndose gradualmente hasta alcanzar valores de 0,01-0,02 % al final de la misma.
La concentración de etanol en el fermentador fue determinada off-line en alícuotas representativas de medio de cultivo, previa separación de las células por centrifugación. Para ello se utilizó un cromatógrafo gaseoso Gow-Mac Serie 582 (Gow-Mac Instruments Co. NJ EEUU) con una columna de acero inoxidable de 6" x 1/8" rellena con Poropack Q 8/100 mesh, provisto de un detector de ionización de llama y un Integrador Gow-Mac, modelo 70-3395. La producción de espuma se controló por el agregado de antiespumante siliconado comercial.
El equipo de fermentación utilizado fue un fermentador New Brunswick Modelo Labroferm Modelo FS-307 del tipo Reactor de Tanque Agitado con vasos de vidrio Pyrex de 14 l de volumen total, con sistema de monitoreo on line de temperatura, oxígeno disuelto y pH. El programa de monitoreo utilizado fue el sistema FerMicro versión 1.0 /1999 (15).

Tratamiento de hambreado/pulso
Se llevaron a cabo fermentaciones paralelas bajo condiciones de fermentación idénticas a las del tratamiento control, excepto que entre las horas 11º y 14º el MMz no se añadió en forma incremental sino en forma de "pulsos". Para ello se dividió en dos partes iguales la cantidad de MMz a agregar en la hora correspondiente (de la fermentación control) y cada mitad de mosto se agregó en 15 min. Previamente a estos "pulsos" de mosto, se establecieron 15 min de "hambreado" de melaza. El esquema de la alimentación de melaza para las horas 11°a 14° fue: hambreado (15 min); 50%Mz (15 min); hambreado (15 min); 50%Mz (15 min).
Durante el tratamiento de los pulsos, los parámetros de la fermentación (pH, temperatura y concentración de etanol), se mantuvieron experimentalmente dentro de los valores establecidos para el esquema de fermentación control.

Análisis de las levaduras obtenidas
Separación de la biomasa: Al final de la fermentación (hora 15), la biomasa de las levaduras de ambos tratamientos se separaró del medio remanente por centrifugación. La biomasa se lavó por suspensión y centrifugación con agua de canilla. La suspensión celular obtenida finalmente se filtró al vacío a través de papel de filtro Schleicher & Schuell 595 banda negra durante 45-90 min. Sobre la biomasa obtenida se realizó la valoración de materia seca, concentración de proteína, P2O5 y trehalosa (ver abajo) y se realizaron los ensayos de actividad panificante.
Parámetros analíticos: La materia seca se obtuvo luego de secar una cantidad de aproximadamente dos gramos de la biomasa de levadura obtenida a 105 °C hasta peso constante.
Se procesaron inmediatamente alícuotas de la biomasa para la valoración de nitrógeno, P2O5 y trehalosa. La proteína total se determinó por el método de Kjeldhal, multiplicando el valor de nitrógeno total por 6,25. El P2O5 se determinó por espectrofotometría a 420 nm de la muestra (previamente digerida) por reacción de la misma con molibdato de amonio, hidroquinona y bisulfito de sodio. La extracción de la trehalosa se llevó a cabo con ácido tricloroacético 0,5 M y el contenido intracelular de la misma se estimó por el método de la antrona descripto por Lewis y col (8). Las concentraciones intracelulares de proteína, P2O5 y de trehalosa se expresaron como % p/p de materia celular seca.
Actividad panificante: La actividad panificante de la levadura se ensayó utilizando las fórmulas propuestas por Myers y col (11) para amasijos no azucarados y para amasijos con 16 % modificado para 18% de azúcar. La producción de CO2 se valoró por medición del desplazamiento de la columna de una solución indicadora (10 mg de rojo de metilo y 5 mg de azul de metileno en 10 ml de etanol, llevados a 1 l con H2SO4 0,01 N), a 30 °C. Los resultados se expresaron como ml de CO2 acumulados al cabo de 1 h y de 2 h, corregidos por la presión atmosférica y normalizados por materia seca y contenido de nitrógeno de la levadura (actividad específica). Todos los amasijos se ensayaron al menos por duplicado siendo el error entre duplicados £ 1%.
Se estudió además la conservación de la actividad panificante de las levaduras al cabo de 21 días de almacenamiento a 4°C.

Análisis estadístico
La evaluación de las respuestas de las levaduras sometidas a los tratamientos de h/p y control, se realizó mediante ANOVA de un factor con un nivel de p< 0,05 mediante el uso del paquete de programas estadísticos "Statistica", Versión 98.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Rendimientos de las fermentaciones y análisis de la levaduras
Se analizaron los parámetros considerados habitualmente en la industria de la levadura de panificación, tanto para evaluar el comportamiento de las fermentaciones industriales del tipo lote alimentado como las características analíticas de la levaduras obtenidas, luego de los dos tratamientos considerados (control y h/p). En primer lugar, se observó que no hubo diferencias significativas entre las velocidades específicas de crecimiento (m estimada al final del período de fermentación), las que alcanzaron valores de alrededor de 0,13 h-1 para ambos tratamientos. En el Cuadro 1 se resumen los valores de los parámetros analíticos estudiados para la cepa A, luego de los tratamientos mencionados. Se observa que no hubo diferencias en los rendimientos "comerciales", estimados como biomasa de levadura prensada con 30% de materia seca / masa de melaza utilizada. En este sentido, hay que destacar que fue posible obtener los mismos rendimientos cuando la alimentación de la melaza se produjo según el esquema propuesto de h/p o en forma incremental (control). En cuanto al análisis de la biomasa de la levadura obtenida, los valores de materia seca, contenido proteico y contenido de fósforo (expresado como P2O5), no difirieron significativamente entre ambos tratamientos. Sin embargo, los niveles intracelu-lares de trehalosa resultaron significativamente superiores (p<0,05) para la levadura obtenida de la fermentación al aplicarse el h/p.

Similarmente a lo ocurrido con la cepa A, al comparar las velocidades de crecimiento específicas de la cepa osmosensible B obtenidas (0,13 h^-1 para ambos tratamientos), los rendimientos de las fermentaciones y la mayoría de los parámetros analíticos, no se observaron diferencias significativas. En el Cuadro 2 se muestran los valores de dichos parámetros. Nuevamente, para esta cepa los valores de la concentración de trehalosa intracelular fueron mayores para las levaduras obtenidas del tratamiento h/p.

Este aumento puede atribuirse a las sucesivas etapas de hambreado /pulso de melaza durante el tratamiento h/p en ambas cepas, ya que se sabe que S. cerevisiae sintetiza este disácarido luego de estar sometida a distintos tipos de estrés (3, 5, 13, 17). Las diferencias cuantitativas en la acumulación de trehalosa entre ambas cepas pueden atribuirse a las características genotípicas de las mismas, ya que fueron desarrolladas para distintos tipos de productos comerciales: amasijos azucarados hasta 50 g de azúcar/ 100 g de harina (cepa A), y no azucarados (cepa B).
De acuerdo a los resultados obtenidos se puede decir que excepto por el incremento de los niveles intracelu-lares de trehalosa hallado para ambas cepas luego del tratamiento h/p, las otras características que hacen al comportamiento industrial de las levaduras de panifica-ción, tanto en relación con la economía del proceso productivo como a las características analíticas de las levaduras, no se vieron significativamente afectadas.

Actividad panificante de las levaduras obtenidas
Para estimar la calidad panificante de las levaduras obtenidas, se evaluó la capacidad de producir CO2 en una masa de panificación no azucarada exógenamente y en una masa adicionada con 18% de sacarosa comercial, valor característico de los tipos de productos panificados presentes en el mercado local. Las determinaciones se efectuaron en la "torta de levadura" obtenida inmediatamente al final de las fermentaciones. Los datos se muestran en la Figuras 1 y 2, donde los valores de producción de CO2 se expresan como actividad específica (ver Materiales y Métodos) que es una forma de evaluar la actividad panificante independientemente de la materia seca y contenido proteico de la levadura, ya que estos pueden ser modificados experimentalmente durante la producción de biomasa.
Se observó en general una mayor actividad específica para ambos tipos de amasijo en los cultivos sujetos al esquema de h/p. En el caso de amasijos no azucarados, esta diferencia fue estadísticamente significativa para la cepa A tanto para 1 h como al cabo de 2 h de fermentación del amasijo (p< 0,05), como se observa en la Figura 1 para 0% azúcar.

Como se observa en la Figura 2 para 0% de azúcar agregada al amasijo, la actividad panificante de la cepa B sometida al tratamiento h/p y control respectivamente no presentó diferencias significativas.

Sin embargo, el aumento de la actividad específica cuando se aplicó el tratamiento h/p fue más pronunciado en el caso de la masa azucarada para ambas cepas y para los dos tiempos de fermentación considerados. Por otra parte, teniendo en cuenta los valores de p obtenidos, este aumento fue más significativo para la primera hora de panificación, que es el período de tiempo en el cual la levadura confronta el mayor estrés hiperosmótico, dado que se postula que estos microorganismos no serían capaces de adaptarse fisiológicamente tan rápidamente a cambios bruscos en el medio, por ejemplo, por síntesis inmediata de solutos osmóticamente compatibles (23). Estos resultados se pueden relacionar con el aumento en los niveles de trehalosa que se hallaron en la biomasa de las levaduras sometidas al tratamiento h/p. El contenido de trehalosa, uno de los principales carbohidratos de reserva que se hallan en las células de las levaduras, se correlaciona habitualmente con la protección ante condiciones de estrés (12, 13, 16, 21). De hecho, la presencia de altos niveles de trehalosa guarda una estrecha relación con la inducción general de los factores de tolerancia al estrés (1).
En este trabajo, se observó una diferencia de comportamiento entre ambas cepas luego de los tratamientos en relación a la actividad fermentativa y a los niveles de trehalosa medidos (que no necesariamente guardan entre sí una correlación lineal). En el caso de la cepa A, la trehalosa pareció actuar como protector ante situaciones de estrés que implican pérdida de agua intracelular, como fue reportado en un medio hiperosmótico para S. cerevisiae (7, 10, 12) y como indicador general de la robustez de la levadura, ya que se observó una diferencia significativa en la actividad panificante de la levadura sometida al tratamiento h/p en amasijos con 0 y 18% de sacarosa (Figura 1). En el caso de la cepa B (osmosen-sible), sólo actuaría como osmoprotector, dado que únicamente se encontró una diferencia estadísticamente significativa de la actividad panificante a favor de la levadura sometida al tratamiento h/p en amasijos azucarados (Figura 2). En esta cepa, además, los resultados de actividad se pudieron diferenciar según el contenido celular de proteína de la biomasa obtenida, determinada por las condiciones experimentales. Así, para valores altos de la misma (50-52%), no hubo diferencias en la actividad fermentativa de las levaduras de ambos tratamientos (datos no mostrados). Esta alta concentración proteica podría producir "per se" una mayor actividad fermentativa independientemente del tipo de tratamiento al que fuera sometida la cepa osmosensible.
Los valores correspondientes a la conservación de la actividad panificante (21 días de almacenamiento a 4°C) determinados al cabo de 1 h de incubación, fueron superiores para el tratamiento h/p respecto del control sólo en el caso del amasijo con 18% azúcar. Así, la cepa A conservó el 82 % (h/p) vs 75% (control) de la actividad inicial y la cepa B el 100 (h/p) % vs 77 % (control) respectivamente. Estos resultados nuevamente sugieren el rol general desempeñado por la trehalosa en la tolerancia al estrés.
Es de destacar que en algunas fermentaciones con la cepa B se invirtió el orden del tratamiento (pulso/hambreado/pulso/hambreado o "p/h"), y los resultados obtenidos fueron similares a los obtenidos con el esquema h/p).Los resultados presentados en este trabajo, muestran que existió protección cruzada (co-tolerancia) entre distintos tipos de estrés, ya que al someter a la levadura a una condición sub-letal (tratamiento h/p de melaza durante la propagación bajo la forma de lote alimentado), fue posible acondicionar a la levadura para enfrentar otro tipo de estrés, como en este caso fue el hiperosmótico. Además en este acondicionamiento, la trehalosa desempeñaría un rol de protector general ante situaciones de estrés (cepa A en amasijos no azucarados).
El aumento de la actividad fermentativa general hallado en la cepa A, indicaría que con la aplicación del tratamiento h/p sería posible el ahorro de sustrato, principalmente de fuente nitrogenada, que guarda una relación directa con la promoción de la actividad panificante de las levaduras.
La importancia biotecnológica de estos resultados radica en la posibilidad de adaptar fisiológicamente, por manipuleo del protocolo de crecimiento, cepas de levadura de panificación para distintas condiciones de utilización en productos comerciales. Desde el punto de vista de la logística de la producción, esto posibilita la obtención de productos diferenciados mediante el manipuleo de un número reducido de cepas en planta, ya que por ejemplo, podría mejorarse el desempeño de una cepa en un producto azucarado sin que genotípica-mente esté adaptada para ello.

Agradecimientos: A CALSA (Grupo Burns Philp) por la donación de la melaza de caña. Al Lic Leopoldo Iannone por su contribución a los análisis estadísticos. M. A. G. es Investigador Independiente de CONICET.

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Recibido: 28/08/03.
Revisado: 6/11/03.