Técnicas de purificación y ruptura de quistes de Giardia spp

D. Polverino¹, N.B. Molina¹, M.C. Minvielle¹, M.E. Lozano², J.A. Basualdo^1*

¹Cátedra de Microbiología y Parasitología, Fac. de Cs. Médicas, Universidad Nacional de La Plata, Av 60 y 120 s/n, 1900 La Plata, Buenos Aires, ²Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Departamento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Sáenz Peña 180, Bernal (1876), Buenos Aires
*Correspondencia. E-mail: jabasua@atlas.med.unlp.edu.ar

RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue optimizar y evaluar las técnicas de purificación, aislamiento y ruptura de quistes de Giardia spp a partir de heces formoladas para la obtención de ADN. La materia fecal filtrada fue sometida a 3 técnicas de purificación, utilizando soluciones de formol-éter, sacarosa y formol-éter más sacarosa. La solución de sacarosa permitió aislar los quistes con menos detritos. Los quistes purificados fueron tratados con 3 técnicas para la ruptura de los mismos: shock osmótico y calor, degradación química y shock térmico, acción enzimática y efecto mecánico. Solamente con la técnica de shock térmico, acción enzimática y efecto mecánico se observaron bandas fluorescentes en geles de agarosa. Los resultados de este trabajo permiten contar con una metodología de rutina, simple, que podría ser usada en los pasos previos a la técnica de PCR para la genotipificación de este parásito.
Palabras claves: quistes Giardia, purificación, ruptura.

SUMMARY
Purification and breaking techniques of cysts of Giardia spp. The purpose of this study was to optimize and evaluate the purification techniques, isolation and breaking of cysts of Giardia spp from fecal samples to isolate DNA. Filtrated fecal samples were tested in 3 purification techniques: Telleman solution, sucrose and Telleman plus sucrose. The sucrose solution let us to isolate the cysts with less detritus. The cleaned cysts were splited in 3 techniques to test the breaking: osmotic shock and heat, chemistry degradation and thermic shock, enzymatic action and mechanic effect. Only the last method was successful and showed bands in agarose gel. The result of this study shows a routine and common method which could be used in the previous steps to the PCR technique for the genotypification of these parasites.
Key words: cysts Giardia, purification, breaking.

INTRODUCCIÓN

Los métodos usuales en la detección de Giardia spp están basados en el reconocimiento visual por microscopía óptica de trofozoítos o quistes, teñidos o no (2). Las muestras fecales seriadas deben recolectarse en días alternados debido a la periodicidad en la excreción de quistes, (6, 9). El diagnóstico de giardiosis por microscopía óptica prolonga el tiempo de búsqueda, requiere de personal capacitado, su sensibilidad es moderada y no permite detectar variables de genotipos (2).
Diversas soluciones de sacarosa y de sulfato de zinc han sido tradicionalmente usadas para concentrar quistes de Giardia spp (3). Ninguna de estas técnicas separan completamente los quistes de la materia fecal y detritos bacterianos, pero ayudan a concentrar el número de los mismos (12). El empleo de técnicas inmunológicas como Elisa o imnunofluorescencia directa, e incluso técnicas de biología molecular han sido recomendadas para lograr un diagnóstico más confiable de giardiosis (7). Para la obtención del ADN se han realizado cultivos de trofozoítos en medio axénico (13), otros lo han extraido a partir de la degradación química, enzimática o mecánica de la pared de los quistes (12).
El objetivo de este trabajo fue optimizar y evaluar las técnicas de purificación, aislamiento yruptura de quistes de Giardia spp a partir de heces formoladas para la obtención de ADN.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron 10 muestras de materia fecal de humanos y perros en formol al 10%. Todas fueron diagnosticadas como positivas para Giardia spp al microscopio óptico. Se almacenaron a temperatura ambiente hasta su procesamiento.

Aislamiento y purificación de quistes
Treinta mililitros de materia fecal filtrada a través de gasas se dispensaron en 3 alicuotas, las cuales fueron centrifugadas durante 5 min a 1500 rpm. Los sobrenadantes se descartaron y los pellet fueron tratados por 3 técnicas distintas.
Técnica 1. El pellet se resuspendió hasta las ¾ partes de un tubo de centrífuga de 15 ml en la solución de Telemann (formol 40% 50 ml, NaCl 5 g, agua destilada 950 ml) (6) con 2 ml de éter. La mezcla fue centrifugada durante 5 min a 1500 rpm. El sobrenadante se descartó y el pellet fue llevado a un volumen de 0,5 ml con solución salina fosfatada (PBS: NaCl 4 g, KCl 0,10 g, Na2HPO40,39 g, KH2PO40,10 g, H2O 500 ml, pH 7,2).
Técnica 2. Al pellet se agregó 5 ml de PBS y se centrifugó 5 min a 1500 rpm. Luego se agregaron 3 ml de PBS, se resuspendió por vortex y por las paredes se volcaron 4 ml de solución de sacarosa (densidad 1,275). Se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min. Se aspiraron la fase sacarosa y el pellet con pipeta Pasteur, se trasvasaron a otro tubo al que se le agregaron 2 volúmenes de PBS. Los quistes se concentraron por centrifugación a 2000 rpm durante 5 min. El sedimento fue resuspendido con PBS en un volumen final de 0,5 ml y almacenado a 4 ºC para su posterior uso.
Técnica 3. Se realizó la técnica 1 y al pellet resultante se le aplicó la técnica 2.
El número de quiste iniciales y finales fue cuantificado mediante el recuento en cámara de Neubauer al microscopio óptico. Los datos fueron analizados estadísticamente mediante el test de Kruskal-Wallis.
Se clasificó la turbidez de las muestras con los quistes purificados en base al porcentaje de detritos encontrados en un campo óptico, como limpio (< 25%), ligeramente turbio (25-75%) y turbio (75-100%).

Ruptura de los quistes
El número de quistes iniciales sometidos a ruptura fueron los obtenidos mediante purificación con sacarosa. Se probaron 3 técnicas
a. Técnica de shock osmótico y calor (14). A las muestras de quistes purificados se les incorporó NaCl 2,5 M y se los sometió a ebullición durante 15 min.
b. Técnica de la degradación química. A los quistes purificados se les agregó HCl 1 N y se incubó a 37 ºC durante 1 h. Luego se realizaron 2 lavados con PBS y se centrifugó a 11000 rpm durante 5 min. Al pellet se agregó 300 µl de tripsina (0,05%, 1/250)- EDTA (0,02%) pH 7,9 y la mezcla se incubó a 37 ºC durante 24 h. A continuación se agregó 2-mercaptoetanol 0,5 M y luego de 30 min a 37 ºC la muestra se reservó para la extracción de ADN.
c. Técnica de shock térmico, acción enzimática y efecto mecánico. Los quistes purificados se sometieron a 3, 4, 5 y 6 ciclos de enfriamiento (&–80 ºC 30 min) y calentamiento (+80 ºC 30 min) y posterior ebullición (100 ºC 15 min) (10). Luego se incubaron con Proteinasa K (1 mg/ml, 60 ºC 24 h). A continuación se trituraron mecánicamente con lana de vidrio estéril en un homogeneizador. El homogenato se incubó en un buffer de lisis (NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M, SDS 0,5%, pH 7-8) a 37 ºC por 24 h (5).
Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado. La evaluación de la ruptura se realizó por recuento de los quistes en cámara de Neubauer antes y después de cada tratamiento. Posteriormente, se realizó la extracción del ADN para comprobar el rendimiento.

Extracción de ADN
El ADN fue purificado por métodos tradicionales (11). La muestra fue extraída con una mezcla de solventes orgánicos (fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, 25:24:1), la fase acuosa se recuperó por centrifugación a 11000 rpm durante 10 min y se le agregó 2 volúmenes de etanol absoluto en presencia de acetato de sodio 0,3 M a pH 5,2. El pellet conteniendo el ADN, se obtuvo después de una centrifugación a 11000 rpm durante 30 min y fue lavado con etanol 70%. Se dejó secar a temperatura ambiente y se resuspendió en 30 µl de buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM). Se almacenó a &–20 ºC para su posterior análisis electroforético.

Electroforesis
La electroforesis se realizó en gel de agarosa de bajo punto de fusión 1% a 80 voltios durante 30 min en buffer TAE (40 mM Tris-acetato pH 8, 1 mM EDTA). El gel se tiñó con 0,5 µg/ml de bromuro de etidio. Se corrieron 15 µl de cada muestra. Las bandas de ADN se observaron en una fuente de luz ultravioleta y se clasificó subjetivamente como de alta, mediana, baja o nula intensidad.

RESULTADOS

Aislamiento y purificación de quistes
Los recuentos iniciales fueron muy variables, desde 10 hasta 618 quistes/mm3. Los recuentos finales de los quistes purificados tuvieron un rango de 10 a 875, 5 a 1355 y 3 a 440 quistes/mm3para las técnicas 1, 2 y 3 respectivamente. Los porcentajes de concentración y su relación con la turbidez se muestran en la Tabla 1.

El análisis de la varianza aplicado a la comparación de las tres técnicas de aislamiento y purificación de quistes reveló que no hubo diferencias significativas entre ellas (Kruzkal-Wallis H, 2 g.l. = 1,35, P = 5,99).
Las técnicas 2 y 3 fueron las que dejaron menos detritos en los quistes purificados (Figura 1).

Ruptura de los quistes, extracción de ADN y electroforesis
En la técnica de shock osmótico y calor, al igual que en la técnica de degradación química, se contaron igual número de quistes antes y después de cada tratamiento (promedio de quistes iniciales = 21,66 y promedio de quistes finales = 21,33 para ambos tratamientos). En ambos casos, no se observó fluorescencia en la electroforesis.
En la técnica de shock térmico, acción enzimática y efecto mecánico no se encontraron quistes después del tratamiento (promedio de quistes iniciales = 21,66 y recuento final = 0). Se observó fluorescencia de igual intensidad en todos los ciclos de shock térmico propuestos (Figura 2).

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se logró optimizar y simplificar una técnica de purificación de quistes de Giardia spp a partir de materia fecal formolada. Los quistes fueron aislados utilizando filtraciones y centrifugaciones diferenciales con PBS y sacarosa.
Basso y colaboradores (4) recomiendan la preferencia de las muestras sin formol a las formoladas y en el caso de los exámenes seriados incluir por lo menos una muestra en fresco. Esta situación en nuestro medio es infrecuente, pues la mayoría de las muestras de materia fecal para análisis coproparasitario son remitidas en formol al 5 o al 10%. Estos investigadores además sostienen que la técnica de formol-éter (Telemann) es más eficiente para la detección de quistes de Giardia spp. Sin embargo, en las 3 técnicas empleadas en nuestro estudio no se encuentran diferencias significativas. En el presente trabajo, el pellet de la técnica de formol-eter fue el que presentó mayor turbiedad por campo óptico. Con las otras técnicas los quistes quedaron más limpios. Por consiguiente se eligió la técnica de sacarosa por su simplicidad y menor tiempo de procesamiento.
La densidad de sacarosa utilizada para la concentración de los quistes de Giardia spp coincide con los rangos recomendados en la bibliografía para muestras de agua (8) y muestras clínicas (4); ésto es 1,10 y 1,30 respectivamente.
La eficiencia de recuperación de los quistes fue variable, esto podría deberse a una diferente carga parasitaria inicial o a pérdidas inherentes a la técnica. No obstante los quistes resultaron libres de detritos.
El desenquistamiento de Giardia spp en hospedadores mamíferos ocurre con la exposición en el intestino delgado de enzimas pancreáticas luego del pasaje en medio ácido (1). Tales condiciones fueron recreadas en la técnica de la degradación química, aunque no se observaron variaciones en el número de quistes, ni fluorescencia en los geles de agarosa.
A diferencia de lo publicado por van Keulen y colaboradores (13, 14), los quistes no se pudieron romper cuando se los sometió a ebullición con NaCl 2,5 M durante15 min.
Las mejores condiciones de trabajo para la ruptura de los quistes se obtuvieron con la técnica de shock térmico, acción enzimática y efecto mecánico; donde se evidenciaron las bandas de ADN en los geles de agarosa. En la bibliografía consultada no se han encontrado protocolos que utilicen el conjunto de esta metodología. Si bien resultados exitosos fueron publicados realizando sólo los ciclos de enfriamiento y calentamiento (10), o la incubación en buffer de lisis (5), nosotros no obtuvimos resultados semejantes.
Los resultados de este trabajo permiten contar con una metodología de rutina, simple, que podría ser usada en los pasos previos a la técnica de PCR para la genotipificación de este parásito.

BIBLIOGRAFÍA

1. Adam RD (2001) Biology of Giardia lamblia. Clin. Microbiol. Rev. 14: 447-475.         [ Links ]
2. Amar CFL, Dear PH, Pedraza-Díaz S, Looker N, Linnane E, McLauchlin J (2002) Sensitive PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Assay for Detection and Genotyping of Giardia duodenalis in Human Feces. J. Clin. Microbiol. 40: 446-452.         [ Links ]
3. Barr CS, Bowman DD (1994) Giardiasis. Selecciones veteri-narias Virtual 3 (1). http://www.seleccionesveterinarias.com/articulos/art3_1.htm         [ Links ]
4. Basso WU, Venturini L, Risso MA (1998) Parasitol. Día. 22: 52-56.         [ Links ]
5. Eligio García L, Galván SC, Jiménez Cardoso E (2002) Distancia filogenético de aislados de Giardia intestinalis de niños sintomáticos y asintomáticos. Rev. Invest. Clin. 54: 113-118.         [ Links ]
6. Feldman RE, Guardis M (1990) Diagnóstico coproparasi-tológico. Fundamentos, normas, metodología, bioseguridad, control de calidad. Nueva guía práctica. Federación Bioquí-mica de la Provincia de Buenos Aires, La Plata. 18-22.         [ Links ]
7. Leber AL, Novak SM (1999) Intestinal and Urogeni-tal Amebae, Flagelates and Ciliates. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, Manual of Clini-cal Microbiology 7th ed, ASM Press Washington DC,1391-1405.         [ Links ]
8. LeChevallier MW, Norton WD, Siegel JE, Abbaszadegan M (1995) Evaluation of Inmunofluorescence Procedure for Detection of Giardia Cysts and Cryptosporidium Oocysts in Water. Appl. Environ. Microbiol. 61: 690-697.         [ Links ]
9. McGlade TR, Robertson ID, Elliot AD, Thompson RCA (2003) High Prevalence of Giardia detected in cats by PCR. Vet. Parasitol. 110: 197-205.         [ Links ]
10. Rimhanen-Finne R, Hörman A, Ronkainen P, Hänninen ML (2002) An IC-PCR method for detection of Cryptosporidium and Giardia in natural surface waters in Finland. J. Microbiol. Methods. 50: 299-303.         [ Links ]
11. Sambrook J, Russell D (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3er ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.         [ Links ]
12. Upton SJ (1997) In vitro cultivation. En: Fayer R (Ed), Cryptosporidium and Cryptosporidiosis, CRC Press, Inc., 181-207.         [ Links ]
13. van Keulen H, Campbell SR, Erlandsen SL, Jarroll EL (1991) Cloning and restriction enzyme mapping of ribosomal DNA of Giardia duodenalis, Giardia ardeae and Giardia muris. Mol. Biochem. Parasitol. 46: 275-284.         [ Links ]
14. van Keulen H, Macechko PT, Wade S, Schaaf S, Wallis PM, Erlandsen SL (2002) Presence of human Giardia in domestic, farm and wild animals, and environmental samples suggests a zoonotic potential for giardiasis. Vet. Parasitol. 108: 97-107.        [ Links ]

Recibido: 03/03/04
Revisado: 09/08/04