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Revista argentina de microbiología

versión impresa ISSN 0325-7541versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.36 n.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jul./sep. 2004

 

Evaluación de la reacción en cadena de la polimerasa para el diagnóstico de la brucelosis en un rebaño lechero infectado con Brucellaspp.

O. Lavaroni1, N. Aguirre2, V. Vanzini2, C. Lugaresi2, S. Torioni De Echaide2*

1Facultad de Ciencias Veterinarias. Cátedra de Inmunología. Kreder 2805. 3080 Esperanza, Santa Fe, Argentina,
2INTA, Estación Experimental Agropecuaria. Ruta 34 km 227, 2300 Rafaela, Santa Fe, Argentina
*Correspondencia. E-mail: sechaide@rafaela.inta.gov.ar

RESUMEN
Para el diagnóstico de la brucelosis bovina en muestras de sangre y/o leche, se comparó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el aislamiento in vitro de Brucella abortus, las pruebas serológicas defijación del complemento (FC) e inmunoenzimáticas de competición (ELISA-C) en suero e indirecto (ELISA-I) en leche. Se analizaron muestras de vacas lecheras de un rebaño infectado “A”, vacunadas con B. abortus cepa 19 antes de los 8 meses de edad y revacunadas con B. abortus cepa RB51 como adultas (n= 99) y de otro “B”, libre de brucelosis (n=100), como control. En A, la PCR identificó 14 vacas infectadas con B. abortus: nueve con cepa silvestre y cinco con cepa silvestre y RB51. No se identificó B. abortus cepa 19. El biotipo 1 se aisló en un caso. Las 14 vacas infectadas con la cepa silvestre resultaron positivas en las tres pruebas serológicas. En B, por PCR no se identificó Brucella. Las pruebas serológicas mostraron una sensibilidad del 100% respecto de PCR. La especificidad para FC, ELISA-C y ELISA-I fue del 100%, 99% y 95%, respectivamente. Se concluye que la PCR sería útil como complemento de las pruebas serológicas o cuando no hay un resultado concluyente.
Palabras clave: Diagnóstico, Brucella, PCR, fijación del complemento, ELISA, brucelosis.

SUMMARY
Assessment of polymerase chain reaction (PCR) to diagnose brucellosis in a Brucella infected herd. The diagnosis of bovine brucellosis using PCR in blood and milk samples from two dairy herds were compared to in vitro isolation, complement fixation test (CF), competitive ELISA (C-ELISA) in serum, and indirect ELISA (I-ELISA) in milk. Samples were obtained from 99 cows vaccinated with Brucella abortus strain 19, from a naturally infected herd (A), whose cows were also vaccinated with B. abortus strain RB51 as adults, and 100 from brucellosis free herd (B). In herd A, PCR identified 14 B. abortus infected cows: nine infected with wild type, and five with wild type and RB51, B. abortus S 19 was not identified. B. abortus biotype 1 was isolated from one cow. All cows infected with a wild strain of B. abortus were positive in serologic tests. Brucella was not found in herd B using PCR. Serological test showed 100% sensitivity related to PCR. The specificity for CF, C-ELISA and I-ELISA was 100%, 99% and 95% respectively. PCR could be useful to identify Brucella biotypes and to complement serologic tests.
Key words: Diagnosis, Brucella, PCR, complement fixation test, ELISA, Brucellosis.

INTRODUCCIÓN

La brucelosis bovina, provocada principalmente por Brucella abortus, genera un marcado impacto económico-social (1), ya que es una zoonosis y ocasiona pérdidas en la producción pecuaria estimadas entre 42 y 66 millones de dólares anuales, basadas en ternerosmuertos, abortos y disminución de la producción de leche (8).
Las pruebas serológicas utilizadas en Argentina para el diagnóstico de la brucelosis incluyen la prueba en placa con el antígeno tamponado (4), aglutinación lenta en tubo o de Wright (3) y 2-mercaptoetanol (3) y en menor escala, la fijación del complemento (FC) (3), e inmunoenzimáticas (ELISAs) indirecta (ELISA-I) (23) y de competición (ELISA-C) (7, 20, 22). La eficiencia diagnóstica de las pruebas aglutinantes y ELISAs ha sido evaluada utilizando como “prueba de oro” el cultivo bacteriológico y/o la FC, según se tratase de validaciones en pequeña o en gran escala, respectivamente.
La identificación genómica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) constituye otro método para la identificación de Brucella spp., que a diferencia de los cultivos bacteriológicos, permite trabajar con organismos muertos, hecho que evita el riesgo de infección para el operador (13).
En la última década son numerosos los antecedentes sobre el empleo de la PCR para la detección genómica de Brucella spp. en la confirmación del diagnóstico. En bovinos la mayoría de estos trabajos han sido evaluados a partir del cultivo in vitro de Brucella spp. y en menor escala de muestras biológicas obtenidas de bovinos infectados (9, 18). El objetivo del presente estudio fue evaluar la PCR para identificar y caracterizar B. abortus a partir de muestras de sangre y leche de vacas vacunadas con B. abortus cepas 19 y RB51 de un rebaño con vacas serológicamente positivas a Brucella, y comparar la técnica con el cultivo de leche y las pruebas serológicas en muestras de leche y suero. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Establecimientos
Se seleccionaron dos establecimientos productores de leche de la cuenca lechera central de Argentina, de aproximadamente 200 hembras adultas Holando Argentino, uno con antecedentes de brucelosis (establecimiento A) y el otro libre de la enfermedad (establecimiento B).
Antes de comenzar el estudio el establecimiento A tenía una prevalencia de brucelosis del 10%. Todas las hembras habían sido vacunadas con B. abortus cepa 19 cuando tenían entre tres y ocho meses de edad. Las vacas mayores de 18 meses fueron revacunadas con B. abortus RB51, 12 meses antes de comenzar el estudio. El establecimiento B estaba libre de brucelosis desde hacía diez años y todas las vacas habían sido vacunadas únicamente con B. abortus cepa 19 entre los tres y ocho meses de edad.

Muestras
En el establecimiento A se realizaron dos estudios de brucelosis en dos muestras (M1 y M2) obtenidas con diferencia de ocho meses. Para la M1 se seleccionaron al azar 99 vacas en lactancia, se tomaron en paralelo muestras de sangre con y sin anticoagulante, y de leche.
Para la M2, de las mismas vacas se obtuvieron en paralelo, muestras de sangre con y sin anticoagulante y de leche sólo en el caso de que estuvieran en lactancia.
Las muestras de sangre con anticoagulante y de leche se utilizaron para la obtención de ADN e identificación genómica de Brucella por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las muestras de suero y leche se utilizaron para la detección de anticuerpos específicos contra Brucella spp.
En el establecimiento B se seleccionaron al azar 100 vacas en lactancia y se obtuvieron muestras de suero y leche en paralelo, que se utilizaron para la detección de anticuerpos contra Brucella spp. Para la identificación genómica se utilizaron 20 muestras de leche, obtenidas al azar.

PCR
La obtención del ADN de sangre se realizó según la técnica de Leal Klevezas et al (9) modificada. Cada muestra de 300 µl de sangre se lisó con 1000 µl de una solución estabilizadora (SE) para lisis de glóbulos rojos (155 mM NH4Cl; 10 mM NaHCO3;100 mM EDTA disódico, pH 7.4), a 37ºC, 10 min, luego se centrifugó a 20.800 xg. El proceso se repitió hasta que el sedimento quedó claro. La digestión celular se realizó con 300 µl de SE para lisis celular (0,1 M Tris-HCl pH 7,5; 0,3 M NaCl - 0,025 mM EDTA) y 5 µl de proteinasa K (20 mg/ml,Gibco®) a 37ºC, 1 hora. La precipitación proteica se hizo con 200 µl de 7,5 M de acetato de amonio y centrifugación a 20.800 xg a 4 ºC, 3 min. El ADN contenido en el sobrenadante se precipitó con 300 µl de alcohol isopropílico y se lavó con 300 µl dealcohol etílico 75% a -20 oC. El ADN seco se resuspendió en 100 µl de SE de 10 mM Tris-HCl; 1Mm EDTA (TE), pH 8.
La obtención del ADN de leche se realizó siguiendo la técnica de Romero et al (19), con modificaciones. Cada muestra de 300 µl se trató con 100 µl de una solución de 50 mM NaCl; 125 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 7,6 y 100 µl de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 24%, a 80 ºC, 15 min. La digestión se completó con 10 µl de proteinasa K (20 mg/ml, Gibco®) a 50 ºC, 90 min. Las células lisadas se precipitaron con 100 µl de 5 M NaCl y 100 µl de bromuro de hexadeciltrimetilamonio e incubación a 65 ºC, 10 min. Cada muestra se centrifugó a 20.800 xg, 3 min. El ADN contenido en el sobrenadante se precipitó dos veces con 600 µl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y una vez con 500 µl de alcohol isopropílico. El sedimento se lavó con 300 µl de alcohol etílico 75% a &–20 ºC. El ADN se resus-pendió con 25 µl de TE.
Se utilizaron diferentes pares de iniciadores diseñados para la identificación de Brucella spp. y la caracterización de B. abortus silvestre, B. abortus cepa 19 y B. abortus RB51 (9, 10, 11). La identificación genómica de Brucella spp., se basó en la amplificación de un fragmento de 758 pb, mediante los iniciadores Br1F (5´ GCG CTC AGG CTG CCG ACG CAA 3') y Br2 R (5' TTG CCT TTT CGG GGG CAA TGA 3'), y de 190 pb con los iniciadores Br1F y Br3R (5' CCA GCC ATT GCG GTC GGT AC 3') del gen omp-2 presente en B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis y B. canis, pero ausentes en organismos antigénicamente relacionados.
La caracterización de B. abortus se basó en la amplificación de tres secuencias de ADN. La primera de 498 pb con los iniciadores 416F (5' TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT 3') y 428R (5' GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC 3') correspondiente a un elemento genético estable (IS711) presente en B. abortus silvestre, B. abortus cepa 19 y B. abortus RB51 (2, 5) y a un segmento de ADN genómico; la segunda de 364 pb con los iniciadores 416F y 428R (5' CCC CGG AAG ATA TGC TTC GAT CC 3'), de una secuencia de ADN específica para B. abortus RB51 y la tercera de 178 pb con los iniciadores Eri1F (5' CGC CCG CGA AGA ACT TAT CAA 3') y Eri2R (5' CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA 3') de una región genómica ausente en B. abortus cepa 19 pero presente en las otras dos (5).

Condiciones para la PCR
Para muestras de sangre y leche la PCR se realizó en un volumen de 30 µl. Se utilizaron 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Gibco®, BRL), buffer 20 mM de Tris-HCl, 3 mM de MgCl2 y 1,25 mM de cada desoxirribonucleótido ( dATP, dTTP, dCTP, dGTP) pH 8.3, 20mM de cada iniciador y 5 ó 1µl de ADN purificado para sangre o leche, respectivamente.
La PCR se realizó en un termociclador (Perkin Elmer 2400) con un calentamiento a 94 ºC por 5 min y 35 ciclos a 94 ºC por 60 seg, 56 ºC por 60 seg y 72 ºC por 60 seg con una extensión final a 72 ºC por 4 min y mantenimiento a 4 ºC. Los productos de la PCR se visualizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1.5% y 0.015% de bromuro de etidio en presencia de luz UV (10).

Pruebas serológicas
Las muestras de sueros se analizaron mediante las pruebas de FC 50% de hemólisis, expresada en unidades internacionales (UI) (3) y ELISA-C expresada en porcentaje de inhibición (PI) (7, 20, 22). Las muestras de leche se analizaron mediante ELISA -I y sus resultados se expresaron en porcentaje de positividad (PP) (23). Títulos de 41 UI , 40 PI y 40 PP o mayores se consideraron positivos para FC, ELISA-C y ELISA-I respectivamente (3, 22, 23).

Cultivos bacteriológicos
Se utilizó el medio selectivo basado en agar-triptosa base con el 1% de dextrosa, el 5% de suero equino inactivado y la adición de 100 mg de cicloheximida, 2500 UI de bacitracina, 6000 UI de polimixina B, 10 mg de ácido nalidíxico y 10 mg de vancomicina por cada litro de medio. Los cultivos se incubaron en una atmósfera con 10% de CO2a 37 oC. Las colonias se observaron entre el cuarto y decimoquinto días. Las colonias sospechosas se sometieron a una coloración de Ziehl-Neelsen y se observaron con microscopio óptico con un aumento de 100 x. La tipificación de Brucella se realizó por las pruebas bioquímicas convencionales (15).

Análisis de datos
Se determinó la prevalencia y la incidencia de labrucelosis bovina para el establecimiento A. Se estableció la sensibilidad y especificidad para FC, ELISA-C y ELISA-I respecto de la PCR con el programa estadístico Med calc (12, 21). El punto de corte óptimo para diferenciar animales positivos de negativos, para las pruebas de ELISA-C y ELISA-I se estableció mediante el análisis “Receiver Operating Characteristic” (ROC), con un intervalo de confianza del 95%.
Se determinó la concordancia y el índice kappa entre las pruebas serológicas utilizadas (21). Se analizó la relación de los títulos de anticuerpos obtenidos por FC, ELISA-C y ELISA-I para las vacas infectadas entre la M1 y M2 mediante el t-student para muestras pareadas. Se evaluó la proporción de bovinos portadores de B. abortus RB51 en vacas infectadas con la cepa silvestre y vacas no infectadas mediante el análisis chi cuadrado (6).

RESULTADOS

En el establecimiento A se identificó por PCR Brucella spp. mediante la amplificación de los fragmentos de ADN de 758 pb (dato no mostrado) y 190 pb (Figura 1). Los iniciadores específicos permitieron confirmar la presencia de B. abortus RB51 por la amplificación de los fragmentos de 498 pb, 364 pb y 178 pb y de B. abortus silvestre por la amplificación de los fragmentos de 498 pb y 178 pb. No se identificó B. abortus cepa 19 (Figura 2).

De las 99 vacas analizadas en M1, se identificaron 14 positivas por PCR en sangre o leche, lo que representó una prevalencia del 14%. Las vacas infectadas resultaron positivas por las pruebas FC y ELISA-C en suero y ELISA-I en leche. Se aisló B. abortus biotipo 1 de la leche de una vaca (nº 157). Las 85 vacas no infectadas resultaron negativas por FC, una tuvo una reacción falsa positiva en ELISA-C con un título de 41 PI, mientras que por ELISA-I se detectaron cuatro falsos positivos con 62, 66, 43 y 60 PP. En la M2, 62 vacas estaban en lactancia y se evaluaron por PCR, FC, ELISA-C y ELISA-I, mientras que las 37 vacas que no estaban en producción se analizaron sólo por FC y ELISA-C. De las 62 vacas, nueve resultaron positivas en todas las pruebas, al igual que en la M1. De las 37 vacas secas, cinco resultaron positivas por FC y ELISA-C como en la M1; no se registraron nuevos casos de brucelosis y la incidencia por la PCR fue del 0%.
Las 14 vacas infectadas en la M1 se mantuvieron positivas a las diferentes pruebas serológicas, después de los ocho meses (Cuadro 1). Se encontró diferencia significativa entre los títulos de anticuerpos en la M1 y M2 sólo para FC ( p= 0,02), a diferencia de ELISA-C (p>0,5) y ELISA-I (p>0,3), donde no se encontraron diferencias de títulos significativas entre muestras. De las 14 vacas infectadas se identificaron nueve con B. abortus, cepa silvestre y cinco con infección mixta de B. abortus silvestre (S) y B. abortus RB51 (Cuadro 2). Las infecciones mixtas nunca se encontraron en el mismo espécimen, cuando RB51 fue detectada en leche, la cepa silvestre se identificaba en sangre o viceversa. Tampoco se encontró la cepa vacunal RB51 en los dos especímenes simultáneamente. En sólo una vaca la cepa RB51 fue detectada en la muestra de leche tanto en M1 como en M2.

En el establecimiento B, no se encontraron muestras positivas por la PCR. Todas las muestras de suero resultaron negativas por FC, mientras que una resultó positiva por ELISA-C con 44 PI. La prueba de ELISA-I resultó negativa en las 100 muestras de leche analizadas.
La sensibilidad, especificidad, concordancia e índice kappa para FC y ELISA-C en suero respecto de PCR y entre ELISA-I en leche y PCR para el establecimiento A, se presentan en el Cuadro 3.

 DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio muestran que la PCR es un método eficaz para identificar Brucella abortus a partir de muestras de sangre y de leche. Su presencia quedó demostrada por la amplificación de los segmentos de ADN de 758 y 190 pb, la cepa silvestre por la amplificación del segmento de 178 pb y ausencia del de 364 pb; mientras que la RB51 por los fragmentos de 178 y 364 pb, éste último específico para esta cepa vacunal.
Los iniciadores utilizados para la caracterización resultaron aptos para identificar B. abortus cepa silvestre y RB51 en un mismo animal pero en diferentes muestras. La detección simultánea en un mismo espécimen no fue posible porque la presencia de RB51 enmascara la identificación de la cepa silvestre y cepa 19, mientras que en ausencia de RB51, la cepa silvestre enmascara la de cepa 19. Consecuentemente, no fue posible determinar presencia de cepa 19 en las vacas infectadas, porque de las 14, nueve portaban la cepa silvestre y cinco infecciones mixtas (RB51 y silvestre) por lo que el fragmento de 178 pb se amplificó en todos los casos.
Los antecedentes epidemiológicos de brucelosis bovina en el establecimiento A indicaban una prevalencia cercana al 10%, por lo que se esperaban nuevos casos de brucelosis, como ocurriera en situaciones similares en rebaños lecheros de la cuenca central de Argentina donde se observaron incidencias de hasta el 6% (22). En este estudio se encontró una prevalencia del 14 % y la incidencia de brucelosis en ocho meses fue del 0%. El tratamiento con oxitetraciclina en el momento de secado de las vacas infectadas y la vacunación con B. abortus RB51 de las vacas no infectadas un año antes de comenzar el estudio podrían explicar éste resultado (14).
EL cultivo bacteriológico mostró baja eficiencia respecto de la PCR, lo que podría estar asociado a una actividad controlada de Brucella spp. en las vacas infectadas. Esto se vio reflejado por el 0% de incidencia de brucelosis encontrada y en la disminución de los niveles de anticuerpos observados por las pruebas serológicas. Esto no significa que la PCR utilizada en este estudio haya tenido una sensibilidad del 100%, ya que existen variantes de esta prueba que incrementan su sensibilidad en forma exponencial y podría identificar infecciones crónicas no detectadas por la PCR ni por las pruebas serológicas convencionales. En este estudio se aisló B.abortus biotipo 1 en un sólo caso, mientras que la PCR fue capaz de identificar 14 vacas infectadas, que tenían anticuerpos específicos en suero y leche. Similares resultados obtuvieron Leal-Klevezas et al. (9) en un grupo de 22 cabras expuestas a infección natural donde aislaron Brucella spp. de sólo una cabra, mientras que por la PCR se identificaron 19, de las cuales sólo 14 fueron positivas serológicamente. En este estudio, todas las vacas infectadas con el biotipo silvestre resultaron positivas en las tres pruebas serológicas. A pesar de que la media de los títulos de anticuerpos encontrados en M2 fue menor a la media de M1, los niveles de anticuerpos se mantuvieron por encima del punto de corte establecido para cada prueba serológica, aún en FC donde se encontró diferencia significativa entre ellas. La persistencia de los anticuerpos específicos, observada tanto en la M1 como en la M2 por las diferentes pruebas serológicas y mediante PCR, mostró que en ningún caso hubo resolución de la infección (16; 17).
En este estudio la PCR no amplificó fragmentos específicos para Brucella spp. en ninguna de las muestras correspondientes a las 85 vacas con dos análisis serológicos negativos (M1 y M2) en suero y en leche, ni en las 20 muestras de leche analizadas de vacas sanas pertenecientes al establecimiento B. Idéntica especificidad encontraron Romero et al. (19) cuando examinaron 37 bovinos libres de la enfermedad mediante la PCR. En el presente estudio la prueba serológica de mayor especificidad respecto de la PCR fue FC (100%), luego ELISA-C en suero (99%) y por último ELISA-I en leche (95%).
La caracterización de B. abortus RB51 permitió determinar la persistencia de esta cepa en leche o sangre en vacas vacunadas como adultas. En este estudio se identificó B. abortus RB51 en leche 80 semanas después de la vacunación asociadas en todos los casos a la infección natural con cepa silvestre. En el 36% de las vacas infectadas con B. abortus silvestre se detectó también B. abortus RB51; estos resultados no justificarían la vacunación con RB51 de vacas adultas infectadas, ya que sería incapaz de resolver la infección natural, contribuiría a mantener las dos cepas en el ambiente y comprometería el control y erradicación de la brucelosis.
La PCR permitió identificar y caracterizarB. abortus pero con algunas limitaciones de tiempo y costo, mientras que las pruebas serológicas efectuadas en suero y leche permitieron procesar más de 500 muestras por día por operador; la buena concordancia entre éstas y la PCR hace que sigan siendo las más recomendables para el diagnóstico en gran escala, mientras que la PCR sería una prueba útil para complementarlas en etapas de erradicación de la enfermedad y para la evaluación y desarrollo de nuevas pruebas serológicas.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por el proyecto Nacional de INTA: “brucelosis y tuberculosis” Nº 522004 y el proyecto regional: “Diagnóstico y control de la brucelosis bovina en el área de influencia de INTA Rafaela”, Nº 560134. Se agradece a los integrantes del Laboratorio de Salud Ani-mal e Inmunología del Instituto Nacional de Tecnología Agro-pecuaria (INTA) Estación Experimental Agropecuaria Rafaela (EEA ) y al Médico Veterinario Jorge Trossero, por facilitar el establecimiento y los registros, que hicieron posible realizar el presente estudio.

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Recibido: 03/03/04
Revisado: 09/08/04

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