Sensibilidad a colistín: evaluación de los puntos de corte disponibles en el antibiograma por difusión

C.H. Rodríguez^1*, J. Pautaso², K. Bombicino², C. Vay¹, A. Famiglietti¹

¹Laboratorio de Bacteriología, Departamento de Bioquímica Clínica, Hospital de Clínicas José de San Martín, ²Carrera de Especialización en Bacteriología Clínica. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. Av. Córdoba 2351, 1120 Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
^*Correspondencia. E-mail: carlos_hernanrodriguez@hotmail.com

RESUMEN
Las infeccionesproducidas por microorganismos multirresistentes son uno de los mayores problemas en los centros asistenciales. Frecuentemente, sólo las polimixinas muestran actividad “in vitro” frente a aislamientos de bacilos gram-negativos resistentes a los carbapenemes. Sin embargo, el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) no incluye, actualmente, recomendaciones para la realización de las pruebas de sensibilidad para este grupo de antibióticos. Se determinóla actividad de colistín y la correlación entre las pruebas de difusión y dilución de este antibiótico frente a 186 aislamientos contemporáneos en el Hospital de Clínicas “José de San Martín”, siguiendo las recomendaciones generales del NCCLS. Se evaluaron dos puntos de corte: NCCLS 1981 (resistente £ 8 mm y sensible > 11mm) y R. Jones 2001 (resistente £ 11mm y sensible > 14mm). Utilizando el punto de corte del NCCLS 1981 se cometieron los siguientes errores: 0,5% “minor”; 2,2% “major” y 4,4% “very major”, mientras que con el propuesto por R. Jones 2001: 18,9% “minor”; 3,8% “major” y 0,5% “very major”. En conclusión, dado que el punto de corte utilizado por R. Jones 2001 disminuye el error “very major” pero aumenta el “minor” se recomienda la utilización de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para confirmar la sensibilidad a colistín cuando sea usada en el tratamiento de infecciones, sin embargo no se detectó resistencia a colistín con halos de inhibición > a 16 mm.
Palabras claves: colistín, bacilos gram-negativos, pruebas de sensibilidad.

SUMMARY
Susceptibility to colistin: evaluation of breakpoints available in disk diffusion test. Infections produced by multidrug resistant organisms are one of the greatest problems in health centers. Often, only polymyxines show good activity “in vitro” against the carbapenem resistant gram-negative strains; but the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) documents do not currently provide interpretative criteria for testing the polymyxines.The antimicrobial activity ofcolistin,and the correlation betweenthe agar dilution test and disk diffusion test were evaluated against 186 gram-negative strains isolated at the Hospital de Clínicas “José de San Martín” of Buenos Aires city. All susceptibility tests were performed according to the NCCLS recommendations. Were evaluated two breakpoints, NCCLS 1981 (£ 8mm and >11mm), and R. Jones 2001 (£ 11 mm and > 14 mm). Discrepancies on interpretative category were found (0.5% minor; 2.2% major and 4.4% very major) with NCCLS 1981, and (18.9% minor; 3.8% majorand 0.5% very major) with R. Jones 2001 criteria. Conclusions. In spite of the fact that the breakpoint used by R. Jones 2001decreases the very major error but increases the minor error, according to our results we recommend the use of MIC methods to assist the therapeutic application of colistin; however resistance to colistin was not detected with zone diameters > 16mm.
Key words: colistin susceptibility, gram-negative rods, susceptibility test.

Polimixina B y colistín (polimixina E), fueronaprobados para el uso clínico en la década del 40. Son polipép-tidos básicos cíclicoscaracterizados por una pobre capacidad de difusión en agar y por un alto peso molecular. Debido a su toxicidad fueron reemplazados por otros antibióticos (cefalosporinas, aminoglucósidos y quino-lonas) en el tratamiento de infecciones por bacilos gram-negativos (BGN), siendo utilizados casi exclusivamente en formas farmacéuticas de aplicación tópica (pomadas y colirios).
El National Committee for Clinical Laboratory Standards ( NCCLS) publicó por última vez los puntos de corte para polimixina B y colistín, tanto para difusión como para dilución en el año 1981(6), mientras que otras sociedades comola Société Française de Microbiologie las mantiene (10).
Si bien diferentes sociedades de microbiología coinciden en considerarresistente un aislamiento cuando el valor de la concentración inhibitoria mínima (CIM) es > 4 mg/ml (6,10), otras consideran una dilución menor (1). Las diferencias en la metodología en las pruebas por difusión de las distintas sociedades científicas (potencia de los discos, concentración del inóculo bacteriano) hacen más difícil su realización e interpretación (1, 6, 10).
Debido al surgimiento de cepas con múltiples mecanismos de resistencia, los antibióticos polipeptídicos han vuelto a ser considerados una opción en el tratamiento de las infecciones por BGN y en recientes publicaciones se los considera de mucha utilidad para el futuro (11). Además, varios trabajoshanrevisado su toxicidad yeficacia en diferentes tipos de infecciones (5). El renovado interés en los antibióticos polipeptídicos ha llevado a reevaluar las diferentes pruebas de sensibilidad establecidas en la década del 70 (3).
El objetivo de este trabajo fue evaluar la utilidad de los puntos de corte por el método de difusión de colistín y establecer una serie de recomendaciones a seguir en las pruebas de sensibilidad de colistín frente a cepas aisladas en nuestro medio.
Se estudiaron en forma prospectiva 186 aislamientos de BGN provenientes de muestras clínicas de pacientes atendidos en el Hospital de Clínicas “José de San Martín”, entre los meses de octubre y diciembre del año 2002. Las diferentes especies deBGN se distribuyeron dela siguiente manera: Acinetobacter spp. (55), Escheri-chiacoli (31), Pseudomonasaeruginosa (25), Klebsiellapneumoniae (22), Enterobactercloacae (13), Steno-trophomonas maltophilia (12), Proteusmirabilis (12), Serratia mar-cescens (6), Morganella morganii (4), Citrobacter freundii (2), Proteus vulgaris (2) y Burkholderia cepacia (2).
El 32% y el 52% de las cepas de P. aeruginosay de Acinetobacter spp., respectivamente, fueron resistentes a carbapenemes y el 22% de las enterobacterias fueron resistentes a cefalosporinas de 3º y 4º generación.
En la totalidad de las cepas sedeterminó la CIMde colistín (colismetato sódico, Bristol Meyers Squib Argentina) por dilución en caldo Mueller-Hinton, ensayándose 4 diluciones (0,5; 1; 2 y 4 µg/ml) y la sensibilidad por difusión en agar con discos acolistín 10 µg (Lab. Britania), siguiendo las recomendaciones generales del NCCLS (7). Las cepas conresistencia adquirida fueron confirmadas con CIM en caldo Mueller-Hinton (rango ensayado: 1 a 128 µg/ml).
Se evaluaron dos puntos de cortepara las prue-bas de difusión, el establecido por el NCCLS en 1981(£ 8 mm y >11mm) (6) y el propuesto por R. Jones en 2001 (£11 mm y > 14 mm) (3), considerándose una cepa resistente cuando la CIM fue > 4 mg/ml.
Se utilizó colistín porque es el único polipéptido para uso parenteral comercializado en nuestro país. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 fue utilizada en el control de calidad de las pruebas de sensibilidad, obteniéndose los siguientes rangos, 15-16 mm para la difusión y 0,5-2 µg/ml para la dilución. Se consideró error “very major” el resultado de falsa sensibilidad, error “major” el resultado de falsa resistencia y error “minor” el valorintermedio cuando el resultado es sensible o resistente, siempre comparando la difusión con respecto a la dilución.
La resistencia de los microorganismos a los antimicro-bianos se la puede clasificar en resistencia natural o intrínseca y adquirida; esta última por su impacto en la salud pública es la más estudiada por microbiólogos y médicos. Sin embargo la resistencia intrínseca a los antibió-ticos polipeptídicos se emplea habitualmente como marcador en la identificación de especies dentro de la familia Enterobacteriaceae, en bacilos no fermentadores y en bacterias anaerobias y además como suplemento en varios medios de cultivo para el aislamiento de microor-ganismos naturalmente resistentes en materiales clínicos polimicrobianos. La resistencia adquirida, aunque descripta hace muchos años (8), se observa en forma esporádica incluso en grandes estudios multicéntricos (4), seguramente debido a la escasa utilización de esta clase de antibióticos, sin embargo en una reciente comunicación A. Reis publica un5% de cepas de Acinetobacter spp. resistentes a polimixina, con un rango de CIM entre 8 y 32 µg/ml, aisladas de 100 bacte-riemias de un hospital brasileño. Ninguna fue detectada en el antibiograma por difusión (9). La resistencia es provocada por una proteína de membrana externa denominada OprH-1, que interfiere con el sitio de ligamiento aniónico de las polimixinas con el lipopolisacárido de la pared. Este mecanismo de resistencia también afecta a los aminoglucósidos y EDTA (8).
Sólo 37 cepas presentaron valores de CIM > a 4 mg/ml: P.mirabilis (12), S.marcescens (6),M.morganii (4), Acinetobacter spp.(4), S. maltophilia (4), P. aeruginosa (2), P.vulgaris (2), E.cloacae (2) y 1 B. cepaci (Tabla 1). De las 12 cepas con resistencia adquirida, sólo4 se detectaron con el punto de corte del NCCLS 1981 y 11 con el propuesto por R. Jones 2001; por lo tanto, utilizando 14 mm como punto de corte hay una mayor detección de cepas resistentes, disminuyendo el error “very major” de 4,4% a 0,5% (Tabla 2). Lo mismo observa R. Jones que sobre 12 cepas resistentes detecta 2 con el punto de corte de 11 mm y 5 con el de 14 mm (3). Sin embargo, la especificidad disminuye debido a que 35 cepasestudiadas tienen su halo de inhibición entre 11 y 13 mm (Fig. 1), elevándoseel error “minor” a 18,9% (Tabla 2)provocando una disminución aparente enel porcentaje de sensibilidad en E. coli y K. pneumoniae, del 100% al 87,1% y 72,7%, respectivamente; en P. aeruginosadel 92,0% al 84,0% y en Acinetobacter spp. del 92,7% al71,9%.
El error “major” ( falsa resistencia), se observa fundamentalmente enS. maltophilia (Tabla 2), pero debe tenerse en cuenta que las técnicas de difusión no se encuentran estandarizadas por el NCCLS para este microorganismo. La difusión en los antibióticos polipeptídicos es afectada por la concentración de iones calcio y magnesio (2).
Posiblemente, el error “very major” se incremente a medida que aumenten las cepas con CIM > a 4 mg/ml, siendo factible que el porcentaje real de aislamientosde estas cepas sea superior, pero al realizar la mayoría de los laboratorios antibiogramas por difusión éstas no serían detectadas. Más información es necesaria paraevaluar la implicancia clínica y los factores de riesgo para la infección/colonización por las cepas con CIM > a 4 µg/ml (Tabla 3). Todos los aislamientos correspondieron a infecciones intrahospitalarias presentando además multirre-sistencia. Una cepa deE. cloacae (CIM 4 µg/ml) presentó resistencia simultánea a aminoglucósidos, trimetopri-ma-sulfametoxazol, fluorquinolonas y a todos los antibió-ticos betalactámicos excepto meropenem y fue aislada de orina de un paciente adulto con infección urinaria.
Cinco de doce cepas provinieron de pacientes que recibieron colistín como tratamiento, si bien se desconoce este dato, en la totalidad de los casos comunicadosno se descartaría la transmisión entre pacientes a través de material contaminado. Una de las cepas presentadas en este trabajo (Acinetobacter sp. CIM 16 µg/ml)pertenece a un paciente pediátrico con distres respiratorio medicado con colistín intravenoso. La cepa se recuperó de la sangre luego de 11 días con estetratamiento. Como se mencionó anteriormente, 11 de 12 cepas fueron detectadas con el punto de corte de R. Jones 2001; sin embargo, estas cepas poseen halos de inhibición similares alas sensibles a colistín. A diferencia de lo publicado por R. Jones en el cual la mayoría de las cepas sensibles tienen diámetros de inhibición comprendidos entre 17 y 19 mm, nosotros observamos que el 47,3% de las cepas con CIM £ a 2 µg/ml poseen halos entre 14 y 16 mm (Figura 1). Esta diferencia podría deberse a la distinta proporción entre los BGN analizados en ambos trabajos.
Si bien son pocas las cepas resistentes estudiadas, no se detectó resistencia cuando el halo de inhibición fue mayor a 16 mm, sin embargo, un halo menor no implicó necesariamente resistencia.
En conclusión, según nuestros resultados y lo publicado anteriormente, sería necesario la realización de técnicascuantitativas o semicuantitativas para evaluar la sensibilidad a antibióticos polipeptídicos en aquellas situaciones que infectológicamentelo ameritan.

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Recibido: 04/02/04
Revisado: 06/09/04