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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.36 n.4 Ciudad Autónoma de Buenos Aires oct./dic. 2004

 

Análisis de una cepa de Yersinia enterocolitica aislada de heces diarreicas humanas en Argentina

M. Paz*, H. Muzio, S. Teves, P. Santini+

Cátedra de Higiene y Sanidad. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires.
Junin 956 CP 1113. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina
* Correspondencia: E-mail: marpaz@ffyb.uba.ar

RESUMEN
Algunos serotipos de Yersinia enterocolitica ocasionan desde diarreas hasta infecciones invasivas. El objetivo del trabajo fue analizar factores de virulencia y marcadores asociados en una cepa de Y. enterocolitica aislada de heces diarreicas humanas. El aislamiento deY. enterocolitica analizado fue incluído dentro del sub-grupo 1A.La determinación de resistencia al suero humano normal e hidrofobicidad de superficie, así como la búsqueda de los genes vir F y ail, resultaron negativos. Se demostró sin embargo producción de enterotoxina a 20 ºC y también a 37 ºC en condiciones de osmolaridad y pH similares a las del intestino humano. La enterotoxina, presentó reactividadpor la prueba del ratón lactante, aunque no se pudo comprobarpor PCR la presencia del gen yst. Los resultados obtenidos por nosotros, coincidentes con los de otros investigadores, indican que ciertos aislamientos clínicos de Y. enterocolitica del biotipo 1A (“avirulentas”), son capaces de causar enfermedad, probablemente a través de otros mecanismos, distintos a los caracterizados en especies de Yersinia enteropatógenas.

Palabras clave:Yersinia enterocolitica, factores de virulencia, patogenicidad, enterotoxina

SUMMARY
Analysis of a Yersinia enterocoliticaisolated from human diarreic feces in Argentina. Some serotypes of Yersinia enterocoliticamight causediarrheas and/or invasive infections. The aim of this work was to analyze virulence factors and associated markers in a strain of Y. enterocolitica isolated from human diarrheic feces. The strain analyzed was included in the biotype 1A. The virulence markers determinationas well as the search of the genes vir F and ail,were negatives. However, it was demonstratedenterotoxin production at 20 ºC, andat 37 ºC in osmolarity conditions and pH similar to the human intestine. The enterotoxin presented reactivity for the infant mouse test, although it could not be proven the presence of yst gene by PCR. The results obtained by us, coincident with those of other investigators,indicated that certain clinical isolates of Y. enterocolitica of the biotype 1A (“avirulent”), could be the etiological agent of the illness trhough other mechanisms of virulence, that would differ from those previously characterized in species of enteropathogenic Yersinia.

Key words: Yersinia enterocolitica, virulence factors, pathogenicity, enterotoxin

Yersinia enterocolitica es un microorganismo que aparece ampliamente distribuido en la naturaleza. Está reconocido como un patógeno importante que ocasiona una serie deinfecciones que abarcan desde diarreas inespecíficas hasta afecciones invasivas, dependiendo de la cepa, la dosis, factores genéticos, edad y condiciones inmunológicas del huésped. Se considera que la yersiniosis se adquiere por ingestión de alimentos y/o aguas contaminadas, con cepas patógenas.
En la virulencia de las mismas se encuentran involu-crados genes plasmídicos y cromosómicos, que a su vez se relacionan con factores y marcadores fenotípicos de virulencia.
Si bien el hallazgo de Y. enterocolitica es común en otros países, resulta poco frecuente en Argentina. Nuestro grupo de trabajo ha realizado el aislamiento de cepas ambientales de Yersinia en aguas recreacionales (4) y de una cepa de Y. enterocolitica en heces diarreicas. Esta última fue caracterizada en un trabajo anterior como Y. enterocolitica 1/O:5/Xz y debido ala negatividad para los marcadores de virulenciatales como dependencia de calcio a 37 ºC, captación del rojo congo y autoaglu-tinación a 37 ºC, la ausencia del plásmido de virulencia y positividad para actividad de pirazinamidasa, hidrólisis de esculina y fermentación de salicina, se la consideró como “avirulenta”(9).
Dado que dicho microorganismo fue el único aislado, probablemente productor de la diarrea, el objetivo del presente trabajo fue continuar con la investigacióndel sub-grupo y de otros indicadores de virulencia.
En base a las pruebas bioquímicas sugeridas por Bottone (2), se realizaron los ensayos para la determinación del sub-grupo de dicha cepa. Además como marcadores se probaron hidrofobicidad de superficie y resistencia al suero humano normal. Se efectuó también la búsqueda por métodos de amplificación molecular (PCR) de los siguientes genes de virulencia: vir F (plasmídico) y ail e yst (cromosómicos).
Por último se verificó la producción de enterotoxina termoestable, según Cornelis (3), responsable de diarrea,por el ensayo de ratón lactante, en sobrenadantes de cultivos obtenidos a 20 ºC y además en condiciones que se asemejan a las existentes en el lumen intestinal, utilizando sobrenadantes de cultivos obtenidos por incubación a 37 ºC.
Se trabajó conY. enterocolitica 1/O:5/Xz, aislada a partir de heces diarreicas humanas en el Hospital de Clínicas “José de San Martín”, Buenos Aires-Argentina, por nuestro grupo de investigación (9). Como cepa comprobadamente virulenta seutilizó Y. enterocolitica FCF 468(4/O:3/VIII) y la cepaFCF 404 (1/O:5,27/Xz) como avirulenta, obtenidas del Laboratorio de Referencia de Yersinia, Araraquara, Sao Paulo, Brasil.
Se utilizaron como pruebas de caracterización de sub-grupo: actividad de lipasa, de pirazinamidasa, hidrólisis de esculina, fermentación de xilosa, salicina, trehalosa, sorbosa e inositol, producción de indol, descarboxilación de ornitina, prueba de Voges-Proskauer y reducción de nitrato, según Bottone (2).
Para la medición de la hidrofobicidadde superficie de la cepa en estudio se utilizó la técnica de Adhesión microbiana a hidrocarburos (MATH) (12). Esta técnica se basa en la mezcla de una suspensión de células lavadas con PBS ( Na2HPO4 12 H2O 2,58 g- NaH2PO4 2 H2O 0,17 g - NaCl 0,75 g - H2O cantidad necesaria para 100 ml, pH 7,6 ) y el hidrocarburo (hexadecano) a distintos tiempos, 1, 3, 5, 7, 10, 25 y 30 minutosal cabo de los cualesse midió la adhesión de las células al hidrocarburo,por el descenso en la turbiedad de la fase acuosa, luego de la separación de las fases, midiéndosela absorbancia en función del tiempo para la cepa en estudio, la de referencia y la cepa de S. mitis como patrón de hidrofobicidad.
Las cepas virulentas se caracterizaron por una disminuciónde la absorbancia. La determinación de este marcador se efectuó a 28 y a 37 ºC, dado que la producción de las proteínas involucradas es temperatura-dependiente y se expresa a 37 ºC (3,10). Como patrón de modificación de hidrofobicidad se empleóStreptococcus mitis y Y. enterocolitica FCF 468 y FCF 404, como cepas que presentan hidrofobicidad positiva y negativa, respectivamente. En todos los casosS. mitis se incubó a 37 ºC, dado que a temperaturas inferiores no desarrolla.
La resistencia a la acción bactericida del suero humano normal característica de cepas virulentas, se determinó según la técnica de Pai y De Stephano (8).
Brevemente, la bacteria en estudio fue cultivada «overnigth» en el medio agar tripteína de sojasuplementado con glucosa 0,01 M, MgCl2 0,02 M y oxalato de sodio 0,02 M a 28 y 37 ºC. Las colonias fueron luego recolectadas ensolución salina a una concentración de 108UFC/ml; ésta fue diluida 10 veces en HBSS conteniendo 0,1% (P/V) de gelatina(la inclusión de gelatina es necesaria para neutralizar la acción bactericida del buffer HBSS). A tiempo cero, 0,3 ml de la suspensión bacteriana de 107UFC/ml se agregarona un tubo con 2,7 ml de HBSS con 0,1% de gelatina y 10% (v/v) de suero humano normal. El tubo control contenía la misma mezcla de reacción pero sin el suero humano normal. Los tubos fueronincubados a 37 ºC a durante30, 60, 90 y 120 minutos, luego de los cuales las muestras fuerondiluidas 1:10 en solución salina y alícuotas de 0,1 ml de cada dilución fueron sembradas por triplicado en placas de agar tripteína de soja, para el recuento de viables.
Además de la cepa en estudio, como cepas comprobadas virulenta y avirulenta se utilizaron Y.enterocolitica FCF 468 y FCF 404. La incubación de las cepas se efectuó a 28 y 37ºC dado que la máxima expresión de dicha característica se obtiene a 37 ºC.
Para la detección de los genes ail y vir F, se empleó el método descripto por Saumya Bhaduri (1). Se prepararon suspensiones de cada cepa en agua destilada estéril. Las muestras se hirvieron durante 10 minutos y se centrifugaron a 13.000 x g durante 1 minuto. La mezcla de PCR contenía: 0,5 U de Taq polimerasa (Promega), MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), 100ul de cada desoxinucleótido y 0,2 uM del “primer” ail o vir F.
Los “primers” usados para los genes ail y vir F de Y. enterocolitica patógena fueron: (5’-ACTCGATGAT-AACTGGGGAG- 3’ y 5’-CCCCCA GTAATCCATAAAGG-3’) para la detección del gen ail (región nucleotídica 664 a 833) que amplifican a 170 pares de bases (pb) del fragmento de ADN del cromosoma.
Los primers (5’-TCATGGCAGAACAGCAGTCAG-3’ y 5’-CTCATCTTACCATTAAGAAG-3’) para la detección del gen vir F (región nucleotídica 430 a 1020) que amplifican 591 pb del ADN del plásmido de virulencia.
La PCR se realizó en un termociclador MJ ResearchPT 150, con el siguiente programa: pre-desnaturalización a 94 ºC, 1 minuto; 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC, 0,5 min.; hibridación a 55 ºC, 1 min.; extensión a 70 ºC, 2 min. y extensión final a 70 ºC, 5 min. En cada prueba de amplificación de ADN, se utilizaron como controles negativos muestras que contenían agua destilada y como control positivo una muestra de ADN de Y. enterocolitica FCF 468. Los productos de la amplificación fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y de poliacrilamida, teñidos con bromuro de etidio y examinados bajo luz ultravioleta.
Para la detección del gen yst que codifica la enterotoxina termoestable de Y. enterocolitica, se empleó el método descripto por Ibrahim y col. (6). Se prepararon suspensiones de cada cepa en agua destilada estéril. En la preparación de los templados las muestras se hirvieron durante 10 minutos y se centrifugaron a 13.000 x gdurante 1 minuto. La mezcla de PCR contenía: 0,5 U de Taq polimerasa (Promega), MgCl2 1,25 mM, KCl, 10 50 mM, Tris-HCl mM. (pH 9,0 a 25 ºC), 0,1% de Triton X-100, 200 μM de cada desoxinucleótido y 0,2 μM de los “primers” de yst. Los “primers” usados para yst, fueron: (5’-30AATGCTGTC-TTCATTTGGAGC50-3’) y (5’-192GCAA-CATACATCACAGCAATC172-3’).
La PCR se realizó en un termociclador MJ ResearchPT 150, con el siguiente programa: pre-desnaturalización a 93 ºC, 3 minutos; 35 ciclos de desnaturalización a 93 ºC, 1 minuto; hibridación a 55 ºC, 2 minutos; extensión a 72 ºC, 40 segundos y extensión final a 72 ºC, 5 minutos.
Como controles positivo y negativo, se utilizaron muestras preparadas de igual manera que en la determinación anterior. Los productos de la amplificación fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio y examinados bajo luz ultravioleta.
La detección de la producción de enterotoxina termoestable por la prueba del ratón lactantese efectuó utilizando la técnica de Schiemann (13). Los ensayos se realizaron con la cepa en estudio y cepas controles virulenta y avirulenta, con los sobrenadantes filtrados de los cultivos obtenidos por incubación a 20 ºC, sin calentar y calentados a 69 ºC (30 minutos) y 100 ºC (10 minutos). La cepa en estudioy los controles cultivados a 37 ºC, fueron ensayados en condiciones estándar y con modificaciones de los factores que regulan la producción de enterotoxina en intestino (pH y osmolaridad) según lo descripto por Mikulskis. (7). El resultado del ensayo, se expresó como la relación del peso combinado de los intestinos respecto del peso combinado de las carcazas de 5 ratones. Una relación igual o mayor de 0,083 fue considerada como positiva para el ensayo de producción de enterotoxina termoestable (13).
Los datos se procesaron estadísticamente efectuando el análisis de la varianza (ANOVA), y realizando posteriormente el test de Dunnet, tomando como control elfiltrado del caldo sin inocular e incubado en idénticas condiciones de temperatura, pH y osmolaridad.
En la Tabla 1, se muestran los resultados de las pruebas para definir el biotipo de la cepa en estudio según Bottone. De acuerdo con los resultados obtenidos se clasificó como1 A.

En la Tabla 2 se muestran los resultados de hidrofobicidad de superficie para las distintas cepas ensayadas, comparando entre S. mitis (control positivo), cepas de referencia Y. enterocolitica FCF 468 (virulenta), Y. enterocolitica FCF 404 (avirulenta) y la cepa en estudio Y. enterocolitica 1 A/O:5/Xz. De dicha tabla se desprende que la cepa en estudio se comportó semejante a la cepa de referencia avirulenta, con valores de absorvancia de 0,1 e iguales en los diferentes períodos de tiempo.

En la Tabla 3 se muestran los valores obtenidos para resistencia al suero humano normal de cepas de referencia Y. enterocolitica FCF 468 (virulenta), Y. enterocolitica FCF 404(avirulenta), comparandola cepa en estudio Y. enterocolitica 1 A/O:5/Xz, la cual indica similitud entre estas dos últimas.

En la Tabla 4, se presentan los datosde producción de enterotoxina termoestable en el ensayo del ratón lactante. Y. enterocolitica 1 A/O:5/Xz muestra actividad, incubada previamente a 20 ºC.

En condiciones estándar la cepa en ensayo no demuestra actividad in vivo a 37 ºC. Cambiando las condiciones del medio de cultivo, a pH 8,0y osmolaridadsimilar a la presentada por el lumen intestinal se demostró actividadin vivo también por incubación a 37 ºC.Los controles negativo y positivo, evidencian los resultados esperados a 20 y 37 ºC.
En las Figuras 1 y 2, se muestran los resultados de amplificación molecular de los genes virF, ail, e yst de las cepas de Y. enterocolitica virulenta y en estudio, visualizándose la ausencia de dichos genes para ésta última.

De acuerdo a los hallazgos obtenidos esta cepa pertenece al biotipo 1A. El ensayo de hidrofobicidad de superficie y la resistencia al suero humano normal, indican que la cepa en estudio se comportó como una cepa no virulenta clásica. Esto es coincidente con resultados obtenidos anteriormente por nuestro grupo para otros marcadores fenotípicos de virulencia (dependencia de calcio a 37 ºC, captación del rojo congo, autoaglutinación a 37 ºC y la ausencia del plásmido de virulencia).
No obstante, cuando se evaluó la producción de una respuesta biológica in vivo a través del ensayo del ratón lactante, se obtuvo un resultado positivo semejante a la respuesta con la cepa de referenciavirulenta, a las dos temperaturas de incubación ensayadas, 20 y 37 ºC. Se demostró que es estable al calor, ya que los valores obtenidos de Pi/Pc dierondiferencias significativas de acumulación de fluido intraintestinal de la cepa en estudio y la de referencia virulenta respecto a la cepa avirulenta. Es de destacar que el agregado de Ca Cl2y el pH 8,0 no modificaron los valores de producción de enterotoxina estable al calor.
En coincidencia con nuestros resultados, existen antecedentes de cepas 1A aisladas de casos con sintomatología característica de yersiniosis que arrojaron resultados negativos para los marcadores y algunos factores de virulencia. En nuestro caso se obtuvo a20 ºC un producto de homología funcional con una enterotoxina termoestable, por la prueba del ratón lactante, concordando con lo informado por otros investigadores para cepas de Y. enterocolitica serotipo O:5 (11)y de Y. bercovieri (14).
El papel de la enterotoxina como factor de virulencia ha sido controvertido (2, 3, 7), dado que su máxima producción en cultivos se logra a una temperatura por debajo de los 30 ºC. Sin embargo, los parámetros fisico-químicos del medio juegan un papel importante en la transcripción del gen yst. En los cultivos habituales, el gen de la enterotoxina se transcribe sólo a temperatura inferior a 30 ºC, lo cual está en desacuerdo con el papel de laenterotoxina Yst como productora de diarrea a la temperatura corporal.
No obstante, la transcripción del ystpuede inducirse a 37 ºCincrementando la osmolaridad y el pH a valores que normalmente se presentan en el lumen del íleon, lo que ha sido descripto por Mikulskis y col. (7) y confirmado por nosotros por la prueba del ratón lactante. Estos hallazgos reconciliarían la observación concerniente a la expresión de yst en el huésped y en cultivos in vitro, reforzando así la idea de que la enterotoxina Yst sería un factor de virulencia en Y. enterocolitica y por lo tanto podría ser responsable de la diarrea.
Es necesario aclarar que por amplificación por PCR no se detectó el gen que codifica la producción de dicha enterotoxina. Esto podría deberse a que en el caso de la cepa estudiada exista producción de toxina semejante a Yst en cuanto a termoestabilidad y reactividad en el ratón lactante, pero que difiere de la misma en su composición genética, su PM y/o mecanismos de acción (5,14).
Este tipo de toxinas ha sido detectado en distintas especies de Yersinia tales como serovariedades no patógenas de Y. enterocolitica y en especies no virulentas, como Y. bercovieri. Dado que, como en nuestro caso, las cepas antes mencionadas han sido ocasionalmente aisladas a partir de pacientes con diarrea, no debe descartarse la contribución de estas toxinas a la virulencia y/o al cuadro clínico.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. Deise Pasetto Falcao, el haber proporcionado las cepas de Yersinia enterocolitica utilizadas como referencia, pertenecientes al Laboratorio de Referencia de Yersinia, Araraquara, Sao Paulo, Brasil.
Este trabajo ha sido realizado con fondos de subsidios UBACyT.

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Recibido: 25/11/2003
Aceptado: 13/12/04