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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.36 n.4 Ciudad Autónoma de Buenos Aires oct./dic. 2004

 

Levaduras inhibidoras de Penicillium

M.R. Benítez Ahrendts, L. Carrillo*

Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Jujuy, Alberdi 47, 4600 SS Jujuy
*Correspondencia. E-mail: lcarrillo@arnet.com.ar

RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue determinar la acción inhibitoria in vitro e in vivo de algunas cepas de levaduras de la zona citrícola jujeña sobre el crecimiento de los mohos patógenos post-cosecha y seleccionarlas para elaborar un producto de biocontrol. Se aislaron de frutos cítricos cepas de los mohos patógenos post-cosecha Penicillium digitatum, P. italicum,P. ulaiense, Phyllosticta sp. y Galactomyces geotrichum, así como de levaduras saprófítas de los géneros Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Pichia y Rhodotorula. También se obtuvieron algunas levaduras de otras fuentes. Se identificaron las levaduras por las características macro y micromorfológicas y las pruebas fisiológicas. La actividad in vitro e in vivo de las diferentes cepas fue diferente según se enfrentaran a P. digitatum o P. ulaiense. Candida cantarellii y una cepa de Pichia subpelliculosa produjeron una reducción significativa del área de las lesiones provocadas por estas especies de Penicillium, y podrían ser empleadas en la formulación de un producto para biocontrol.

Palabras clave: levaduras, cítricos, patógenos post-cosecha, biocontrol.

SUMMARY
Inhibitory Penicillium yeasts.The objective of this work was to establish the in vitro and in vivo inhibition of post-harvest pathogenic moulds by yeasts in order to make a biocontrol product. Post-harvest pathogenic moulds Penicillium digitatumP. italicum, P. ulaiense, Phyllosticta sp., Galactomyces geotrichum and yeasts belonging to genera Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kloeckera,Pichia, Rhodotorula were isolated from citrus fruits. Some yeasts strains were also isolated from other sources. The yeasts were identified by their macro and micro-morphology and physiological tests. The in vitro and in vivo activities against P. digitatum or P. ulaiense were different. Candida cantarellii and one strain of Pichia subpelliculosa produced a significant reduction of the lesion area caused by the pathogenic moulds P. digitatum and P. ulaiense, and could be used in a biocontrol product formulation.

Key words: yeasts, citrus, post-harvest pathogens, biocontrol.

INTRODUCCIÓN

El control de las enfermedades de los frutos cítricos se lleva a cabo por pulverizaciones pre-cosecha y lavados post-cosecha adicionados de fungicidas. Debido a un aumento creciente de cepas resistentes y a los residuos inaceptables que dejan ciertos fungicidas, se buscan alternativas para el control de las enfermedades (11).
La necesidad del biocontrol en los establecimientos empacadores de cítricos surgió en California (EEUU) cuando en 1992 apareció un penicilio con resistencia a los fungicidas de uso habitual (16). En el mismo año ese penicilio también fue aislado en Jujuy pero la cepa era sensible a los antifúngicos (7) y fue identificada por Pitt como Penicillium ulaiense e incorporada a la colección CSIRO - Australia bajo el número FRR 4477 (15).
Las levaduras saprofíticas se hallan comúnmente sobre la superficie de las hojas ylos frutos (24) y algunas parecen competir efectivamente con los patógenos post-cosecha Penicillium digitatum, P. expansum y otros (19, 20). Algunas levaduras producen agentes antimicrobianos como sulfito, etanol o proteínas “killer” (2) y en determinadas condiciones, forman biosurfactantes y bioemul-sificadores que facilitan la adhesión (8, 12).
Katz et al. (18) elaboraron un producto comercial en base a Candida oleophila y un fungicida selectivo, para el control de los patógenos post-cosecha de cítricos, mientras que McGuire y Hagenmaier (20) usaron dicha levadura mezclada con la cera aplicada a las frutas durante el empaque. Wilson & Chalutz (25) observaron que Candida guilliermondii y Debaryomyces hansenii eran activas contra P. digitatum sobre pomelos. Por otra parte, Hua et al. (17) comprobaron que las levaduras C. oleophila, C. krusei, C. guilliermondii y P. anomala inhibían en distinto grado el crecimiento de mohos y la producción de micotoxinas, por lo que podrían ser usadas para reducir la contaminación fúngica (4).
El objetivo de este trabajo fue determinar la acción inhibitoria, in vitro e in vivo, sobre el crecimiento de los mohos patógenos post-cosecha de las cepas de levaduras de la zona citrícola jujeña y seleccionarlas para elaborar un producto de biocontrol.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras
Se obtuvieron frutos de distintas variedades de Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle, Citrus limon (L.) Burm, Citrus sinensis (L.) Osbeck y Citrus grandis (L.) Osbeck provenientes de las plantaciones del departamento Ledesma, provincia de Jujuy.

Aislamiento de mohos y levaduras
Seprocedió a aislar los mohos y levaduras de la superficie de los frutos deteriorados,mediante estrías sobre placas de agar triptona glucosa levadura (TGY) y agar rosa Bengala cloranfenicol (RBC) hechas con los hisopos humedecidos en diluyente estéril preparado según Beuchat et al. (5). Las placas se incubaron a 25 ºC durante 3 a 15 días dentro de bolsas plásticas junto a un vaso con agua para evitar la desecación. En algunos casos se lavaron los frutos con diluyente estéril y se hicieron estrías sobre los mismos medios. Las colonias desarrolladas se repicaron en TGY o en agar Czapek levadura (CYA), según se tratara de una levadura o un moho respectivamente. Los medios de cultivo se prepararon de acuerdo a Pitt & Hocking(23).

Identificación de los mohos
Se hicieron cultivos por punción en tres puntos de cada placa de medio y se incubaron a 25 ºC. Se utilizaron agar extracto de malta (MEA), CYA y agar nitrato 25% glicerol (G25N). Se hicieron otros cultivos sobre CYA que se incubaronn a 37 y 25 ºC durante igual tiempo. Las especies de Penicillium además se sembraron en agar sacarosa creatina neutro (CSN). Estos medios también fueron preparados según Pitt & Hocking (1997). Luego de incubar en la obscuridad durante 7 días, se midieron los diámetros de las colonias, se observaron las características del anverso y reverso, y los detalles micro-morfológicos. Se consultaron las claves Bridge et al. (6),Hanlin (13),Pitt (22) y Pitt & Hocking (23).

Identificación de las levaduras
Se hicieron cultivos por punción en agar papa glucosa (PDA) y por estría en TGY y agar triptona glucosa levadura acético (TGYA), que se incubaron a 25 ºC. Se hizo otro cultivo sobre TGY que se incubó a 37 ºC durante igual tiempo. Se sembraron las cepas en agar base carbonado (YCB) y en caldo urea (RUB) para ensayar la asimilación de nitratos y comprobar la presencia de ureasa, respectivamente. Para observar la asimilación de azúcares o polialcoholes (celobiosa, eritritol, galactosa, glucosa, inositol, maltosa, manitol, rafinosa, trehalosa y xilosa) se utilizó agar base nitrogenado (YNB). La siembra se hizo con una suspensión de las levaduras en agua estéril adicionada de dos o tres gotas de una solución de extracto de levadura al 2% como fuente de vitaminas. El medio TGYA se preparó según Pitt & Hocking (23) y los otros de acuerdo a Déak & Beuchat (9).
A los 3, 7 y 14 días se registró crecimiento, aspecto macroscópico (color, forma y tamaño de las colonias) y microscópico (forma y tamaño celular, posición de los brotes, presencia de pseudomicelio, tipo y número de ascosporas). También se hicieron preparaciones microscópicas teñidas según el método de Wirtz para detectar ascosporas. Con los datos obtenidos se consultaron las claves de Déak & Beuchat (9).

Acción inhibitoria in vitro de levaduras sobre mohos
Las cepas de Penicillium spp. fueron sembradas sobre CYA a 25ºC durante 7 días. Los conidios fueron suspendidos en diluyente estéril y centrifugados a 1.000 rpm durante 10 minutos y luego de volcar el sobrenadante se resuspendieron para preparar una suspensión con 104conidios/mL por recuento en cámara de Neubauer (26). La suspensión de levaduras se llevó a una concentración de 105 células/mL con diluyente estéril.
En placas de MEA y CYA se sembraron 10 µL de la suspensión de levaduras en cada una de dos estrías paralelas separadas 3 cm una de otra, y luego entre ambas 10 µL de la suspensión de esporas de penicilios. A los 7 días se registró el ancho del crecimiento del moho en milímetros y la producción de esporas como abundante, regular, escasa o nula (3 a 0), de acuerdo a la densidad de color comparada con una placa testigo donde solo se cultivó el moho (17).

Acción inhibitoria in vivo de levaduras sobre mohos
Se trabajó con C. sinensis variedad Valencia tardía, calidad mercado interno. Las frutas fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio (solución comercial diluída 1/10) durante 5 minutos y lavados con agua estéril. En cada fruta se hicieron cuatro heridas de 3 mm de diámetro y 2 mm de profundidad, donde se depositaron 10 µL de lasuspensión con 104 conidios de Penicillium/mL y 10 µL de la suspensión con 105 levaduras/mL.
El experimento consistió en probar por triplicado seis levaduras más un testigo por cada patógeno. Las bandejas se colocaron dentro de bolsas plásticas para mantener el ambiente húmedo. Se incubaron a temperatura ambiente durante 7 días. El ensayo se realizó dos veces (26). Después de la incubación se determinó el diámetro de cada lesión y el grado de esporulación en comparación con el testigo del patógeno (14). Se determinó la diferencia significativa de los resultados respecto al testigo mediante la prueba de las comparaciones múltiples complementaria de la de Kruskal-Wallis para α = 0,05 (10).

RESULTADOS

Se recolectaron 22 muestras de C. aurantifolia, 8 de C. limon, 64 de C. sinensis y 7 de C. grandis, y de la superficie de estos frutos se aislaron 13 cepas de mohos patógenos post-cosecha y 17 de levaduras, según se indica en la Tabla 1. En la Tabla 2 se mencionan las levaduras, aisladas de jugos y otras fuentes, cuya acción inhibitoria también fue ensayada.

El crecimiento normal de P. digitatum y P. ulaiense, en las condiciones de ensayo sin levadura, tiene un ancho de 25 y 15 mm respectivamente. El ancho de la estría de P. digitatum osciló entre 2 y 22 mm frente a las cepas de levaduras ensayadas, y la esporulación varió entre nula y similar al testigo (0 a 3), mientras que el ancho de la estría de P. ulaiense fue de 1 a 6 mm frente a las cepas de levaduras probadas, y la esporulación entre nula y similar al testigo, como se indica en las figuras 1 y 2.

Las cepas de levaduras más activas in vitro frente a P. digitatum correspondían a las especies C. cantarellii, C. versatilis, P. anomala y P. subpelliculosa, mientras que las más inhibidoras de P. ulaiense fueron algunas cepas de P. anomala y P. subpelliculosa. Las levaduras B. bruxelliensis, C. zeylanoides, C. albidus y una cepa de P. anomala presentaron menor acción inhibitoria, mientras R. mucilaginosa desarrolló entremezclada con ambos penicilios.
Las figuras 3 y 4 muestran que las cepas de C. boidinii,C. cantarellii, P. anomala y P. subpelliculosa produjeron una reducción significativa del área de las lesiones causadas por P. digitatum y P. ulaiense en comparación con los testigos, según la prueba de las comparaciones múltiples para α = 0,05. Las levaduras más activas frente a P. ulaiense fueron C. cantarellii y P. subpelliculosa pués el área de lesión fue menor y el micelio carecía de esporas.

DISCUSIÓN

Las especies aisladas de frutos cítricos en el presente trabajo pertenecen a los géneros de levaduras comúnmente hallados en los mismos. Según Déak & Beuchat(1996), Pitt & Hocking (23) y Spencer et al. (24) además suelen estar presentes Candida famata, C. guilliermondii, C. holmii, C. krusei, C. magnoliae, C. stellata, C. tropicalis, Pichia fermentans, P. kluyveri, P. membranaefaciens, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Trichosporon moniliforme y Zygosaccharomyces rouxii. Estas especies no son inhibidas por los aceites esenciales y no provocan deterioro cuando son depositadas sobre la superficie “sana” de los cítricos, pero Kloeckera apiculata y C. boidinii poseen acción pectinolítica (9, 21). Por otra parte, C. albidus y C. zeylanoides se suelen encontrar sobre hojas y tallos de cultivos tropicales (1).
En este trabajo, la actividad in vitro e in vivo de las levaduras fue algo distinta según se enfrentaran con P. digitatum o P. ulaiense.C. cantarellii y una cepa de P. subpelliculosa fueron las más activas. El comportamienro de P. anomala y P. subpellicullosa fue variable según las cepas.
Las cepas de las levaduras C. cantarellii y P. subpelliculosa cuya acción inhibitoria in vitro e in vivo sobre los patógenos post-cosecha en frutos cítricos fue comprobada aquí, podrán ser empleadas en la formulación de un producto para biocontrol si nuevos estudios a campo lo confirman.

Agradecimiento

A SECTER, UNJu, por el subsidio recibido.

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Recibido: 7/1/04
Aceptado: 13/12/04