Cátedra de Microbiología y Parasitología, Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Tucumán. Diego de Villarroel 449, Yerba Buena (4107). Tucumán, Argentina.
^*Correspondencia. E-mail: mgferro@fo.unt.edu.ar

RESUMEN
Las veillonellas son cocos gram-negativos anaerobios asociados con salud oral. Para su aislamiento, se han reportado diferentes medios de cultivo. Las colonias de Veillonella spp. producen fluorescencia roja visible con luz ultravioleta, que desaparece en contacto con oxígeno. Esta propiedad sería útil para su identificación presuntiva rápida. Los objetivos de este trabajo fueron: 1- comparar el medio selectivo para Veillonella de Rogosa con los medios de cultivo recomendados por diferentes autores para determinar en cual de ellos se obtiene una mejor recuperación de veillonellas a partir de saliva, ya que esta muestra es generalmente utilizada para determinar la presencia y predominio de esta bacteria; 2- detectar la producción de fluorescencia en estos medios de cultivo como método rápido de identificación. Los medios de cultivo estudiados fueron: medio selectivo para Veillonella, agar Schaedler para anaerobios con vitamina K, agar tioglicolato, agar infusión cerebro corazón, agar Brucella, agar tripteína soja y agar Columbia con y sin el agregado de vancomicina y sangre lacada. La muestra ensayada fue un pool de saliva. Se hicieron recuentos de colonias de veillonellas y de microorganismos totales expresados en UFC/ml de saliva. La mayor recuperación de veillonellas en saliva se obtuvo en el medio selectivo para Veillonella con vancomicina y sangre lacada. Sólo se observó producción de fluorescencia en este medio.
Palabras clave: veillonellas. Saliva. Recuperación. Fluorescencia.

SUMMARY
Recovery of Veillonella from saliva. Veillonella spp. are anaerobic gram-negative cocci associated to oral health. Different types of cultures have been reported for the isolation of these microorganisms. Veillonella spp. colonies produce a red fluorescence, which is made visible through ultraviolet light and disappears in contact with oxygen. This feature would be very useful for rapid presumptive identification. The aims of this study were: 1. to compare the Rogosa selective medium for Veillonella with the cultures recommended by different authors in order to determine best saliva recovery, since this sample is generally used to determine the presence and predominance of this bacteria; 2. to detect red fluorescence production on these different culture media as a rapid method for identification. Selective medium for Veillonella, Schaedler agar for anaerobic bacteria with vitamin K, thioglycollate agar, brain heart infusion agar, Brucella agar, trypticase soy agar, and Columbia agar, all of them with and without the addition of vancomycin, and laked blood were used for this study. The tested sample was a saliva pool. Both, Veillonella colonies, and the total number of microorganisms were counted, and expressed as CFU/ml of saliva. The greatest Veillonella recovery in saliva was obtained with the selective medium for Veillonella with vancomycin and laked blood. The production of fluorescence was only observed in this medium.
Key words: Veillonella. Saliva. Recovery. Fluorescence.

Las veillonellas son cocos gram-negativos que constituyen una fracción muy importante de la población bacteriana total de las superficies epiteliales de la cavidad oral del hombre y son los anaerobios más numerosos en saliva (6, 16).
En la boca edéntula, habitan la lengua y la mucosa bucal y en la boca dentada también están en la placa dental (5). La colonización oral con Veillonella spp. es considerada un indicador de salud oral, por su habilidad para neutralizar la acidez local en la placa dental como se ha demostrado en un modelo animal experimental (9). Las veillonellas se caracterizan por su metabolismo inusual. Son generalmente incapaces de fermentar los hidratos de carbono, pero crecen bien anaeróbicamente sobre lactato, piruvato, malato o fumarato (6). La reducción de la carga acidógena de la placa dental logra al convertir intermediarios metabólicos y productos finales de otras bacterias, tales como ácido láctico y piruvato, en ácidos orgánicos más débiles (9). Así se han encontrado, en la cavidad oral de niños y adultos libres de caries, proporciones inusualmente elevadas de veillonellas (10). Estos microorganismos raramente causan infecciones locales o diseminadas, pero cuando se los encuentra, casi siempre es en infecciones polimicrobianas y asociados con condiciones debilitantes (2).
Las especies de Veillonella figuran entre las primeras colonizantes de la cavidad oral y una vez que han colonizado tienden a persistir en ese ambiente. El requisito para la colonización microbiana inicial es la adherencia bacteriana a las superficies orales. La colonización primaria con Veillonella spp. es independiente de la presencia de dientes erupcionados (7). La adherencia de Veillonella spp. a los tejidos del huésped y a hidroxiapatita cubierta con saliva es pobre, pero participan en coagregaciones interbacterianas, un modo por el cual se fijan vía la unión secundaria a otras bacterias capaces de la adhesión primaria (5, 8). Dado que están involucradas en interacciones beneficiosas en la cascada de colonización oral y en el mantenimiento de la homeostasis, debe conocerse su rol e impacto específico.
Debido a las dificultades prácticas para evaluar el número de microorganismos en la placa dental, se prefiere efectuar los recuentos en saliva, dado que la misma baña todas las superficies y refleja los niveles de microorganismos presentes en la cavidad oral.
Para el aislamiento de estos microorganismos se han reportado diferentes medios de cultivo selectivos y no selectivos. Entre los primeros se encuentra el creado por Morrison Rogosa que contiene lactato de sodio como fuente de carbono (13). Entre los no selectivos usados exitosamente para determinar la flora bacteriana total se destacan, agar Brucella, agar tripteína soja y agar infusión cerebro corazón (agar BHI) (11, 12, 16).
Durante el screening de aislamientos clínicos anaeróbicos de rutina, Chow et al. observaron que las colonias de Veillonella spp. regularmente producían fluorescencia roja visible sobre el agar BHI cuando eran expuestas a luz UV de onda larga (366 nm), fenómeno que revertía al ser expuestas al oxígeno atmosférico. Esta propiedad puede ser útil para la identificación presuntiva rápida de este microorganismo (3). El agregado de sangre lacada, mejora la detección de fluorescencia (14).
Los objetivos de este trabajo fueron: 1-comparar el medio selectivo para Veillonella de Rogosa con los medios de cultivo recomendados por diferentes autores para determinar en cual de ellos se obtiene una mejor recuperación de veillonellas a partir de saliva y 2- detectar la producción de fluorescencia en los diferentes medios estudiados con el fin de efectuar una identificación presuntiva rápida de este microorganismo.
Los medios de cultivo utilizados fueron, medio selectivo para Veillonella (Difco) con vancomicina (Richet) (AVL/V), medio selectivo para Veillonella con vancomicina y 5% de sangre lacada. (AVL/V/S), agar Schaedler (Biokar) para anaerobios con vitamina K y 5% de sangre lacada (Asch/S), agar Schaedler para anaerobios con vitamina K, 5% de sangre lacada y vancomicina (Asch/S/V), agar tioglicolato (Merck) (ATG), agar tioglicolato con vancomicina (ATG/V), agar BHI (Britania) con 5% de sangre lacada (BHI/S), agar BHI con 5% de sangre lacada y vancomicina (BHI/S/V), agar Brucella (Difco) con 5% de sangre lacada (BA/S), agar Brucella con 5% de sangre lacada y vancomicina (BA/S/V), agar tripteina soja (Britania) con 5% de sangre lacada (TSA/S), agar tripteina soja con 5% de sangre lacada y vancomicina (TSA/S/V), agar Columbia con 5% de sangre lacada (ACol/S), agar Columbia (Britania) con 5% de sangre lacada y vancomicina (ACol/S/V) (13). La concentración de vancomicina utilizada fue de 7,5 µg/ml.
Después de esterilizar, se enfriaron los medios a 45 ºC y se agregó la vancomicina, la sangre lacada y la vitamina K (1 µg/ml) a los medios que así lo requerían. Se distribuyeron 20 ml de cada uno en placas de Petri estériles.
Procesamiento de muestras de saliva: se recogieron cinco muestras de saliva sin estimular en ayunas, por el método de escupir en frasco estéril de boca ancha. Se realizó un pool y se preparó una dilución 1/10.000 en extracto de levadura al 0,05%. En cada medio de cultivo estudiado se sembraron 5 ml de la dilución por diseminación con espátula de Drigalsky. Las placas fueron incubadas a 37 ºC en jarra para anaerobios (Oxoid y Merck) usando generadores de anaerobiosis (Anaerogen de Oxoid) durante 72 horas.
Transcurrido ese tiempo se observó la producción de fluorescencia en un ambiente oscuro, iluminando las colonias con una lámpara manual de luz UV de onda larga (366 nm) (modelo 13203, Mikrobiologie, Merck). La lectura se realizó inmediatamente después de extraídas las cajas de la jarra y a los 10 minutos. Posteriormente se midió el tamaño de las colonias de veillonellas, se realizó la observación macro y microscópica y para la identificación se realizó:
a - Coloración de Gram: se observaron cocos gram-negativos aislados, dispuestos en cortas cadenas de 2 a 4 células y en masas, pequeños, con un diámetro de 0,3 a 0,5 µ.
b - Prueba de oxidasa: negativa (1)
c - Prueba de reducción de nitrato: positiva (1)
d - Prueba de tolerancia al oxígeno: confirmó la propiedad de estos microorganismos de ser anaerobios obligados.
Se hicieron recuentos de colonias de veillonellas y de microorganismos totales, por cuatriplicado. Los resultados se expresaron en UFC/ml de saliva.
El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el test de Student.
La mayor recuperación de veillonellas en saliva se obtuvo en el medio selectivo para Veillonella con vancomicina (7,5 µg/ml) y 5% de sangre lacada: 97,0 x 106 UFC/ml de saliva ( p <0,05).
Se obtuvo también una muy buena recuperación en medio selectivo para Veillonella con vancomicina, siendo éste más selectivo: 70,0 x 106 UFC/ml saliva (p<0,05).
Tomando como referencia este último medio, usado frecuentemente para el aislamiento y recuento de veillonellas, se encontró que en los otros medios estudiados hubo una mayor recuperación de microorganismos pertenecientes a otros géneros presentes en saliva, mientras que los recuentos de veillonellas fueron significativamente menores (p<0,05). Figura 1 y Tabla 1.

Se observó desarrollo de colonias de mayor tamaño tanto en el medio AVL/V como en el mismo medio con el agregado de 5% de sangre lacada AVL/V/S. Sólo en éste último se observó producción de fluorescencia, la cual desapareció con la exposición al oxígeno atmosférico (Tabla 1).
El género Veillonella es uno de los primeros colonizadores de la cavidad bucal del hombre y se encuentra en elevado número en diferentes sitios en niños y adultos. La importancia de su presencia en los ecosistemas bucales está relacionada con el mantenimiento de la homeostasis y la capacidad que poseen de neutralizar los ácidos producidos por los microorganismos cariogénicos. Por ello, estas bacterias son consideradas microorganismos benéficos y, desde el punto de vista odontológico, su aislamiento y recuento puede ser una herramienta útil en el diagnóstico y evaluación de programas preventivos orientados al mantenimiento de la salud oral.
En base a los resultados obtenidos, el medio más apropiado para la recuperación de veillonellas a partir de saliva fue el medio selectivo para Veillonella con vancomicina y sangre lacada.
La recuperación de veillonellas en agar Schaedler con sangre y agar Columbia con sangre fue significativamente mayor que los niveles encontrados en estos mismos medios suplementados con vancomicina.
También se encontraron diferencias significativas en los recuentos de microorganismos totales en ambos casos.
Probablemente la vancomicina inhibió a ciertos microorganismos gram-positivos de la saliva productores de lactato. Esto llevaría a una menor disponibilidad de lactato en el medio para ser utilizado por las veillonellas, las que, por su metabolismo particular, utilizan primariamente a este compuesto como fuente de carbono. Esta podría ser la causa de la menor recuperación de veillonellas en estos medios con vancomicina.
En los medios agar tioglicolato con y sin vancomicina los niveles de recuperación de los microorganismos en estudio alcanzaron valores de 44,0 x 10⁶ y 53,0 x 10⁶ UFC/ ml de saliva, respectivamente. Este medio tiene la desventaja que los niveles de recuperación de la microbiota acompañante son elevados. Si bien, entre los medios no selectivos es el más efectivo, sigue siendo la mejor opción el medio agar Veillonella con vancomicina y sangre lacada.
Los resultados obtenidos permiten concluir que los medios de elección para el aislamiento de veillonellas a partir de muestras de saliva son: medio selectivo para Veillonella con vancomicina (7,5 µg/ml) y medio selectivo para Veillonella con vancomicina (7,5 µg/ml) y 5% de sangre lacada.
Las veillonellas orales producen fluorescencia roja en el AVL/V, suplementado con sangre humana lacada y sin el agregado de ácido δ;-aminolevulinico, a diferencia de lo reportado por otros autores que observaron fluorescencia de las especies humanas, V. atypica, V. dispar y V. parvula, en medios conteniendo cualquier tipo de sangre sólo si estaba presente el ácido δ;-aminolevulínico (6).
El agregado de 5% de sangre lacada al medio selectivo (AVL/V/S) favoreció la producción de fluorescencia roja por parte de las colonias de veillonellas, lo cual aceleró su detección.

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Recibido: 08/11/04
Aceptado: 01/02/05