Detección de la actividad de desoxiribonucleasa (DNasa) en cepas de Clostridium chauvoei

G.H. Carloni^1*, L.D. Bentancor², R.A. De Torres³

¹Microbiología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. Chorroarín 280, (1427) Bs. As; ²Inst. Sanidad Ganadera, Perú 1655 (1141) Bs. As; ³Microbiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. Junín 954, (1113) Bs As.
*Correspondencia. E mail:gcarloni@fvet.uba.ar

RESUMEN
La toxina beta de Clostridium chauvoei posee actividad de desoxiribonucleasa (DNasa) y se considera uno de sus principales factores de virulencia. Se detectó su producción a partir de cepas provenientes de aislamientos bovinos, empleando como controles C. chauvoei American Type Culture Collection (ATCC) 10092 y C. septicum y C. perfringens tipo A, ambos aislamientos de laboratorio. La actividad enzimática se evidenció sobre un sustrato sólido con el agregado de DNA y verificando macroscópicamente su degradación. Se desarrolló una metodología sencilla empleando agar comercial para ensayo de DNasa, con agregado de suero equino estéril. Cada cepa se sembró sobre la superficie del medio de cultivo, incubando en atmósfera anaerobia hasta 48 horas a 37 ºC. Los cultivos se sometieron a la acción de ácido clorhídrico (HCl) 1N. La aparición de una zona clara y transparente alrededor y por debajo del desarrollo microbiano se consideró reacción positiva. La actividad enzimática se detectó en 10 de 12 cepas estudiadas y en los controles. El agregado de suero al medio base comercial permitió el desarrollo óptimo de los microorganismos evidenciando con claridad la zona de digestión enzimática.
Palabras clave: C. chauvoei, toxinas, desoxiribonucleasa

SUMMARY
Desoxiribonuclease activity detection in Clostridium chauvoei strains. Beta toxin of C. chauvoei has desoxiribonuclease (DNase) activity which is regarded as one of its virulence factors. The production of DNase was detected in strains isolated from bovines, using as controls C. chauvoei ATCC 10092, and C. perfringens Type A and C. septicum, both laboratory isolates. The enzyme activity was made evident on a DNA substrate observing the macroscopic degradation. A simple methodology was developed using a commercial medium for DNase test, with the incorporation of sterile horse serum. Each strain was streaked on the surface of the medium, incubated in anaerobic atmosphere at 37 ºC for 48 hours. The plates were revealed with HCl 1N. The appearance of a clear and transparent zone around and under the microbial growing was considered a positive reaction. Enzyme activity was detected in 10 of 12 strains and also in the controls. The serum addition to the commercial basal medium allows the optimum development of the microorganism showing the enzymatic digestion zone.
Key words: Clostridium chauvoei, toxins, deoxiribonuclease

Clostridium chauvoei es el agente etiológico del carbunclo sintomático, pierna negra o "mancha" de los rumiantes, de amplia difusión en Argentina. Entre sus factores de virulencia se cita la toxina beta que presenta actividad enzimática principal de desoxiribonucleasa (DNasa). Esta enzima es una proteína estable al calor, responsable de la degradación nuclear de las células musculares y que participa en el proceso de miositis gangrenosa desencadenado por este microorganismo en los individuos afectados (1, 2, 3).
La producción de DNasa resulta un mecanismo de agresión indicativo de patogenicidad en la mayoría de las bacterias que la expresan, incluidos entre ellas los microorganismos del género Clostridium (4).
La detección de DNasa se puede realizar in vitro cultivando el microorganismo sobre un sustrato que contenga DNA y verificando macroscópicamente la degradación del mismo. No se encontró una metodología normatizada para evaluar la producción de esta enzima en clostridios. Las técnicas convencionales no resultaron satisfactorias ya que estos microorganismos son exigentes y requieren un medio enriquecido para su desarrollo, contenido que no aportan los medios descriptos. La adición de colorantes y/o indicadores al medio de cultivo para revelar la digestión enzimática, y la necesidad de enriquecer el mismo con sangre u otros nutrientes que alteren su color o transparencia, producen lecturas erróneas y no resultan aplicables a bacterias gram positivas exigentes, de cultivo anaerobio (2, 4).
Se intentó el desarrollo de una metodología sencilla para evidenciar la producción de esta enzima evitando los inconvenientes citados y que aportara, además, un sustrato óptimo para el crecimiento de los microorga-nismos estudiados.
Para ello se empleó agar para ensayo de DNasa comercial (DNase Test Agar, Merck Cat Nº 1.104449.0500) esterilizado en autoclave a 1 atmósfera durante 15 minutos, con el posterior agregado de 2% de suero equino estéril.
Se estudiaron 12 cepas de C. chauvoei provenientes de aislamientos de origen bovino. Como controles se emplearon las cepas C. chauvoei ATCC 10092 y C. septicum y C. perfringens tipo A, estas últimas provenientes de aislamientos de laboratorio, cuya actividad de DNasa resulta evidente y constante en todas las cepas (1).
Cada cepa a ensayar, proveniente de un cultivo de 24 horas en medio sólido (agar Columbia con 5% de sangre ovina desfibrinada), se sembró en estría sobre la superficie de dos placas del medio de cultivo para detección de DNasa. Ambas placas se incubaron en jarra para anaerobios con atmósfera de 80% nitrógeno y 20% dióxido de carbono a 37 ºC, una placa durante 24 horas y otra hasta 48 horas.
La producción de la enzima se reveló en las placas con cultivos, inundando la superficie con HCl 1N durante 5 minutos que luego se descartó. El HCl precipita el DNA presente, transformando el medio de cultivo translúcido, en opaco (4).
La aparición en el medio de cultivo de una zona clara y transparente alrededor y por debajo del desarrollo microbiano, indicativa de la digestión enzimática, se consideró como reacción positiva. Las zonas donde no se detectó actividad enzimática permanecieron opacas luego de la adición de ClH, no evidenciando la producción de DNasa (4).
La actividad enzimática se pudo detectar en 10 de las 12 cepas estudiadas y en C. chauvoei ATCC 10092, C. septicum y C. perfringens tipo A, empleados como controles.
La detección de DNasa constituye un dato significativo para realizar un diagnostico etiológico y para determinar la virulencia de la cepa bacteriana aislada en el laboratorio.
Su detección es también importante en la etapa de control de calidad de los antígenos empleados en la elaboración de inmunógenos para prevenir el carbunclo sintomático, verificando así la presencia de una fracción antigénica importante en la vacuna a elaborar (5).
El agregado de suero equino al medio base comercial permitió un desarrollo óptimo de los microorganismos estudiados y no dificultó la lectura de la prueba, ya que la zona de digestión enzimática se pudo evidenciar con claridad.
La incubación de los cultivos durante 48 horas permitió un desarrollo microbiano más evidente y por lo tanto, se lograron visualizar mejor los resultados positivos.
Esta adaptación resulta recomendable para realizar una detección rápida y sencilla de la producción de DNasa a partir de cultivos de bacterias gram positivas anaerobias exigentes.

BIBLIOGRAFÍA
1. Bergey's (1986) Manual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins, Baltimore, USA, 1st edition, vol 2, sección 13, p. 1141-1163.         [ Links ]
2. Cortiñas T, Mattar M, Stefanini A (1999) Alpha and beta toxin activities in local strains of C. chauvoei. Anaerobe 5: 297-299.         [ Links ]
3. Glenn Songer J (1998) Clostridial diseases of small ruminants. Vet. Res. 29: 219- 232.         [ Links ]
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schrereckenberger P, Winn W (1997) Diagnostic Microbiology, 5º ed, Lippincott, Filadelphia, p. 553.         [ Links ]
5. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca. Norma Mercosur (1997) Normas Armonizadas para la fabricación y control de vacunas: Resol Nº 12 A 1.4.2, C. chauvoei. Argentina.        [ Links ]

Recibido: 28/3/05
Aceptado: 13/6/05