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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.37 n.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires abr./jun. 2005

 

Supervivencia de Pseudomonas fluorescens en suelos con diferente contenido de materia orgánica

E.B.R. Perotti*, L.T. Menéndez, O.E. Gaia, A. Pidello

Cátedra de Química Biológica. Facultad de Ciencias Veterinarias - Consejo de Investigaciones, Universidad Nacional de Rosario, Casilda, Argentina
*Correspondencia. E-mail: eperotti@fveter.unr.edu.ar

RESUMEN
Pseudomonas fluorescens es una bacteria PGPR (plant growth promoting rhizobacteria), heterótrofa, capaz de combatir fitopatógenos edáficos. Su supervivencia podría estar favorecida por el elevado contenido de materia orgánica del suelo (MOS). Para probarlo, se inocularon, en condiciones de laboratorio, tres cepas de P. fluorescens: UP61, C7R12, y P190 (nativa de Balcarce, Buenos Aires) en suelos rizosféricos de tomate representativos de diferentes zonas de Argentina: suelo Argiudol (Balcarce, y Zavalla, Santa Fe) y suelo Torrifluvens (Cipolletti, Río Negro) (MOS %: 7,2; 4,3 y 2,6 respectivamente). Los resultados indicaron que la supervivencia de P. fluorescens en los suelos Argiudoles fue similar; aunque las pendientes de las curvas de supervivencia en el suelo de Zavalla fueron menores que las observadas en el suelo de Balcarce. La producción de CO2 fue superior en el suelo de Balcarce que en el suelo de Zavalla (4,3 y 2,8 mmol.g-1suelo), esta diferencia podría ser explicada por la existencia de una mayor presión competitiva por parte de la microflora nativa. La supervivencia en el suelo Torrifluvens resultó mínima, lo que sería atribuible a su elevada conductividad eléctrica más que al menor contenido de MOS. La cepa UP61 presentó en todos los casos la mejor supervivencia.
Palabras clave: Pseudomonas fluorescens, supervivencia, materia orgánica del suelo

SUMMARY
Pseudomonas fluorescens survival in soils with different contents of organic matter. Pseudomonas fluorescens are plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). The survival of this inoculated heterotrophic bacterium may be affected by soil organic matter content (SOM). To confirm this hypothesis, three strains of P. fluorescens: UP61, C7R12 y P190 (native of Balcarce, Buenos Aires) were inoculated, in laboratory conditions, into three argentine rhizospheric soils: two Argiudolls (Balcarce, and Zavalla, Santa Fe) and a Torrifluvens (Cipolletti, Río Negro) with different SOM: 7,2; 4,3; and 2,6%, respectibily. The results indicated that the all three isolates survival in general was not different. The slopes of the regression curves in Zavalla soil were very similars, while in the Balcarce soil the strains behaviour were very different. CO2 production was superior in the Balcarce than the Zavalla soil. These results suggest that the situations that affected the survival in the Balcarce soil may be associated with the presence of a larger number of functional microflora compared with Zavalla soil. The survival in the Cipolletti soil was the lowest; independently of the protective effect of the SOM in relation with the capability of survival of the inoculated bacteria, the scarcity of survival in this soil, specially after the great fall observed, is not attributable to the low SOM content, it might be related with its high electric conductivity. The UP61 had the best survival rate in all soils.
Key words: Pseudomonas fluorescens, survival, soil organic matter

INTRODUCCIÓN
Pseudomonas fluorescens es una bacteria PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (4) que posee la capacidad de disminuir la acción de fitopatógenos a través de la producción de sideróforos y antibióticos (7) y puede emplear una gran variedad de sustratos en su metabolismo carbonado (3).
Además, se conoce que cuando se inocula en el suelo modifica el potencial de reducción (Eh) del mismo (9) y que la supervivencia aparece asociada con condiciones reductoras y ligeramente alcalinas en el suelo (8). Por las características mencionadas, se considera que la inoculación de esta bacteria podría disminuir el empleo de los agroquímicos que se emplean en la producción vegetal (5).
Con la hipótesis de que la supervivencia de una bacteria heterótrofa se vería favorecida cuando es inoculada en suelos con un elevado contenido de MO, se estudió, en condiciones de microcosmos, la supervivencia de tres cepas de P. fluorescens luego de ser inoculados en tres suelos rizosféricos argentinos con diferente contenido de MOS.

MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizaron tres experiencias de inoculación en tres suelos diferentes, en condiciones controladas de laboratorio. Los suelos empleados son representativos de distintas regiones geográficas de la Argentina: suelo Argiudol típico (Balcarce, Provincia de Buenos Aires) (Experiencia I), suelo Argiudol vértico (Zavalla, Provincia de Santa Fe) (Experiencia II), y suelo Torrifluvens (Cipolletti, Provincia de Río Negro) (Experiencia III). Algunas características de los mismos se presentan en la Tabla 1. Cada suelo fue inoculado en forma separada con tres aislados de Pseudomonas fluorescens.

Se emplearon mutantes espontáneos de P. fluorescens resistentes a 100 mg.l-1 de rifampicina (Dr. P. Lemanceau), obtenidos a partir de las cepas: UP61 (Dra A. Arias, Uruguay), C7R12 (Dr. P. Lemanceau, Francia) y P190 (Dr. A. Escande, Balcarce, Argentina).
Las mutantes se obtuvieron a partir del aislamiento de colonias crecidas sobre medio sólido King B (2) adicionado con rifampicina (100 mg.l-1) C (Lemanceau, comunicación personal). El mantenimiento de las bacterias se realizó a –80 °C en medio King B líquido con rifampicina (100 mg. l-1) y glicerol al 50%. La resistencia a rifampicina se usó como un marcador específico para realizar el seguimiento de la sobrevivencia de las bacterias (6).
Cada uno de los aislados se hizo crecer en medio King B líquido con agitación (100 rpm) durante 24 hs. Las células fueron cosechadas por centrifugación (3000g, 4°C) y lavadas tres veces en agua destilada estéril; luego se resuspendieron en agua destilada estéril.
El estudio se realizó en microcosmos conformados por cajas de Petri de 10 cm de diámetro que presentaban un orificio lateral de 5 mm. Cada microcosmo, que contenía 65 g de suelo y tres plántulas de tomate, fue inoculado con 108 bacterias por gramo de suelo. Luego de la inoculación, los microcosmos fueron ubicados en cámara de crecimiento vegetal (20/25 °C noche/día; iluminación 274 µE.m-2.s-1) en soportes especiales para permitir que mantuvieran una inclinación de 45° con el objeto de facilitar la visualización del sistema radicular. Las experiencias (I, II y III) consistieron en tres tratamientos inoculados (uno con cada uno de los aislados) y un tratamiento control sin inocular; cada uno de los tratamientos se repitió cuatro veces.
La supervivencia de las cepas inoculadas fue evaluada durante el transcurso de los experimentos (días 1, 4 y 11 desde la inoculación en suelo de Balcarce; días 2, 5 y 11 en suelo de Zavalla, y días 3, 10 y 20 en suelo de Cipolletti). En cada momento de muestreo se cuantificó la presencia de unidades formadoras de colonias (UFC) a partir de la siembra de diluciones seriadas del suelo inoculado. La siembra se realizó en cajas de Petri sobre medio King B sólido suplementado con rifampicina
(100 g. l-1). Las cajas fueron incubadas a 25 °C durante 48 hs. El número de UFC se expresó como logaritmo decimal.
La producción de CO2 de los suelos se evaluó a partir de la incubación de 3 gramos de suelo humectado a capacidad de campo, a 30 °C durante 72 hs en la oscuridad, en tubos con tapa a rosca (22 cm3) y orificio con septum de goma para facilitar la extracción de los gases. La producción de CO2 durante ese período fue medida en un cromatógrafo de gases (Konik Instrumens, Barcelona), equipado con columna de Porapak Q®, utilizando He como gas carrier y detector de conductividad térmica. Las determinaciones fueron realizadas por duplicado.
La diferencia entre las medias aritméticas fue analizada por análisis de la variancia, y separada por test de Tuckey (10).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos indican que la cepa UP61 presentó la mejor supervivencia en los distintos suelos, superando el comportamiento tanto de la cepa C7R12 como la de la cepa P190, que es nativa del suelo de Balcarce. En los dos suelos Argiudoles estudiados, que poseían cantidades significativamente diferentes de MOS (Tabla 1), la supervivencia de los tres aislados de P. fluorescens fue muy similar. Sin embargo, mientras en el suelo de Zavalla las pendientes de las curvas de regresión mostraron semejanzas entre los tres aislados (UP61: -0,086; C7R12: -0,087 y P190: -0,09 (Figura 1), en el suelo de Balcarce se observaron diferencias importantes (-0,104; -0,135 y -0,194, respectivamente) (Figura 2).

El suelo de Balcarce, que poseía un contenido de MOS superior al suelo de Zavalla (7,2%, contra 4,3%) (Tabla 1), tuvo a su vez una producción de CO2 también superior (4,3 y 2,8 mmoles.g-1 suelo. 24 hs-1, respectivamente; p <0,001) (Figura 3). Estos resultados sugieren que en el suelo de Balcarce existe una microflora cuyo componente numérico y/o funcional es bastante elevado comparado con el suelo de Zavalla y, por lo tanto, que las situaciones a las que fueron enfrentados los aislados de P. fluorescens inoculados en el suelo de Balcarce afectaron su supervivencia.
En el suelo Torrifluvens, que es el que posee condiciones ácido-base más adecuadas para la supervivencia de P. fluorescens (8), menor contenido de MOS en relación con los dos suelos argiudoles (Tabla 1), e igual producción de CO2 que el suelo de Zavalla (Figura 3), la supervivencia de los tres aislados resultó más baja (Figura 4). En el último muestreo no se observaron UFC de ninguno de los tres aislados. Independientemente del posible efecto protector de la MOS en relación con la capacidad de un inóculo para sobrevivir al introducirlo en el suelo, la escasa supervivencia observada en el suelo Torrifluvens (y en especial el descenso abrupto en el número de microorganismos), no se debería atribuir al bajo contenido de MOS, mientras no se compruebe que la elevada conductividad eléctrica que presenta (Tabla 1), no atenta contra el desarrollo y el establecimiento de las cepas introducidas, ya que como señalaron distintos autores, el elevado contenido de electrolitos puede ejercer un efecto depresivo directo sobre el componente numérico de una población bacteriana (1).

BIBLIOGRAFÍA
1. Domergues I, Mangenot F Ecologie Microbiènne du sol (1974) Masson et Cie., París, p. 795.
2. King EO, Ward WK, Raney DE (1954) Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307.
3. Latour X, Lemanceau P (1977) Métabolisme carboné et énergétique des Pseudomonas spp. fluorescents sapro-phytes à oxydase positive. Agronomie. 17:427-443.
4. Lemanceau P (1992) Effects bénéfiques de Rhizobactéries sur plantes: exemple des Pseudomonas spp fluorescens. Agronomie. 12: 413-434.
5. Lemanceau P (2001) Reduction of the chemical inputs in a vegetable crop by use of beneficial rhizospheric micro-organisms. Final report. INCO-DC. International Coo-peration with Developing Countries Contrat number: ERBIC 18CT970180 (1994-1998).
6. Mirleau P, Delorme S, Philippot L, Meyer JM, Mazurier S, Lemanceau P (2000) Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology, 34: 35-44.
7. Paul EA, Clark FE (1989) Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, INC. UK, p. 275.
8. Perotti EBR, Cozacov S, Menéndez LT, Pidello A (2000) Redox state and pH on Pseudomonas fluorescens survival. In: Poster Abstracts: 5th International PGPR Workshop, Códoba, Argentina 30 October-3 November, 2000, p. 99.
9. Pidello A (2003) Effect of Pseudomonas fluorescens and pyoverdine production on the soil redox status. Plant & Soil. 253: 373-379.
10. Pimentel Gómez F (1978) Curso de estadística experimental. Ed. Hemisferio Sur, Buenos Aires, p. 323.
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Recibido: 8/11/04
Aceptado: 13/6/05