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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.37 n.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jul./sep. 2005

 

Efecto citotóxico en colon humano de Escherichia coli enterohemorrágico aislado de terneros con diarrea sanguinolenta

V. Pistone Creydt1, A. Venzano2, D.A. Vilte2, E.C. Mercado2, C. Ibarra1*

1 Depto de Fisiología, Facultad de Medicina, UBA. Paraguay 2155, 7mo piso, 1121 Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Patobiología, CICVyA, INTA, Los Reseros y Las Cabañas, 1686 Hurlingham, Pcia. de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: ibarra@fmed.uba.ar

RESUMEN
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es el patógeno emergente en alimentos de mayor impacto, siendo su principal reservorio el ganado bovino. STEC puede causar diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico. El presente trabajo estudió la acción citotóxica de dos cepas de STEC aisladas de heces de terneros diarreicos en colon humano in vitro. Los fragmentos se montaron como un diafragma en una cámara de Ussing y se incubaron con las cepas patógenas. El flujo neto absortivo de agua (Jw) disminuyó y la corriente de cortocircuito (Isc) aumentó significativamente (P < 0,01) con respecto al control negativo. Los tejidos presentaron erosión de la mucosa, exfoliación del epitelio, y presencia de pseudomembranas en el lumen. A nivel de la lámina propia se observaron lesiones circulatorias leves. Una moderada infiltración de neutrófilos se observó en el lumen y en las células epiteliales. Las criptas colónicas no se vieron afectadas. El grado de lesión fue similar en ambas cepas experimentales. Este es el primer estudio que demuestra que cultivos de cepas de STEC aisladas de ganado bovino producen efectos citotóxicos en colon humano in vitro.
Palabras clave: Escherichia coli enterohemorrágico, colon humano, diarrea sanguinolenta, terneros

SUMMARY
Cytotoxic effect in human colon of enterohemorrhagic Escherichia coli isolated from calves with bloody diarrhea. Shiga toxin-producing E. coli (STEC) is one of the most important emergent pathogen in foods, being its main reservoir bovine cattle. STEC can cause diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic-uremic syndrome. The present work have studied the cytotoxic action in human colon of cultures of two STEC strains isolated from faeces of calves with bloody diarrhea. Colonic mucosa was mounted as a diaphragm in a Ussing chamber and incubated with the cultures of pathogenic strains. Net water flow (Jw) decreased and the short-circuit current (Isc) increased significantly (p < 0,01) compared to negative control. Tissues showed an erosion of the mucose, epithelial exfoliation, and presence of pseudo-membranes in the lumen. Mild circulatory lesions were observed in the lamina propia. A moderate neutrophils infiltration was observed in the lumen and into the epithelial cells. Colonic crypts were not disrupted. Both experimental strains caused a similar lesion on colon tissues. This is the first study that shows that cultures of STEC strains isolated from bovine cattle produce cytotoxic effects in vitro in human colon.
Key words: enterohemorrhagic Escherichia coli, human colon, bloody diarrhea, calves

INTRODUCCIÓN
Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es el patógeno emergente en alimentos de mayor impacto, siendo su principal reservorio el ganado bovino (5, 19-21). STEC puede causar diarrea acuosa o sanguinolenta, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH) (10). En Argentina, el SUH es la principal causa de insuficiencia renal aguda en niños menores de 5 años (25), y si bien el origen de estas infecciones se asoció al consumo de productos cárnicos y lácteos, la relación entre las cepas de STEC de origen humano y bovino no está totalmente dilucidada.
Estudios experimentales demuestran que cepas de STEC patógenas en humanos colonizan el tracto intestinal de terneros y pueden causar diarrea (1). Los daños observados tanto en el intestino como en los riñones de niños infectados, son ocasionados por productos bacterianos potenciados por mediadores inflamatorios, siendo la toxina Shiga tipo 1 o 2 (Stx1, Stx2) necesaria para el desarrollo del SUH (15).
Stx está constituida, en sus diferentes isoformas, por una subunidad A y cinco subunidades B que forman una estructura pentamérica. Esta última une Stx a receptores globotriaosilceramida (Gb3), presentes en algunas células eucariotas, para luego ser endocitada siguiendo un camino de transporte retrógrado a la secreción de proteínas. En el interior de la célula, la subunidad A inhibe la síntesis de proteínas por inactivación de la subunidad ribosomal 60S (28) y la subunidad B puede desencadenar procesos apoptóticos (4, 28).
Otros factores de virulencia contribuyen a la patogenicidad de algunos STEC, los que reciben el nombre de E. coli enterohemorrágico (EHEC), como aquéllos codificados por el LEE (locus of enterocyte effacement) (18). El análisis de la secuencia del LEE reveló 41 marcos de lectura que comprenden al menos 3 regiones funcionales principales: una que codifica el sistema de secreción tipo III, otra que contiene el gen eae que expresa la intimina y una tercera que codifica los productos secretados Esp (E. coli secreted proteins) necesarios para la transducción de señales en la célula del huésped. Se sabe también que las proteínas EspA (13), EspB (6) y EspD (14) son exportadas por el sistema de secreción de tipo III. La intimina es determinante de la formación de la lesión A/E (attaching-and-effacing), característica de la interacción de STEC con las células intestinales. También se ha descripto como factor de virulencia una toxina con características de hemolisina, la cual está codificada por el operón hly de EHEC (27).
El objetivo de este trabajo fue evaluar la acción citotóxica en colon humano in vitro de cepas STEC aisladas de heces de terneros con diarrea sanguinolenta.
Este trabajo fue presentado en el XVII Congreso Latinoamericano de Microbiología y X Congreso Argentino de Microbiología realizado en la Ciudad Autónoma de Buenos aires, del 17 al 21 de Octubre de 2004.

MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas
Se estudiaron dos cepas de E. coli aisladas en nuestro laboratorio de heces de terneros diarreicos provenientes de rodeos de la provincia de Buenos Aires: E. coli cepa 97/23-A (O26:H11; stx2; eae-β EHEC-hlyA+) y E. coli cepa 01/289-1 (O111:H-; stx1; eae-θ EHEC-hlyA+) (19). E. coli K12 DH5α (stx1-; stx2-; eae-; EHEC-hlyA-) fue usada como control negativo. Para los ensayos se utilizaron cultivos de las bacterias en fase de crecimiento exponencial (DO600 = 0,5) en medio LB a 37 °C con agitación.

Obtención y preparación de los fragmentos colónicos humanos
Los fragmentos de colon se extrajeron de piezas quirúrgicas obtenidas de operaciones a pacientes adultos con cáncer, bajo su consentimiento y con la aprobación del comité de ética del hospital. Inmediatamente después de la ablación, los tejidos de la zona macroscópicamente sana fueron transladados al laboratorio en una solución Ringer-alto potasio (en mM: 120 KCl, 10 NaHCO3; 1,2 MgCl2; 1,2 CaCl2; 1,2 K2HPO4; 0,2 KH2PO4; 25 glucosa) a 4 °C para preservar las funciones de transporte. Luego la mucosa colónica fue separada del resto del tejido y montada como un diafragma en una cámara de Ussing modificada (8) de 1,76 cm2 de superficie, la cual permitió registrar simultáneamente la corriente de cortocircuito (Isc) y el flujo neto de agua (Jw) a través del colon. El tejido se mantuvo a 37 °C bajo una presión hidrostática de 10 cm de agua y se burbujeó con una mezcla gaseosa de 95% O2 /5% CO2 para mantener las condiciones fisiológicas normales.

Flujo neto de agua y parámetros eléctricos
El Jw (µl/min.cm2) a través de la mucosa colónica se registró automáticamente mediante un dispositivo puesto a punto en el laboratorio (2). Este dispositivo mide el desplazamiento de una solución coloreada contenida en un capilar conectado al lado mucoso del tejido. La sensibilidad del instrumento es de ± 50 nl.
Simultáneamente se registró la Isc (µA/cm2) mediante un sistema de fijación de voltaje que anula la diferencia de potencial eléctrico entre los compartimentos mucoso y seroso del tejido.
Cuando los parámetros medidos se estabilizaron, se agregaron 200 µl de cultivo de las cepas en estudio o del control negativo al lado mucoso del tejido (tiempo 0) y se continuaron los registros durante 60 min. Los datos se presentan como ΔJw, donde ΔJw = Jw (a tiempo dado) - Jw (a tiempo 0) y ΔIsc, donde ΔIsc = Isc (a tiempo dado) - Isc (a tiempo 0).

Estudios por microscopía óptica
Una vez finalizados los experimentos, los tejidos se fijaron en formaldehído 4% P/V en PBS durante 24 hs. Luego se cortaron longitudinalmente, deshidrataron e incluyeron en parafina. Cortes de 2-4 µm incluyeron con hematoxilina-eosina y se observaron mediante un microscopio óptico (400? y 1000?).

Análisis estadístico
Los resultados se informaron como la media ± 1 error estándar. La significancia estadística entre dos valores medios obtenidos para dos condiciones experimentales se calcularon mediante la prueba "t" de Student. Para el análisis estadístico de las diferentes curvas se utilizó ANOVA de un factor, para evaluar los cambios de Jw e Isc de cada una de las cepas en función del tiempo, y ANOVA de 2 factores para estudiar el comportamiento de las cepas experimentales y controles entre sí (24). Valores de P < 0,05 se consideraron significativos.

RESULTADOS
Efecto citotóxico de las cepas en estudio sobre la absorción intestinal de agua e iones

En los fragmentos de colon humano montados en la cámara de Ussing se observó un Jw neto absortivo de 0,38 ± 0,08 µl/min.cm2 y una Isc de 13,7 ± 4,1 µA/cm2 en condiciones basales.
La incubación posterior de la mucosa colónica con el cultivo de la cepa experimental, E. coli 97/23-A mostró una inhibición del Jw neto absortivo dependiente del tiempo de incubación (Figura 1). Esta inhibición resultó significativa a partir de los 10 min de incubación (P < 0,001 vs control). El mismo efecto se obtuvo con el cultivo de la cepa E. coli 01/289-1 (P < 0,01 vs control) aunque la inhibición del Jw fue menor que la observada con la cepa E. coli 97/23-A. La comparación de las curvas obtenidas con ambas cepas mostró una diferencia significativa a partir de 30 minutos de incubación (p < 0,05). La cepa usada como control negativo no modificó el Jw durante el transcurso de la experiencia (Figura 1).

Con respecto a la Isc se observó un aumento en función del tiempo de incubación con ambas cepas experimentales (Figura 2). Las curvas obtenidas fueron significativa mente diferentes respecto de la cepa control negativo (P < 0,01). El aumento de Isc fue mayor cuando el tejido se incubó con cultivo de E. coli 01/289-1. A partir de los 40 min de incubación la diferencia en los valores de Isc entre las cepas patógenas se hizo significativa (P < 0,05).

Estudios histológicos
En los tejidos incubados 30 min con E. coli 97/23-A y E. coli 01/289-1 se observó daño histológico consistente en segmentos de tejidos con erosión de la mucosa, exfoliación del epitelio, y presencia de pseudomembranas en el lumen compuestas por células epiteliales necróticas, moco, neutrófilos y bacilos (Figura 3A y 3B). A nivel de la lámina propia sólo se observaron lesiones circulatorias leves, consistentes en edema e hiperemia, sin hemorragias. Las criptas colónicas no se vieron afectadas. En el lumen y en la superficie intestinal se observó una moderada infiltración de neutrófilos. El grado de lesión fue similar en el caso de la cepa 01/289-1 (datos no mostrados). En los tejidos incubados con el cultivo de la cepa control negativo se observó la mucosa con la histoarquitectura conservada (Figura 3C).

DISCUSIÓN
La interacción de STEC con la mucosa intestinal ha sido estudiada en modelos animales y líneas celulares, empleando técnicas in vivo e in vitro. El empleo de la cámara de Ussing nos permitió observar y cuantificar el efecto fisiológico de cultivos de cepas STEC aisladas de terneros diarreicos sobre tejido colónico humano. El efecto inhibitorio sobre el Jw neto absortivo registrado con ambos cultivos de STEC podría ser atribuido a la Stx presente en el medio de cultivo. En estudios previos se demostró que Stx2 inhibe la absorción neta de agua en colon humano in vitro y que factores adicionales presentes en los preparaciones crudas de Stx2 incrementaron el efecto de la toxina (8). La comparación de las curvas de absorción en este trabajo demostró una diferencia significativa entre ambas STEC a partir de los 30 min de incubación. Esta diferencia podría deberse al tipo de Stx expresada por las cepas en estudio a partir de que Stx2 fue descripta como más potente que Stx1 en células endoteliales (12). También podría ser consecuencia de la concentración de Stx en los cultivos utilizados teniendo en cuenta que el efecto de Stx2 sobre Jw es función directa de su concentración en el medio (24) o de la eventual presencia de factores bacterianos que ejerzan una acción sinérgica con Stx (17).
Por otra parte, el aumento en la Isc obtenido con ambos cultivos de STEC no podría adjudicarse a la acción de Stx ya que se ha demostrado que la toxina, contrariamente a lo que ocurre con muchas enterotoxinas, no modifica por sí sola la Isc (24). La Isc es una medida de la resistencia transepitelial y aumenta cuando se produce un aumento de la actividad aniónica secretoria y/o la ruptura de la integridad de la barrera epitelial, ya sea por mecanismos específicos o como resultado de la respuesta inflamatoria. El aumento de la Isc podría ser entonces consecuencia de la interacción de STEC con las células epiteliales, aunque la presencia de otras toxinas no puede ser descartada. Philpott y col. (23) demostraron que la adherencia de E. coli O157:H7 a la línea celular intestinal T84 resulta en una activación de la proteínquinasa C que modifica la integridad de la barrera epitelial y conduce a la caída de la resistencia transepitelial y el aumento de la Isc. También se informó un aumento de la secreción de cloruros por adenosina, un potente mediador de la secreción intestinal, asociado a la respuesta inflamatoria (16). La adenosina se formaría a partir de 5'AMP liberado al lado luminal por los polimorfonucleares que migran estimulados por interleuquina 8 (IL-8) (7). Recientemente se demostró que las Stxs estimulan la secreción de IL-8 por las células epiteliales (29). Nuevos experimentos serán necesarios para establecer la interacción de Stx con los eventos que llevan a la adhesión bacteriana y determinar su relación con las alteraciones en el movimiento de iones y agua que conducen a la diarrea acuosa observada en los niños infectados con STEC.
Las observaciones microscópicas de los tejidos expuestos a los cultivos de STEC mostraron una histopatología similar a la observada en íleon y colon de terneros infectados por EHEC (11, 26) y en biopsias de colon en casos de colitis asociada a E. coli O157:H7 en humanos (9). En nuestras experiencias no se observó adherencia bacteriana extensa o focalizada al epitelio colónico al cabo de 1 hora de incubación. Recientemente, Philips y col. (22) demostraron que E. coli O157:H7 que expresa intimina gama puede unirse y causar lesión tipo A/E especialmente a nivel del epitelio superficial a las placas de Peyer del intestino delgado. La colonización podría extenderse a partir de los sitios de adherencia inicial a otros sectores de la mucosa intestinal, como se demostró con una cepa enteropatógena en conejo (3). Estos resultados explicarían por qué estudios histológicos de biopsias de pacientes con colitis hemorrágica por E.coli O157:H7 han mostrado un daño extensivo de la mucosa colónica (9). Sin embargo, aún no se conocen los sitios de adhesión intestinal de las intimina beta y theta, expresadas por las STEC empleadas en este trabajo.
Los estudios de adhesión de STEC a cultivo de líneas celulares intestinales como la T84 demuestran que menos del 5% de bacterias se adhieren a la célula huésped luego de 1 hora de infección (30). En consecuencia, la destrucción del tejido que observamos al poner en contacto las bacterias con el tejido colónico in vitro al cabo de 1 hora de incubación podría responder a la rápida acción de Stx1 o Stx2 secretada por las STEC al medio de cultivo más que a la adhesión bacteriana. Sin embargo, la contribución a esta patología de la Stx circulante y de la capacidad de desarrollar la lesión A/E aún no está bien dilucidada.
Los resultados obtenidos demuestran que cepas de STEC aisladas de diarreas sanguinolentas en terneros, son capaces de producir daños funcionales y estructurales en colon humano in vitro.
Estos estudios permiten comparar la citotoxicidad en tejidos humanos de cepas de STEC aisladas de bovinos y contribuyen a establecer una relación epidemiológica funcional entre el ganado bovino sospechado de ser la fuente de STEC y el humano susceptible de ser infectado.

Agradecimientos: Los autores agradecen al Dr. Alfredo Graziano y a la Sra. Patricia Faciano por su asistencia en la obtención de los fragmentos de colon humano en el Hospital de Gastroenterología "Carlos B. Udaondo", a la Sra. Ana M. Elizondo y al Sr. Daniel Funes, del Instituto de Patobiología, CICVyA, INTA, por su asistencia técnica.

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Recibido: 25/10/04
Aceptado: 16/08/05