Comparacion de 3 técnicas para el diagnóstico de la neumocistosis pulmonar en pacientes con SIDA

A.J. Bava, D. Moreno, E. Bellegarde

Sección Parasitología. Hospital de Infecciosas "Francisco Javier Muñiz". Uspallata 2272, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
* Correspondencia. E-mail: javibava@biol.unlp.edu.ar

RESUMEN
Debido a la falta de desarrollo in vitro de Pneumocystis jiroveci el diagnóstico de la neumocistosis pulmonar (PCP) se realiza fundamentalmente mediante la microscopia. Se comparó la eficacia de 3 métodos de diagnóstico de la PCP en 111 lavados broncoalveolares, pertenecientes a igual número de pacientes con SIDA y diagnóstico presuntivo de PCP, internados en diferentes salas del Hospital Muñiz. Preparaciones en fresco, una modificación rápida de la técnica de Grocott e inmunofluorescencia directa (IFD) con anticuerpos monoclonales fueron empleadas para el diagnóstico de PCP sobre preparaciones de los materiales clínicos. Se obtuvieron iguales resultados con las 3 técnicas en 105 (93,6%) muestras (15 positivas y 90 negativas); en 3 (2,7%) la IFD fue positiva cuando las otras dos fueron negativas y en otras 3 (2,7%), la coloración de Grocott fue negativa cuando las otras dos técnicas resultaron positivas. En los materiales investigados, debido a la abundancia de P. jiroveci, la búsqueda de "estructuras en panal de abejas" en preparaciones al estado fresco se adapta perfectamente como prueba tamiz. La coloración de Grocott permite no sólo el diagnóstico de la PCP sino de otras micosis, y la IFD, por su elevado costo, puede emplearse cuando las otras técnicas son negativas.
Palabras clave: neumocistosis pulmonar, diagnóstico de la neumocistosis, Pneumocystis jiroveci, Gomori-Grocott, SIDA

SUMMARY
Comparison of 3 tests for the diagnosis of pulmonary pneumocystosis in AIDS patients. Since Pneumocystis jiroveci cannot be grown in vitro, laboratory diagnosis of pulmonary pneumocystosis (PCP) has been based mainly upon microscopy. The usefulness of 3 diagnostic methods of PCP was compared in 111 bronchoalveolar fluids belonging to an equal number of AIDS patients assisted in different wards of the Muñiz Hospital. Wet mount preparations, a rapid modification of Grocott technique and the direct immunofluorescence (DIF) with monoclonal antibodies were compared for the diagnosis of PCP on smears of clinical samples. Similar results (15 positive and 90 negative) were obtained with these three techniques in 105 (93,6%) of the studied samples; in 3 (2,7%) cases the DIF was positive while the other techniques were negative, and in other 3 (2,7%), the Grocott stain was negative when the other two techniques were positive. In the investigated samples, due to the abundance of P. jiroveci, the searching of "honeycombs" structures in wet mount preparations is perfectly adaptable as screening test. The Grocott stain showed to be useful for the diagnosis of other mycoses, and the DIF, due to its high cost, can be employed when the other techniques are negative.
Key words: pulmonary pneumocystosis, pneumocystosis diagnosis, Pneumocystis jiroveci, Gomori-Grocott, AIDS

Debido a la falta de desarrollo continuo "in vitro" del agente causal de la neumocistosis pulmonar (PCP), el diagnóstico de esta patología se realiza de preferencia mediante la visualización microscópica de Pneumocystis jiroveci (P. jiroveci) en los materiales clínicos (1).
Métodos más sofisticados, como los que emplean técnicas moleculares para detectar la presencia de ácidos nucleicos de P. jiroveci en los materiales clínicos, no se hallan aún disponibles para su aplicación en laboratorios de baja complejidad (12).
Las posibilidades de diagnóstico de la PCP varían con el método de visualización microscópica empleado, así como con el tipo de material respiratorio investigado. Respecto de este último, el estudio de secreciones obtenidas mediante el lavado broncoalveolar (BAL) es el que mejores resultados produce (5).
Las técnicas de coloración como las de Grocott (7), azul de toluidina O (6) o Gram Weigert (4) revelan la presencia de los tradicionalmente llamados quistes de P. jiroveci, mientras que la de Giemsa y similares (8), hacen lo propio con los trofozoitos del microorganismo. Además, la visualización en fresco permite identificar estructuras de origen intraalveolar con aspecto de "panal de abejas", características de la PCP (2), y la IFD, reconocer tanto a los trofozoitos como a los quistes de P. jiroveci (9).
El propósito de este estudio es comparar la utilidad de 3 diferentes técnicas de diagnóstico de la PCP, en BALs pertenecientes a pacientes con SIDA y diagnóstico presuntivo de neumocistosis, internados en diferentes salas del Hospital Muñiz.
Se comparó la eficacia de 3 métodos de diagnóstico de la PCP en 111 muestras de secreciones respiratorias obtenidas por BAL, pertenecientes a igual número de pacientes con SIDA y diagnóstico presuntivo de PCP internados en diferentes salas del Hospital Muñiz, entre agosto y diciembre de 2004.
Los BALs, contenidos en tubos de centrífuga de plástico con tapa a rosca, en cantidad aproximada a los 10 ml cada uno, fueron centrifugados a 1.500 rpm durante 15 min. Se procedió luego a realizar las correspondientes preparaciones para la visualización microscópica con pequeñas alícuotas del concentrado obtenido.
Como métodos de diagnóstico se emplearon la visualización de estructuras con forma de "panal de abejas" en preparaciones en fresco, montadas entre porta y cubreobjetos (2), una modificación rápida de la técnica de metenamina plata de Gomori-Grocott (5) aplicada sobre extendidos fijados con calor y la inmunofluorescencia directa (IFD) con anticuerpos monoclonales (Merifluor-Pneumocystis. Meridian. Diagnostic Inc. Cincinnati. Ohio. USA) (9).
Para la técnica de IFD, a manera de síntesis, se colocó una alícuota del concentrado del material sobre un portaobjetos para inmunofluorescencia, provisto por el fabricante, se fijó con acetona, se cubrió con el reactivo de detección (anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína) y se incubó a 37 °C en cámara húmeda durante 30 min. Se lavó luego el portaobjetos con agua destilada, se secó al aire y se efectuó la lectura en un microscopio de epifluorescencia (Alphaphot modelo 2 YS2H, Nikkon. Japón) a una longitud de onda de 490-500 nm y un filtro de barrera de 510-530 nm. Los resultados fueron interpretados según las instrucciones del fabricante.
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1, en la cual puede apreciarse que 105 (94,6%) de las muestras investigadas dieron lugar a resultados similares con la aplicación de las 3 técnicas (13,5% de las muestras fueron positivas y 81,1% negativas).

Los resultados discordantes se observaron en las 6 (5,4%) muestras restantes; en 3 (2,7%) de ellas la IFD dio resultado positivo cuando las otras 2 técnicas fueron negativas, mientras que en las 3 (2,7%) restantes, la coloración rápida de Grocott fue negativa, a pesar que las otras dos técnicas resultaron positivas. Con el empleo simultáneo de los 3 métodos, cerca del 20% de los materiales estudiados resultaron positivos para P. jiroveci.
La elevada carga microbiana presente en las muestras pertenecientes a los pacientes con SIDA, facilita de manera apreciable la aplicación de los métodos de diagnóstico basados en la visualización microscópica (10). Sing et al. no encontraron ventajas adicionales en la aplicación de la PCR al diagnóstico de la PCP en BALs de este tipo de pacientes respecto de las coloraciones habitualmente empleadas (13).
En los materiales aquí investigados, la búsqueda de "estructuras en panal de abejas" en preparaciones en fresco, una técnica rápida, de bajo costo y accesible a los laboratorios de baja complejidad, se mostró segura para el diagnóstico de la PCP y se adaptó perfectamente como prueba tamiz. Sólo requirió de un entrenamiento previo del observador a los efectos de evitar la confusión de las estructuras con forma de "panal de abejas" con otros elementos similares, eventualmente presentes en las muestras (2). Adicionalmente, el estudio de las preparaciones en fresco permite reconocer elementos fúngicos de importancia diagnóstica en otras micosis diferentes de la PCP.
Respecto de la modificación rápida de la técnica de metenamina plata de Grocott (5), que evidencia la presencia de quistes de P. jiroveci, la misma ha dado en nuestras manos resultados similares a la técnica original (Bava AJ & Postai E, datos no publicados) cuando fue comparada en un estudio a doble ciego en 100 BALs pertenecientes a pacientes con SIDA.
La coloración de Grocott ha mostrado una sensibilidad menor a otras técnicas de diagnóstico de la PCP (cercana al 80%) pero una especificidad cercana al 100%, lo cual nos permite certificar con ella los hallazgos obtenidos en un primer momento con la IFD o la observación en fresco de "estructuras en panal de abejas" (11).
Si bien esta modificación rápida requiere para su implementación de algunos reactivos que deben incorporarse ex profeso a la batería de colorantes de los laboratorios de baja complejidad, nos ha permitido en diversas oportunidades la detección de otros elementos fúngicos de importancia diagnóstica, tales como levaduras capsuladas (Cryptococcus neoformans), pequeñas e intracelulares (Histoplasma capsulatum) o multibrotantes (Paracoccidioides brasiliensis) y también filamentos (Aspergillus spp.), además de los quistes de P. jiroveci.
Por lo dicho, y teniendo en cuenta las características propias de los pacientes internados en nuestro hospital y la variedad de patologías infecciosas que eventualmente ellos pueden padecer, preferimos la técnica de Grocott a otras coloraciones que sólo ponen en evidencia los quistes de P. jiroveci (5-6).
En oportunidades hemos empleado la coloración de Giemsa, aunque la misma no ofreció, por lo menos para el diagnóstico de la PCP en nuestros pacientes, mayores ventajas que las técnicas antes mencionadas. Esta coloración, usada en micología fundamentalmente para destacar la presencia de levaduras intracelulares de Histoplasma capsulatum, reveló en manos de Procop et al. una sensibilidad baja, cercana al 50% (11).
La IFD, reconocida como la técnica con mayor sensibilidad para el diagnóstico de la PCP en múltiples estudios, ha sido sin embargo referida por Procop como poseedora de una especificidad levemente menor (99,6% vs. 94,7%) respecto de la coloración de Grocott (11). En los pacientes aquí estudiados permitió el diagnóstico de PCP en 3 casos que no pudieron confirmarse con las otras dos técnicas, los cuales, además de la sospecha clínica y radiológica de PCP, evolucionaron favorablemente con la mediación anti -Pneumocystis. Su elevado costo y el requerimiento de un microscopio de epifluores-cencia, hacen de la IFD un método accesible sólo para laboratorios de mayor complejidad.
Tomando como referencia la IFD, debido a sus reconocidas elevadas sensibilidad y especificidad (1, 4, 9 11), la microscopia en fresco mostró una sensibilidad y especificidad del 85,7% y 100% y la modificación rápida de la técnica de Grocott del 71,4% y 100%, respectivamente. El valor predictivo negativo fue para ambas técnicas del 96,9% y 94,1%, respectivamente. La aplicación de las tablas de contingencia (χ 2) a los valores de sensibilidad obtenidos determinaron la ausencia de significación estadística en las diferencias observadas (p > 0,05).
A través de los resultados obtenidos puede concluirse que, para el diagnóstico de la PCP en los BALs provenientes de pacientes con SIDA, debido a la elevada cantidad de P. jiroveci que ellos poseen, la visualización en fresco de estructuras "en panal de abejas" es de gran utilidad como prueba tamiz y sus resultados pueden ser confirmados con el empleo de la técnica de Grocott. La IFD puede emplearse en aquellos casos en los cuales otros estudios son negativos, dejando los otros dos métodos aquí evaluados como opciones previas.
Sin embargo, es necesario aclarar que este esquema de diagnóstico puede eventualmente no ser exitoso cuando es aplicado a pacientes con otras causas favorecedoras, las que se acompañan de un deterioro inmunológico menor al de los pacientes con SIDA, y de una carga menor de microorganismos en sus materiales clínicos (1).

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Recibido: 2/5/05
Aceptado: 26/9/05