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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.38 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./mar. 2006

 

Epidemiología de la infección cervical por virus Papiloma humano en Ushuaia, Argentina

C. C. Sijvarger*1, J. V. González3, A. Prieto2, A. G. Messmer2, M. C. Mallimaci1, V. L. Alonio3, A. R. Teyssié3, M. A. Picconi3

1Servicio de Laboratorio, 2Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Regional Ushuaia, 12 de Octubre y Maipú, (9410) Ushuaia, Tierra del Fuego, Argentina. 3Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS Dr. Carlos G.Malbrán, Av. Vélez Sarsfield 563, (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: rlocker@infovia.com.ar

RESUMEN
El virus Papiloma humano (HPV) es un factor necesario para el desarrollo del cáncer cervical. El objetivo del estudio fue conocer la epidemiología de dicha infección en Ushuaia, Provincia de Tierra del Fuego, Argentina. Se realizó un estudio de caso-control de 132 cepillados endocervicales. La detección y tipificación del genoma viral fue realizada por la reacción en cadena de la polimerasa, con posterior análisis de polimorfismos de fragmentos de restricción o hibridación. La prevalencia general de la infección fue 41%, correspondiendo 26% a los controles y 71% a los casos. El grupo etario con mayor prevalencia de HPV fue el de 14 a 24 años. Los tipos virales más frecuentes en la población infectada fueron HPV16 (23%), HPV18 (11%) y HPV33/35 (8% cada uno), resultando infectados con tipos virales de alto riesgo el 30% de las muestras, 16% de los controles y 60% de los casos. El trabajo aporta los primeros datos sobre los tipos virales predominantes en Ushuaia. Los resultados demostraron una prevalencia menor que en regiones con alta incidencia de cáncer cervical, siendo el HPV16 el más frecuente. La información obtenida permitiría estimar la efectividad de las vacunas en vías de aprobación, en la población estudiada.
Palabras clave: virus Papiloma humano, infección cervical, tipificación viral, cáncer de cérvix, Ushuaia

ABSTRACT
Cervical infection epidemiology of human papillomavirus in Ushuaia, Argentina
. Genital infection with human papillomavirus (HPV) is decisive in the causation of cervical cancer. In order to evaluate the epidemiology of HPV infection in Ushuaia, Province of Tierra del Fuego, Argentina, 132 endocervical cytobrushes from preneoplastic and neoplastic cases and controls were studied. Detection and typing of the viral genome was performed by polymerase chain reaction, combined with a restriction fragment length polymorphism assay or hybridization. The overall prevalence of HPV infection was 41% in the population examined, with a frequency of 26% in the controls and 71% in the cases under study. The 14-24 age group showed the highest HPV prevalence. The most common viral types in the infected population were HPV 16 (23%), HPV 18 (11%), HPV 33 (8%) and HPV 35 (8%), while high risk viral types were detected in 30% of the samples, 16% of the controls and 60% of the cases. This study provides the first data on the predominant viral types in Ushuaia. Our results show lower levels of infection than in regions with a high incidence of cervical cancer, HPV 16 being the most prevalent viral type. This research may be useful for selecting a specific vaccine targeting the population examined.
Key words: human papillomavirus, cervical infection, viral typification, cancer of the cervix, Ushuaia

INTRODUCCIÓN
El virus Papiloma humano (HPV), agente infeccioso perteneciente a la familia Papillomaviridae, muestra tropismo epitelial induciendo un amplio espectro de lesiones de distinto grado de severidad (26). La infección genital por HPV representa la enfermedad de transmisión sexual más común a nivel mundial, siendo los niveles de prevalencia de la infección dependientes de la edad y del método de detección aplicado (4).
Numerosos estudios epidemiológicos mundiales confirmaron que la infección genital por HPV es un factor necesario para el desarrollo del carcinoma cervical (4, 5, 12, 28), pero no suficiente, pudiendo producir infecciones asintomáticas sin importancia clínica. El genotipo viral es uno de los factores de riesgo asociados a la infección que determinan la progresión maligna de lesiones cervicales. Más de 40 tipos distintos de HPV han sido identificados en el tracto anogenital humano, los cuales se pueden subdividir en dos grupos: “de bajo riesgo oncogénico” (HPV-BR) que se encuentran en condilomas acuminados y neoplasias intraepiteliales de bajo grado con mínimo riesgo de progresión maligna (principalmente los tipos 6, 11 y 42) y los “de alto riesgo oncogénico” (HPV-AR) en neoplasias intraepiteliales de alto grado e invasivas (principalmente los tipos 16, 18, 31 y 45) (12, 19, 30).
El reconocimiento de una asociación etiológica entre el HPV y el cáncer de cérvix introdujo nuevas perspectivas en el campo del diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad, abordando el aspecto virológico. La prevención del cáncer cervical se basa fundamentalmente en programas de tamizaje citológico y tratamiento de lesiones; sin embargo, el uso de pruebas molecula-res para la detección del genoma de HPV y el desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas ofrecerán importantes alternativas de control y prevención en el futuro (7, 24).
Un estudio mundial de carcinomas de cuello uterino realizado por la Agencia Internacional de Investigación sobre Cáncer (IARC-OMS) demostró que, a pesar de existir tipos virales prevalentes, puede haber variaciones en distintas regiones geográficas (5). Como el conocimiento de la distribución de los tipos de HPV y variantes podría contribuir al control de la enfermedad y al desarrollo de vacunas (29) la Organización Mundial de la Salud propicia estudios de prevalencia de HPV en distintas regiones del mundo.
El cáncer de cérvix es el segundo más común en mujeres en todo el mundo y el primero en países en desarrollo, en donde representa el 17% del total de cánceres y afecta en forma creciente a mujeres cada vez más jóvenes (20). En la provincia de Tierra del Fuego el cáncer de cérvix ocupa el tercer lugar con una tasa de mortalidad ajustada por edad de 4,7 (18); sin embargo, teniendo en cuenta que el registro de tumores de la provincia se encuentra en proceso de formación, podría existir una subestimación de los mismos.
La ciudad de Ushuaia, provincia de Tierra del Fuego, está situada en el extremo Sur de Argentina y cuenta con 45.430 habitantes (10). Sólo un 35% de los habitantes son nacidos en la provincia mientras que 54% provienen de otras y 11% son extranjeros, en su mayoría chilenos y bolivianos (11). Por la ley de promoción industrial se produjo el máximo crecimiento de la población entre 1970 y 1991, superando a la media nacional en 8 veces y medio. El 84% de la población es menor de 44 años con igual proporción de hombres y mujeres (10), lo que le da la característica de una población joven, económicamente activa y en edad fértil. El 70% de la población urbana posee cobertura por obra social, el 100% de los partos son institucionalizados y el 0,5% corresponden a madres menores de 15 años (10).
El objetivo de este estudio fue conocer la prevalencia de la infección por HPV y los tipos virales circulantes en muestras de cuello uterino de mujeres de la ciudad de Ushuaia y describir la epidemiología de esta infección en la región.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes
Se estudiaron 132 cepillados endocervicales de mujeres que asistieron por control a los consultorios de ginecología del Hospital Regional Ushuaia (HRU) durante 2002 y 2003. Las muestras se agruparon en base al diagnóstico cito-histológico, aplicando el criterio de Bethesda 2001 (25) como: 90 muestras negativas para células neoplásicas y lesión por HPV (normales e inflamatorias), 34 lesiones intraepiteliales de bajo grado (LSIL), 7 lesiones intraepiteliales de alto grado (HSIL) y 1 carcinoma de células escamosas (SCC). La edad media de las pacientes estudiadas fue de 31 años con un rango entre 14 y 47 años.
Se realizó un estudio de casos y controles; los casos incluyeron todas las mujeres con citología anormal desde LSIL a SSC, normalizando la población por edad.
Para la realización del trabajo se requirió del consentimiento individual de las mujeres participantes. Todas las pacientes completaron un cuestionario con datos reproductivos, demográficos y de historia clínica y sexual.

Extracción del ADN de las muestras clínicas
Citología exfoliativa: las células cervicales del ecto y endocérvix fueron recolectadas empleando un cepillo cónico citobrush, obteniéndose dos juegos de muestras, uno se destinó para análisis citológico convencional (Papanicolaou) y del restante, las células fueron resuspendidas en 3 ml de solución tamponada fosfato salina (PBS) estéril, pH 7,4 y conservadas a 4 °C por no más de 72 h. Las células cervicales fueron centrifugadas y lavadas con 1 ml de PBS, manteniéndose los precipitados celulares a -20 °C hasta su procesamiento.
Para la extracción del ADN genómico, el precipitado celular se resuspendió con solución tamponada de extracción el cual contenía proteinasa K y se incubó por 2 h. a 56 °C; posteriormente la enzima fue inactivada a 95 °C durante 10 min y el digesto crudo se utilizó como fuente de ADN templado.
Control de calidad de los ADN templados: la integridad del ADN obtenido fue verificada mediante la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un fragmento de 268 pb del gen de la β-globina humana empleando los cebadores PC04 y GH20 (23).

Detección y tipificación de HPV
La detección genérica del genoma viral fue realizada en primera instancia por PCR utilizando el sistema de cebadores consenso MY 09/11 que amplifican un fragmento de 450 pb del gen viral L1 (17). Brevemente, la PCR se desarrolló en un volumen final de 100 ml conteniendo solución tamponada 1X, 2,5 mM MgCl2, 1µM de cada cebador, 240 µM de cada dNTP y 0,04 U/µl de Taq DNA polimerasa (Invitrogen). La amplificación se realizó mediante el siguiente programa: desnaturalización inicial a 94 °C, 3 min seguida de 35 ciclos: 94 °C, 1 min/55 °C, 1 min/72 °C, 1 min, con una extensión final a 72 °C, 5 min. Por cada 10 muestras se amplificó como control positivo genoma de la línea celular CaSki y agua como control negativo.
La genotipificación viral se realizó por análisis de polimorfismos de fragmentos de restricción (RFLP) de acuerdo a la técnica descripta por Bernard et al. (3).
Cuando esta PCR resultó negativa o mostró productos inespecíficos que impedían su posterior tipificación por RFLP, las muestras fueron amplificadas usando cebadores genéricos GP 5,6+ que producen un fragmento de 140 pb dentro del mismo gen viral (13). Brevemente, la PCR GP 5,6+ se desarrolló en un volumen final de 50 µl conteniendo solución tamponada 1X, 3,5 mM MgCl2, 0,8 µM de cada cebador, 200 µM de cada dNTP y 0,05 U/µl de Taq DNA polimerasa (Invitrogen). La amplificación se realizó mediante el siguiente programa: desnaturalización inicial a 94 °C, 3 min seguida de 40 ciclos: 94 °C, 30 s/45 °C, 30 s/72 °C, 30 s, con una extensión final a 72 °C, 3 min.
En este caso, la tipificación posterior se realizó por hibridación en dot blot con oligosondas tipo-específicas para los tipos virales 6, 11, 16, 18, 31 ,33, 35, 45, 56 y 58, marcadas con biotina y la detección de los híbridos se llevó a cabo por quimioluminiscencia, de acuerdo a la técnica descripta por Jacobs et al. (13), empleando el equipo ECL (Amershan) y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó empleando el programa Epi-Info 6.0. La asociación entre las variables y la infección por HPV se estimó con correlación univariante, estableciendo la razón de posibilidades (Odds Ratio) con intervalos de confianza del 95% en tablas 2x2.

RESULTADOS
En la Tabla 1 se presentan las características epidemiológicas de la población estudiada.

Las muestras cervicales de 3 pacientes no fueron aptas para el diagnóstico por no amplificar el gen de la b globina humana, por lo tanto el análisis epidemiológico se refiere a 87 controles y 42 casos. Todas las muestras fueron analizadas mediante PCR- RFLP, resultando positivas 31 (tipificables 21 y de tipo viral no determinado 10 casos), las restantes fueron evaluadas mediante PCR- Dot blot.
La prevalencia general de la infección fue 41% (53/129); la positividad de HPV según el diagnóstico cito-histológico y los tipos virales detectados se muestran en la Tabla 2.
Los tipos virales prevalentes fueron HPV 16 y 18 con 23% y 11% de las muestras positivas, respectivamente. Le siguieron en orden de frecuencia los tipos 33, 35, 6 y 11 (8% cada uno), 45 (6%) y los tipos 31, 52, 53 y 61 (4% cada uno) (Tabla 3). Del total de muestras positivas, 74% (39/53) resultaron con tipos virales de alto riesgo; en el 30% (16/53) de los casos no pudo determinarse el tipo viral por ninguna de las metodologías empleadas. Entre los casos indeterminados sólo uno correspondió a una lesión severa, el resto fueron pacientes con lesiones de bajo grado y controles.

En el estudio se detectó un 11% de infecciones múltiples, 1 paciente con 3 tipos virales diferentes, 4 pacientes con 4 tipos virales y 1 con 5 tipos; en todos los casos estaba presente, al menos, un tipo de alto riesgo.
En el grupo de mujeres con LSIL, HSIL y SCC los tipos virales prevalentes fueron HPV 16 y 18, representando el 23% y 17% de las infecciones, respectivamente. En las muestras normales resultaron más frecuentes los tipos virales 16 (22%) y 33 (13%).
La positividad para HPV se asoció a la citología anormal (Tabla 4) a expensas de una mayor prevalencia de los tipos virales de alto riesgo (Tabla 5).

Para analizar la frecuencia de la infección según la edad, las mujeres se agruparon en los siguientes intervalos 14-24 años (n = 39), 25-34 años (n = 45), 35-44 años (n = 38) y 45-54 años (n = 7). La frecuencia disminuyó con la edad, resultando el grupo etario entre 14 a 24 años el de mayor porcentaje de infección, alcanzando el 54% (21/39) (Figura 1). La prevalencia de HPV en las mujeres menores de 40 años (44%, 46/104) fue superior a la de las mayores de 40 años (28%, 7/25) con un OR de 2,04.
No hubo correlación entre el hábito de fumar y la citología anormal.

DISCUSIÓN
El presente trabajo enfocó la prevalencia de la infección por HPV y los tipos virales circulantes en muestras de cuello uterino de mujeres de la ciudad de Ushuaia, describiendo la epidemiología de la infección en la región.
La prevalencia de HPV obtenida en la población hospitalaria estudiada de mujeres con citología normal (26%) fue más elevada que la comunicada por Amestoy et al. para la ciudad de Concordia (Provincia de Entre Ríos, Argentina) (2). Aunque resultó menor que la de otras regiones del país con alta incidencia de cáncer cervical como Misiones (27), La Plata (1), con prevalencias de la infección de alrededor de 45% y aborígenes quechuas (21) y guaraníes (27) con 52 y 64%, respectivamente. Por otro lado, resulta similar a las prevalencias informadas en otros países sudamericanos como Paraguay y Brasil, con valores alrededor del 20% (22, 9).
HPV 16 fue el tipo viral de mayor frecuencia (23% de las muestras positivas), lo cual coincide con trabajos mundiales (28), latinoamericanos (15) y de nuestro país (27). En orden decreciente de frecuencia se ubicaron los tipos de alto riesgo 18, 33, 35, 45, 31, 52 y 53.
Se detectó un predominio de tipos virales oncogénicos lo que podría ser un factor de riesgo para la persistencia viral y el desarrollo de cáncer (14, 21). La persistencia de HPV-AR es necesaria para el desarrollo de SIL; se ha estimado que entre el 15-30% de mujeres con citología normal infectadas con estos tipos virales desarrollarán HSIL en los próximos 4 años (16). Liaw et al. demostraron que las mujeres con citología normal con tipos virales 16 o 18 tenían, al menos, 10 veces más probabilidad de progresar a carcinoma en los próximos 2 años de seguimiento (16).
En el 30% de las muestras positivas el tipo viral no pudo determinarse, aun realizando hibridaciones con sondas correspondientes a los 10 tipos prevalentes; estos casos podrían deberse a la presencia de tipos virales o variantes distintos a los ensayados por dot blot.
En el estudio se detectó un 11% de infecciones múltiples, en todos los casos con al menos un tipo de alto riesgo; algunos trabajos han sugerido el posible rol de las infecciones múltiples con tipos virales de alto riesgo oncogénico en el desarrollo o progresión de displasia cervical (8) mientras que otros determinan que las coinfecciones no son más frecuentes en HSIL que LSIL, reflejando la transmisión sexual de múltiples HPV (4, 6, 15).
Nuestro trabajo confirmó el predominio de la infección por HPV en la población joven (menor de 40 años), con un pico de prevalencia en mujeres entre 14 a 24 años. La mayoría de las infecciones, aun con tipos de AR, en mujeres jóvenes son transitorias, en tanto que a mayor edad tienden a ser persistentes. Si bien este patrón epidemiológico es similar en todo el mundo, se han sugerido diferencias geográficas asociadas con las conductas sexuales y con el nivel socio-cultural (4).
La provincia de Tierra del Fuego tiene registrado hasta el momento una baja tasa de incidencia de cáncer de cuello uterino, aunque se debería tener en cuenta que en la actualidad ingresan a Ushuaia un gran número de turistas, con un incremento notable en las sucesivas temporadas. La ciudad cuenta con aeropuerto internacional y un puerto al que llegan grandes cruceros y tiene un movimiento constante de barcos pesqueros. Todo esto genera un contexto epidemiológico favorable para el incremento de las infecciones de transmisión sexual, entre ellas el HPV. Esta situación también podría explicar la gran heterogeneidad de tipos virales detectados.
Debido a las variaciones geográficas observadas en la prevalencia de los distintos tipos virales en diferentes partes del mundo, la OMS aconseja contar con datos locales de los virus circulantes. En este trabajo se obtuvieron los primeros datos sobre los tipos virales predominantes en Ushuaia.
De esta manera los estudios sobre HPV en zonas con diferentes tasas de incidencia de cáncer cervical contribuyen al conocimiento de la historia natural de la infección, de sus enfermedades asociadas y de los factores de riesgo, aportando información necesaria para el desarrollo de vacunas efectivas y el diseño de programas de prevención del cáncer cervical.

Agradecimientos: A los Dres. Ángel Barrios, Ariel Roganti, Carina Bernardi, Adriana Sbrancia, Marcelo Bertini, Francisco Miranda, Beatriz Peralta y Daniel La Falce por la toma de muestras clínicas y encuestas epidemiológicas; a Marina Agüero y Marcela Álvarez por su asistencia técnica, a María Torre por su asistencia con el programa Epi-Info y al Dr. Martín Urtasun por la revisión crítica.

Este trabajo fue realizado en el marco de las actividades de la Red Nacional de Laboratorios de Papilomavirus (INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”) y fue subsidiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y la Fundación Mosoteguy.
Este trabajo mereció el Premio al mejor trabajo en Virología Clínica en el VIII Congreso Argentino de Virología, Buenos Aires, 2005.

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Recibido: 5/09/05
Aceptado: 8/03/06