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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.38 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./mar. 2006

 

Detección de Escherichia coli O157:H7 en carne picada fresca y hamburguesas congeladas

M. A. Marzocca, P. L. Marucci, M. G. Sica, E. E. Álvarez*

Laboratorio Control de Calidad, Cooperativa Obrera Limitada. Santa Fe 391 (8000) Bahía Blanca, Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: controlcalidad@cooperativaobrera.com.ar

RESUMEN
Escherichia coli O157:H7 es un patógeno emergente asociado a enfermedades transmitidas por alimentos. En el año 1982 fue reconocido por primera vez, en los Estados Unidos, como causante de dos brotes de colitis hemorrágica. Hoy se sabe que la mayoría de los casos de síndrome urémico hemolítico son ocasionados por este microorganismo. El objetivo del trabajo fue detectar su presencia en carne picada fresca y hamburguesas congeladas, muestras obtenidas en puntos de venta de nuestra cadena de supermercados en un total de 37 y 43, respectivamente, en el período comprendido entre abril de 2003 y agosto de 2004. Las mismas fueron procesadas utilizando el caldo selectivo para enriquecimiento EC modificado conteniendo novobiocina, seguido de la aplicación de un método de inmunocaptura (TECRA E. COLI O157 IMMUNOCAPTURETM ECOICM 20), y posterior aislamiento en agar MacConkey sorbitol suplementado con cefixima y telurito de potasio y un medio cromogénico. Las cepas sospechosas fueron caracterizadas a) genotípicamente mediante la detección de los genes de virulencia stx1, stx2, eaeA y EHEC-hlyA por PCR e hibridación con sondas genéticas, b) fenotípicamente mediante la determinación del serotipo, sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión de Kirby-Bauer y producción de Stx por ensayo de citotoxicidad específica en células Vero. Se aisló E. coli O157:H7 en una sola muestra de carne picada fresca (2,7%) caracterizada como gen eae (+)/stx2/EHEC-hlyA.
Palabras clave: Escherichia coli O157:H7, carne picada, hamburguesas

ABSTRACT
Escherichia coli O157:H7 detection in fresh ground beef and hamburgers
. Escherichia coli O157:H7 is an emergent pathogen associated with food transmitted diseases. In 1982, Escherichia coli 0157:H7 was for the first time identified as the cause of two hemorrhagic colitis outbreaks in the United States. It is now well known that most cases of hemolytic uremic syndrome are caused by these bacteria. The objective of this work was to detect the microorganism in fresh ground beef and hamburgers. From April 2003 to August 2004 samples were taken at sale points of our supermarket chain, totalling 37 and 43, respectively. These samples were processed using the EC selective enrichment broth containing novobiocin, then followed by the application of an immunocapture method (TECRA E. COLI O157 IMMUNOCAPTURETM ECOICM 20), and later isolation in MacConkey sorbitol agar with cefixime and potassium tellurite, in a chromogenic medium. The suspected strains were genotypically characterized by PCR detection of the stx1, stx2, eaeA, and EHEC-hlyA genes, and by a colony blot hybridization assay. Serotyping, antimicrobial susceptibility patterns, and production of Stx by a specific citotoxicity assay on Vero cells were also determined. E coli O157:H7 was isolated in only one fresh ground beef sample (2,7%), identified as gene eae (+)/stx2/EHEC-hlyA.
Key words: Escherichia coli O157:H7, ground beef , hamburgers

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente asociado a enfermedades transmitidas por alimentos, que puede causar enfermedades severas en el hombre como colitis hemorrágica (CH), síndrome urémico hemolítico (SUH) y púrpura trombocitopénica trombótica. Las cepas STEC producen potentes citotoxinas denominadas toxinas Shiga (previamente conocidas como vero citotoxinas) Stx1, Stx2 y variantes de Stx2, las que liberadas en el intestino pasan a la circulación sanguínea y causan daños a nivel del endotelio vascular (7, 9). La gravedad de las enfermedades producidas, especialmente cuando afectan a la población infantil, y las bajas dosis infectivas que caracterizan no sólo a los brotes sino también a los casos esporádicos (menos de 100 UFC/g), le han permitido ser clasificado como uno de los patógenos transmitidos por los alimentos de más alto riesgo para la salud pública (5).
El ganado vacuno es señalado como el principal reservorio de STEC, y a la carne picada insuficientemente cocida como el vehículo más frecuente de los brotes. El primer aislamiento descrito en este reservorio fue en Argentina, en 1977, en un ternero de menos de tres semanas de edad con colibacilosis (11).
Los brotes alcanzan el máximo número durante los meses más calurosos del año, a raíz del aumento de la portación en el ganado vacuno y en los vehículos de transmisión (5).
Según la Organización Panamericana de la Salud (OPS), en muestro país el SUH es endémico, aproximadamente trescientos casos nuevos son comunicados anualmente por las unidades de nefrología hospitalarias. La incidencia estimada es de 9,2 casos por cada 100.000 niños menores de 5 años, y más de 7.000 casos han sido registrados desde 1965 (10).
La Región Sanitaria I de la Provincia de Buenos Aires, cuya cabecera es la ciudad de Bahía Blanca, notificó durante el año 2004 al Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SI.NA.VE) 5 casos de SUH: uno en un menor de un año y los 4 restantes en niños cuyas edades oscilaban entre 2 y 4 años (12).
El objetivo del trabajo fue detectar la presencia de E. coli O157:H7 en carne picada fresca y hamburguesas congeladas, muestras obtenidas en puntos de venta de la cadena de supermercados en un total de 37 y 43, respectivamente, en el período comprendido entre abril de 2003 y agosto de 2004. Las muestras de carne picada fresca fueron trituradas, 16 en el frigorífico de la empresa (categoría Ciclo II) y 21 en los puntos de venta perso-nalizada de las sucursales. Las muestras de hamburguesas congeladas fueron retiradas de los puntos de venta (góndolas de alimentos congelados).
Se realizó un enriquecimiento de 25 g del alimento en 225 ml de caldo EC modificado (Biokar BK149) con el agregado de 20 µg/ml de novobiocina (Biokar BS03308). Se incubó a 42 °C durante 6 h. Luego se utilizó el test de concentración por inmunocaptura TECRA® (E. COLI O157 IMMUNOCAPTURETM ECOICM 20) (3) de acuerdo a las especificaciones del fabricante, que consistió en capturar las cepas de E. coli O157 presentes en una alícuota (4 ml) del caldo de enriquecimiento de la muestra con un hisopo que posee anticuerpos anti-O157 purificados en su superficie. Se incubó a 41-43 °C durante 30 a 40 min, se efectuó un lavado del hisopo y se transfirió a un medio de cultivo provisto, en el cual E. coli O157 capturados se multiplicaron hasta niveles detectables. Para ello se incubó a 41-43 °C por 4 h. El caldo se agitó en vórtex por 20 segundos para liberar a E. coli O157 y posteriormente se aisló en agar MacConkey sorbitol (CT-SMAC base, Biokar, BK147HA) con el agregado del suplemento selectivo cefixima-telurito (Biokar, BS03708) en una proporción de 50 ng/ml y 25 mg/ml, respectivamente, y en CHROMagarTM O157. Ambos medios se incubaron a 37 °C durante 18 h.
Las colonias presuntivas aisladas, en su mayoría del medio cromogénico, fueron caracterizadas bioquímica-mente previa coloración de Gram con las pruebas de agar-hierro-tres azúcares (TSI), citrato, utilización de triptofano, rojo de metilo, ortonitrofenil β-galactopiranósido (ONPG) y β
-glucuronidasa. Las cepas identificadas como E. coli β-glucuronidasa negativa fueron enviadas al Servicio de Fisiopatogenia del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, para su caracterización genotípica y fenotípica. Las mismas consistieron en la detección de los genes de virulencia stx1, stx2, eaeA y EHEC-hlyA por PCR e hibridación con sondas genéticas, del serotipo con antisueros específicos, producción de Stx por ensayo de citotoxicidad en células Vero (6) y sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión de Kirby-Bauer para ampicilina, amicacina, ciprofloxacina, colistina, cloranfenicol, gentamicina, ácido nalidíxico, nitrofurantoína, estreptomicina, tetraciclina y trimetoprima-sulfa metoxazol (8).
Se aisló E. coli O157: H7 en una de las muestras de carne picada en el frigorífico (2,7%), correspondiente a un aislamiento efectuado en el mes de enero. Esta cepa fue caracterizada como gen eae (+) / stx2 / EHEC-hlyA y fue sensible a los antimicrobianos ensayados.
La detección de E. coli O157:H7 en alimentos se puede efectuar utilizando métodos de cultivos directos, o empleando previamente una inmunoconcentración a fin de elevar la sensibilidad de los mismos. Chapman et al. han efectuado estudios comparativos utilizando técnicas de inmunoconcentración y han corroborado el incremento de sensibilidad con respecto al uso de cultivos directos o enriquecimiento y subcultivos posteriores (3). La metodología recomendada por el United States Department of Agriculture/Food Safety and Inspection Service (USDA/FSIS), es la concentración con partículas inmunomagnéticas para alimentos crudos y listos para su consumo, la cual posee un límite de detección de menos de 1 UFC/g sobre un tamaño de muestra de 65 g (14). Con fines investigativos, trabajando con muestras de carne picada fresca inoculadas previamente, se pudo recuperar dicho microorganismo cuando se utilizaron las partículas inmunomagnéticas frente a un inóculo de 1 bacteria por cada 10 g, pero no se detectó la presencia de E. coli O157:H7 en todas aquellas muestras inoculadas con 1 bacteria por cada 100 g (13).
Entre los años 2001 y 2002 se han efectuado distintos trabajos de investigación con el objetivo de detectar la presencia de E. coli O157:H7 en diferentes productos cárnicos, utilizándose la técnica de concentración, y los mismos han arrojado los siguientes resultados: carne picada 3,8%, embutidos frescos 4,8% y embutidos secos 3,3% (4).
En función de todos estos estudios no cabe duda que las técnicas de detección de E. coli O157:H7 se han ido optimizado notablemente y lo seguirán haciendo en el futuro. También es una realidad, que la única manera de minimizar los casos de SUH y de todas aquellas patologías producidas por este microorganismo en la población pasa por la aplicación de las medidas educativas y preventivas, en los distintos ámbitos que estén involucrados con la producción y consumo de productos cárnicos. En los EEUU se espera que para el año 2010 la incidencia de infecciones por STEC O157 sea de 1 caso/100.000 personas, gracias a los Sistemas de Vigilancia Epidemiológica (2) y a los controles en puntos estratégicos de la industria cárnica para los animales en pie, las operaciones durante el sacrificio y la obtención de la carne picada, en respuesta a notificaciones de la FSIS (15). Por otra parte, la National Association of State Public Health Veterinarians (NASPHV) ha publicado en marzo de 2005 un compendio de medidas para prevenir las enfermedades asociadas con animales en lugares públicos (1).
En el Cono Sur de América, las infecciones por E. coli enterohemorrágico son endémicas, y esto obedece fundamentalmente a la falta de programas de vigilancia de brotes de toxo-infecciones alimentarias en toda esta región. Sin embargo, tanto en Argentina como en Chile y Uruguay, se estableció que en el SUH se observa una menor participación del serogrupo O157 con relación a las cepas no O157 (10).

BIBLIOGRAFÍA
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3. Chapman PA, Cerdan Malo AT, Siddons CA, Harkin M. Use of commercial enzyme immunoassays and immunomagnetic separation systems for detecting Escherichia coli O157 in bovine fecal samples. Appl Environ Microbiol 1997; 63: 2549-53.         [ Links ]
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Recibido: 4/07/05
Aceptado: 9/01/06