F. J. Reynaldi, A. M. Alippi*

Centro de Investigaciones de Fitopatología (CIDEFI), Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, c.c. 31, calles 60 y 118, (1900) La Plata, Argentina.
* Correspondencia. E-mail: alippi@biol.unlp.edu.ar

RESUMEN
Se evaluó la capacidad de recuperación de esporas viables de Paenibacillus larvae en medio MYPGP y MYPGP con el agregado de ácido nalidíxico y ácido pipemídico, en diferentes concentraciones. No se hallaron diferencias significativas en la recuperación para los tiempos de incubación, los medios y el rango de concentración de esporas ensayados. La recuperación de células vegetativas a partir de PBS no presentó diferencias en los tiempos de incubación ni en las diluciones ensayadas, sin embargo se vio disminuida significativamente con el aumento de la concentración de ácido nalidíxico y ácido pipemídico en el medio. De acuerdo con nuestros resultados, proponemos para la recuperación de esporas a partir de mieles, el empleo del medio MYPGP_NALPIAB (9 μg/ml ac. nalidíxico y 20 μg/ml ac. pipemídico), en particular para mieles con poblaciones heterogéneas de esporas bacterianas; en tanto que para el cultivo de células vegetativas es conveniente el medio MYPGP o MYPGP_NALPIAA (6 µg/ml ac. nalidíxico y 10 µmg/ml ac. pipemídico).
Palabras clave: Paenibacillus larvae , loque americana, miel, MYPGP, esporas, abejas

ABSTRACT
Optimization of the growth of Paenibacillus larvae in semi-selective media. The sensitivity of media MYPGP, MYPGP_NALPIA A (6 µg/ml nalidixic acid and 10 µg/ml pipemidic acid) and MYPGP_NALPIA B (9 µg/ml nalidixic acid and 20 µg/ml pipemidic acid) for the recovery of viable spores of Paenibacillus larvae from honey, was evaluated by using different incubation times and different spore concentrations. No significant differences between incubation times, spore concentration or culture media were found. In the case of the recovery of vegetative cells from PBS at different incubation times and different dilutions no significant differences were found between the incubation times or the dilutions tested, while significant differences were found in the three media when compared with one another, MYPGP_NALPIAB providing the lowest recovery of vegetative cells. Considering these results, we propose the use of MYPGP_NALPIAB to recover spores of P. larvae from honey, specially for honeys with heterogeneous populations of bacterial spores; when culturing vegetative cells, MYPGP or MYPGP_NALPIAA must be used to obtain good growth.
Key words: Paenibacillus larvae, American Foulbrood, honey, MYPGP, spores, honeybees

La loque americana, causada por la bacteria esporulada Paenibacillus larvae (8, 11), es la enfermedad más grave de la etapa larval de las abejas domésticas (Apis mellifera L.). Es altamente contagiosa y una de las pocas enfermedades capaces de matar a una colmena. Plantea problemas únicos para su prevención y control debido a que las esporas bacterianas mantienen su capacidad infectiva por largos períodos y pueden sobrevivir bajo condiciones ambientales adversas (5, 15). Los síntomas clínicos se manifiestan en los cuadros de cría larval con un aspecto de cría salteada; las celdas afectadas presentan los opérculos hundidos y oscurecidos, de apariencia húmeda y con perforaciones irregulares. Al introducir un palillo a través del opérculo, se extrae una masa viscosa de color variable entre amarillento y castaño oscuro, casi negro, que se estira más de 2,5 cm. Con el correr del tiempo, se forma una escama que se adhiere firmemente al capullo y hacia el piso y fondo de las celdas. Cada una de estas escamas contiene dos mil quinientos millones de esporas, que representan la forma infectiva capaz de iniciar el ciclo de la enfermedad cuando las larvas las ingieren, junto con el alimento (5, 15).
En la Argentina, la loque americana se detectó por primera vez en 1989 (1, 2) y desde entonces se ha diseminado rápidamente por todas las áreas apícolas del país. Estudios previos realizados sobre muestras de miel provenientes de la provincia de Buenos Aires mostraron una incidencia de la enfermedad superior al 50 % (4).
Se han desarrollado varios métodos para el aislamiento de esporas viables de P. larvae a partir de miel, entre ellos la siembra directa de la muestra de miel (9, 10) y la concentración de esporas por diálisis (16) o centrifugación (12) y posterior siembra del concentrado de esporas en medios específicos y/o semiselectivos (3, 12, 17). La incorporación de distintas concentraciones de antibióticos a un medio basal apto para el desarrollo de P. larvae permite una buena recuperación de esporas del patógeno a partir de mieles con poblaciones heterogéneas de especies bacterianas esporuladas aeróbicas y/o microaerófilas (3, 4). El medio MYPGP, desarrollado por Dingman y Stahly para el cultivo de P. larvae (7), presenta el mejor porcentaje de recuperación de esporas de esta especie a partir de miel, en tanto que el agar J, el agar cerebro-corazón fortificado con tiamina, el agar base Columbia suplementado con sangre ovina y el agar sangre de caballo suplementado son menos eficientes en este sentido (14).
El objetivo del presente trabajo fue optimizar las condiciones de cultivo para obtener una máxima recuperación de P. larvae a partir de mieles con diversas concentraciones de esporas. Para ello, se ensayaron distintas concentraciones de los antibióticos ácido nalidíxico y ácido pipemídico, diferentes tiempos de incubación y mieles con diversas concentraciones de esporas del patógeno. Adicionalmente, se evaluaron los mismos medios de cultivo para recuperar células vegetativas de P. larvae a partir de PBS (buffer fosfato salino).
Para evaluar la recuperación de las células vegetativas se preparó una suspensión en 1,5 ml de PBS de un cultivo de 24 h de la cepa de Paenibacillus larvae ATCC 9545. Se corroboró la ausencia de esporas mediante observación microscópica de frotis teñidos (14) y por shock térmico de una alícuota de concentrado (6). La suspensión se ajustó a una concentración final de 3,125 x 10⁹, a partir de la cual se realizaron diluciones en base 10, sembrando por cuadruplicado las diluciones 1/10⁵, 1/10⁶ y 1/10⁷, a razón de 100 µl por placa en los medios MYPGP, MYPGP_NALPIA A y MYPGP _NALPIA B, respectivamente. Las placas sembradas se incubaron en aerobiosis a 37 °C y se contabilizaron las UFC por placa a las 48 y 96 h. Los datos fueron transformados y analizados estadísticamente de igual modo que los obtenidos para esporas. Para el caso de las células vegetativas de P. larvae, se observó que no existieron diferencias significativas entre los medios MYPGP, MYPGP_NALPIAA y MYPGP_NALPIAB para las diluciones 1/10⁵ (p=0,88), 1/10⁶ (p=0,73) y 1/10⁷ (p=0,54); tampoco existieron diferencias significativas entre los tiempos de cultivo teniendo en cuenta todos los medios usados (p =0,90). Cuando se compararon los tres medios entre sí, existieron diferencias significativas para las tres diluciones usadas, 1/10⁵ (p=0,0005), 1/10⁶ (p=0,01) y 1/10⁷ (p=0,03); un posterior test de Tuckey mostró, para todos los casos, un rendimiento similar para los medios MYPGP y MYPGP_NALPIAA, mientras que el medio MYPGP_NALPIAB presentó diferencias estadísticamente significativas, como se muestra en la Figura 2.

Las esporas de P. larvae fueron obtenidas a partir de colmenas con síntomas clínicos de loque americana. Se retiraron 30 escamas con pinzas de disección estériles y se machacaron en 5 ml de PBS (0,01 M, pH 7,2) estéril en un mortero estéril hasta homogeneizado total. Esta solución se transfirió a un tubo estéril con tapa a rosca y se agitó en vórtex durante 60 segundos, al cabo de los cuales se hizo el recuento de esporas por ml en cámara de Petroff-Hausser bajo contraste de fase a 400 aumentos. La concentración final de esporas fue de 6 x 10¹⁰ esporas/ml.
Posteriormente, se prepararon dos matrices diferentes: 1- Miel virgen (miel comercial) y 2- Miel tindalizada (esterilizada por tindalización consecutiva durante 3 días). Todas las mieles se analizaron previamente para confirmar que no contenían esporas viables de P. larvae (4). Cada una de las matrices se dividió en 3 submuestras a las que se les agregaron distintas alícuotas del concentrado original, para alcanzar concentraciones finales de 2047, 204 y 20 esporas por gramo de miel en cada submuestra.
Para el aislamiento de esporas viables, cada submuestra de miel más PBS con esporas (6 en total) se homogeneizó en un tubo de centrífuga con varilla de vidrio estéril y se centrifugó a 4000 g durante 25 minutos, luego de los cuales se descartó el sobrenadante dejando 3 ml de fluido por tubo. Posteriormente las muestras se agitaron en vórtex durante dos minutos a máxima velocidad y se sometieron a un shock térmico de 80-82 °C durante 15 minutos, para eliminar todas las formas vegetativas y activar la germinación de las esporas bacterianas. Finalmente, se sembraron 100 µl por placa con micropipeta, distribuidos uniformemente con espátula de Drigalsky. Esta metodología se realizó por quintuplicado en los medios MYPGP, MYPGP_NALPIA A (6 µg/ml ácido nalidíxico y 10 µg/ml de ácido pipemídico) y MYPGP_NALPIA B (9 µg/ml ácido nalidíxico y 20 µg/ml de ácido pipemídico). Las placas sembradas se cultivaron en microaerofilia a 37 °C y se evaluaron a los 7 y 14 días, contando el número de UFC por placa. Para realizar el análisis estadístico de los resultados, los datos se estandarizaron sumando una unidad (para evitar valores cero) y se transformaron mediante logaritmo en base 10. El ANOVA efectuado sobre los datos transformados demostró que no existieron diferencias significativas entre los 7 y los 14 días de incubación para ninguno de los medios en todas las matrices (Tabla 1); tampoco se encontraron diferencias significativas entre las distintas concentraciones de esporas probadas para miel virgen (p = 0,09) ni para miel tindalizada (p = 0,09). Finalmente, tampoco se hallaron diferencias significativas entre los tres medios usados para las matrices miel virgen (p = 0,15) y miel tindalizada (p = 0,11) (Figura 1).

A pesar de que en este trabajo no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tiempos de incubación para recuperar esporas viables de miel, estudios previos demostraron que cuando la concentración de esporas en la miel es muy baja, la incubación de sólo 7 días puede arrojar falsos negativos (3, 4). De acuerdo con pruebas adicionales realizadas en este laboratorio, sobre un total de 219 mieles provenientes de apiarios con loque americana, el 32% (n=70) mostró desarrollo de colonias del patógeno a partir del día 8 y hasta los 14 días de incubación en microaerofilia, lo cual claramente indica que si las muestras se hubieran evaluado sólo a los 7 días, se hubiera obtenido un 32% de falsos negativos.
De acuerdo con los resultados de este trabajo, las pruebas adicionales efectuadas y las observaciones previas (3, 4), se propone utilizar el medio MYPGP_NALPIAB para aislar P. larvae de miel y, de esta forma, optimizar al máximo la recuperación de esporas viables del patógeno a partir de mieles con poblaciones heterogéneas de esporas bacterianas, sin perder la gran sensibilidad que posee el medio MYPGP.
A partir de las placas de aislamiento de esporas de miel, y con el objeto de obtener cultivos puros del patógeno, los primeros repiques deberían efectuarse en MYPGP_NALPIAA, ya que esta combinación de antibióticos en el medio de cultivo no altera la viabilidad de las células vegetativas bacterianas, a la vez que permite la inhibición de alguna espora de la placa de aislamiento primario por carry over. Para estudios posteriores que involucren crecimiento y desarrollo de células vegetativas bacterianas es indistinto usar MYPGP sin antibióticos o MYPGP_NALPIAA.

Agradecimientos: a la Lic. A. C. López, por su ayuda en la elaboración de los gráficos. FJR es becario del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y AMA es Investigadora de la Comisión de Investigaciones Científicas de la Prov. de Bs. As. (CIC). El presente trabajo fue subsidiado por la CIC y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT).