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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.38 n.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./abr. 2006

 

Detección de anticuerpos anti-Brucella spp. en cerdos mediante técnicas de aglutinación y ELISA indirecto en las provincias de Buenos Aires y La Pampa, Argentina

H.A. Castro1*, S.R. González1, M.I. Prat1, P.C. Baldi2

1Cátedra de Inmunología, Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, (8000) Bahía Blanca; 2Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: hcastro@uns.edu.ar

RESUMEN
En nuestro país no existe un programa de control sobre brucelosis porcina y su verdadera situación epidemiológica es desconocida. El objetivo de nuestro trabajo fue detectar la presencia de anticuerpos anti-Brucella spp. en porcinos provenientes de criaderos del sudoeste de la provincia de Buenos Aires y del este de la provincia de La Pampa. La toma de muestras de sangre se realizó en el momento del faenado de los animales. La detección de anticuerpos se efectuó mediante las técnicas de aglutinación con antígeno tamponado en placa (BPA), seroaglutinación en tubo (SAT), aglutinación con 2-ME (2-ME) y ELISA indirecto, con dos antígenos diferentes: el antígeno CYT (fracción citoplasmática de B. abortus S19) y el antígeno CP (extracto citoplasmático libre de lipopolisacárido). Del total de las muestras analizadas (n=325), el 17,8% fue positivo para BPA, el 13,8% fue positivo para SAT y sólo el 8,0% fue positivo para 2-ME. Mediante ELISA-CYT, este porcentaje se elevó a 21,0%, mientras que a través del ELISA-CP sólo se halló un 10,0% de muestras reactivas. Estos resultados son compatibles con los informados en los escasos reportes previos para todo el país y sugieren la necesidad de extender los estudios a otras zonas, donde sea habitual la cría de cerdos.
Palabras clave: brucelosis porcina, ELISA indirecto, epidemiología

ABSTRACT
Detection of anti-Brucella spp. antibodies in swine by agglutination techniques and indirect ELISA in the Buenos Aires and La Pampa provinces, Argentina
. Porcine brucellosis is one of the most important zoonoses in this country. Currently, there is no control program for porcine brucellosis in Argentina and the epidemiological situation is still unknown. The purpose of our study was to detect anti-Brucella spp. antibodies in swine in the southwest of the Buenos Aires province and the east of the La Pampa province. Blood samples were obtained when animals were slaughtered. The presence of anti-brucella antibodies was studied by the buffered plate agglutination test (BPA), the tube agglutination test (SAT), the 2-mercaptoethanol (2-ME) agglutination test and indirect ELISA tests, using the cytosolic fraction from Brucella abortus S19 (CYT), and lipopolysaccharide (LPS)-free cytosolic proteins (CP). Out of a total of 325 samples analyzed, 17.8% reacted positively to BPA, 13.8% to SAT, 8.0% to 2-ME, 21.0% to ELISA-CYT and 10.0% to ELISA-CP. These results agree with the few data available in our country and suggest that brucellosis screening should be extended to other regions.
Key words: porcine brucellosis, indirect ELISA , epidemiology

La brucelosis porcina es una zoonosis causada principalmente por las biovariedades 1, 2 y 3 de Brucella suis. La verdadera situación regional de esta infección en nuestro país es desconocida, si bien algunos datos suministrados entre los años 1960 y 1980 sugieren una prevalencia del 14,5 al 25,0% (3), que coincide con los resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo de trabajo (2). Las biovariedades 1 y 3 de Brucella suis son especialmente patogénicas para el hombre. Según datos presentados en el I Congreso Bonaerense de Zoonosis, el 42,3% de las cepas de Brucella aisladas de material biológico humano corresponde a B. suis (7) por lo cual es relevante conocer, para su eventual control, la situación epidemiológica de la enfermedad en el cerdo, portador natural de esta especie.
El diagnóstico de certeza de la brucelosis porcina es el bacteriológico, pero los inconvenientes de su implementación hacen que los métodos de diagnóstico de uso habitual sean los serológicos. Dentro de éstos, los más ampliamente utilizados se basan en las aglutinaciones con suspensiones de bacterias enteras y la fijación de complemento. En ambos casos se detectan anticuerpos contra los componentes de la membrana externa, de los cuales el lipopolisacárido (LPS) es el más abundante. Dada la reactividad cruzada existente entre el LPS de Brucella y el de otras bacterias gram-negativas, es frecuente la aparición de falsos positivos (6). En el caso de los porcinos, la reactividad cruzada con Yersinia enterocolitica 0:9 es un problema particularmente importante (9). Es de destacar que ninguna de las pruebas serológicas convencionales es totalmente confiable para el diagnóstico indirecto de brucelosis en animales individuales, y que la reacción de fijación de complemento no es adecuada, ya que el complemento de cerdo interactúa con el complemento de cobayo y disminuye la sensibilidad de la determinación (11). La Organización Mundial de Epizootias recomienda las pruebas de ELISA competitivo (C-ELISA) y de polarización de fluorescencia (FPA) como pruebas confirmatorias para el diagnóstico individual en porcinos. Son escasos los estudios acerca del uso de reacciones de interacción primaria para detectar anticuerpos anti-Brucella en cerdos (9, 12). Es importante considerar que las pruebas de ELISA que utilizan LPS o su polisacárido O no eliminan el problema de la reactividad cruzada. El empleo de antígenos distintos de LPS disminuye esta reactividad y otorga mayores niveles de especificidad. Se ha demostrado que un ELISA utilizando una preparación de proteínas citosólicas de Brucella libres de LPS (CP) permite un diagnóstico específico de la brucelosis humana y la brucelosis canina (5, 14). Se ha descrito también un ELISA para brucelosis porcina que emplea como antígeno el core del LPS, que disminuye las reacciones cruzadas debidas a Y. enterocolitica 0:9 (9).
El objetivo de nuestro trabajo fue detectar porcinos con serología positiva para Brucella en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires y este de la provincia de La Pampa, empleando simultáneamente las pruebas de aglutinación en placa con antígeno tamponado (BPA), la aglutinación en tubo (SAT), la aglutinación en tubo con 2-ME (2-ME) y una prueba de ELISA con dos antígenos diferentes: antígeno CYT, compuesto por proteínas citosólicas y LPS, y el antígeno CP, antes mencionado.
Los criaderos de la provincia de Buenos Aires correspondieron a las zonas de Bajo Hondo (n=57), Médanos (n=41), Carhué (n=26), Tres Lomas (n=12), Bahía Blanca (n=23), Guaminí (n=36), Coronel Suárez (n=21), Pigüé (n=8), Adolfo Alsina (n=12), Saavedra (n=9) y General Lamadrid (n=15). Como dato representativo de la provincia de La Pampa se analizaron muestras provenientes de Macachín (n=65). Se recolectaron 325 muestras de sangre en el momento del faenado de los animales, bajo la supervisión de un veterinario. Los sueros se obtuvieron por centrifugación de la sangre a 3000 rpm durante 10 minutos, y se mantuvieron a -20 °C hasta el momento de su procesamiento. Para la prueba de BPA se empleó la técnica descrita por Angus y Barton (1), utilizando como antígeno una suspensión al 11% de B. abortus 1119-3 con cristal violeta y verde brillante, pH 3,6. Para las pruebas de SAT y 2-ME se empleó como antígeno una suspensión de B. abortus 1119-3 al 4,5% (Laboratorio del Centro de Zoonosis Rurales, Azul, Buenos Aires). La fracción citoplasmática (CYT) empleada para la prueba ELISA se obtuvo a partir de cultivos de B. abortus S19 tratados con formaldehído, lisados en "X-Press" y ultracentrifugados, según la técnica de Verstreate et al. (13). Esta fracción contiene proteínas citosólicas y LPS (aproximadamente 3 mg/mg de proteínas totales). El antígeno CP se preparó adsorbiendo el antígeno CYT con un anticuerpo monoclonal (BC68), específico para el epitope repetitivo del antígeno O, que retiene al LPS y deja libres las proteínas citoplasmáticas. Este procedimiento reduce en más de 1000 veces el contenido de LPS de la fracción citoplasmática, y el LPS residual no es detectable por ELISA (4). Las microtiras de poliestireno (Costar) se sensibilizaron con antígeno CYT (2 µg/pocillo) o con antígeno CP (0,5 µg/pocillo) diluidos en buffer fosfato (PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se bloquearon con una solución de leche descremada al 3% en PBS, toda la noche en heladera. Luego de tres lavados con PBS-Tween 20 al 0,05% (PBS-Tween), se incubaron con una dilución 1:200 de los sueros por analizar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de sucesivos lavados con PBS-Tween, se agregó el conjugado anti-inmuno-globulinas porcinas (ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) marcado con peroxidasa. El revelado se efectuó con o-fenilendiamina (2 µg/ml). La reacción se detuvo con H2SO4 4 N a los 15 minutos para el antígeno CYT y a los 25 minutos para el CP. La lectura del color desarrollado se efectuó a 490 nm en un lector de microtiras de ELISA (Mini Photometer. Model 6. Metertech Inc.) Para el cálculo del cut off de cada ELISA, se procesaron de igual manera 70 muestras de porcinos provenientes de establecimientos libres de brucelosis, que habían resultado negativas para la prueba de BPA. El valor medio obtenido en cada caso, incrementado en 3 desvíos estándares, fue el valor de corte tomado para discriminar las muestras positivas de las negativas (15). Para el ELISA-CYT resultó un cut off de 0,388 y para el ELISA-CP de 0,436 (Figura 1). Para validar las pruebas se emplearon como controles positivos sueros provenientes de cerdas abortadoras positivas por BPA, pertenecientes a establecimientos con aislamientos de B. suis, y se incluyeron controles negativos provenientes de criaderos libres de brucelosis.

Mediante las pruebas empleadas se detectaron anticuerpos específicos en animales de Bajo Hondo, Médanos, Bahía Blanca, Coronel Suárez, Saavedra y Macachín. No se encontraron muestras positivas en Carhué, Tres Lomas, Guaminí, Pigüé, Adolfo Alsina y General Lamadrid. En la Tabla 1 se muestran los porcentajes de muestras positivas encontrados para cada una de las pruebas ensayadas en las distintas zonas.

Del total de muestras analizadas, 58 sueros (17,8%) fueron positivos para la prueba de BPA. De estos 58 sueros, 45 (77,5%) fueron positivos para SAT, 26 (45%) para 2-ME, 51 (88%) para ELISA-CYT y 33 (57%) para ELISA-CP. Un suero negativo para BPA, SAT y 2-ME fue positivo para ELISA-CYT y ELISA-CP. Nueve sueros negativos para BPA, SAT y 2-ME fueron positivos para ELISA-CYT y negativos para ELISA-CP. Seis sueros negativos para BPA, SAT, 2-ME y ELISA-CYT fueron positivos para ELISA-CP. Todos los sueros negativos para BPA y para ambos ELISAs presentaron un título de 25 UI en SAT y 2-ME, o fueron no reactivos.
El porcentaje de muestras positivas obtenido (18%, por BPA) coincide con los escasos datos reportados en la bibliografía (3). La prueba de ELISA con el antígeno CYT permitió detectar otros diez sueros positivos, que habían resultado negativos para BPA, SAT y 2-ME, lo que eleva el porcentaje de muestras positivas a un 21% (n=68). Entre las muestras positivas por BPA, el mayor porcentaje de muestras positivas para CYT, en relación con las positivas para CP, probablemente se deba a que el antígeno CYT contiene LPS (antígeno dominante en la prueba de BPA), mientras que el antígeno CP carece de él. Asimismo, los sueros positivos por ELISA-CYT y BPA pero negativos por ELISA-CP podrían deberse a falsos positivos originados en la reactividad cruzada con los LPS de otras bacterias (6). En ese sentido, cabe señalar que el antígeno CP parece brindar una mayor especificidad diagnóstica, ya que en los estudios realizados hasta el momento con CP no se han detectado reacciones cruzadas con proteínas de otras bacterias (5, 6, 14). Por otra parte, se ha demostrado en humanos y animales que han padecido la enfermedad, pero que no tienen una infección activa, la persistencia de positividad para anticuerpos anti-LPS pero no para anti-CP (5). No obstante, la positividad para ELISA-CP observada en seis sueros negativos para BPA, ELISA-CYT, SAT y 2-ME podría deberse a la existencia de reacciones cruzadas con proteínas citosólicas, todavía no descritas. Las pruebas de aglutinación convencionales para el diagnóstico de brucelosis porcina, en particular SAT, poseen una baja especificidad debido a la presencia de IgM no específica. Las pruebas de BPA y 2-ME son usadas frecuentemente para determinar la infección por B. suis en piaras infectadas, sin embargo no son confiables para un diagnóstico individual. Otros ensayos, como C-ELISA y FPA, que parecen ser altamente específicos, presentan algunos inconvenientes. El C-ELISA es complejo en su realización y las muestras contaminadas pueden interferir en los resultados (10), mientras que la FPA, si bien es de fácil realización y relativamente poco costosa en cuanto a insumos, necesita un equipamiento especial que no está al alcance de todos los laboratorios. Los resultados expuestos sugieren planificar ensayos que permitan evaluar la sensibilidad y, muy especialmente, la especificidad del método de ELISA utilizado en este trabajo, ya que podrían indicar la conveniencia de sustituir en el futuro los métodos de serología convencionales por el ELISA descrito, con los dos antígenos empleados, no sólo por su mayor confiabilidad sino por sus ventajas técnicas, al utilizar menor volumen de muestra y permitir un procesamiento múltiple en menor tiempo.
El hallazgo de animales con serología positiva alerta sobre el riesgo potencial de infección para el hombre en contacto con ellos y sugiere la necesidad de aplicar medidas preventivas y extender estos estudios serológicos a otras zonas del país donde sea frecuente la cría de cerdos.

Agradecimientos: Agradecemos al Médico Veterinario Dr. Ariel Sarachaga por proveer las muestras y a las Dras. Mirta Arestegui y Graciela Scharovsky, de la Universidad Nacional de Rosario, por facilitarnos los controles positivos y negativos.

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Recibido: 3/1/06
Aceptado: 5/6/06