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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.38 n.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jul./sep. 2006

 

Identificación, biotipificación y caracterización de cepas de Pasteurella multocida aisladas en la Argentina

G. A. Leotta1, 3*, G. B. Vigo3, I. Chinen1, M. Prieto2, R. Callejo2, M. Rivas1

1 Servicio Fisiopatogenia, 2 Servicio Bacteriología Especial, Departamento Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI) – Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud (ANLIS) "Dr. Carlos G. Malbrán". Avda. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 3Laboratorio de Diagnóstico e Investigaciones Bacteriológicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, 60 y 118, cc: 296 (1900) La Plata, Pcia. de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: galeotta@anlis.gov.ar

RESUMEN
Treinta cepas de Pasteurella multocida aisladas en la Argentina a partir de muestras de origen humano y animal fueron identificadas, biotipificadas y caracterizadas. Veintidós de ellas (73%) correspondieron a P. multocida subsp. multocida; cinco (17%) a P. multocida subsp. gallicida y tres (10%) a P. multocida subsp. septica. Todas las cepas fueron agrupadas en 8 biotipos; el 70% presentó el tipo capsular A. Los serotipos somáticos más frecuentes fueron el 1 (n:11) y el 3 (n:9). Las cepas de origen porcino fueron resistentes a tiamulina, estreptomicina y tetraciclina. La caracterización de las cepas de P. multocida aisladas en la Argentina es el primer paso para concretar futuros estudios destinados a la prevención y al tratamiento de la pasteurelosis en medicina humana y veterinaria.
Palabras clave: pasteurelosis, Pasteurella multocida, biotipificación, concentración inhibitoria mínima, PCR.

ABSTRACT
Identification, biotypification and characterization of Pasteurella multocida strains isolated in Argentina
. Thirty Pasteurella multocida strains isolated in Argentina from human and animal samples were identified, biotypified and characterized. Twenty-two (73%) strains were identified as P. multocida subsp. multocida, 5 (17%) as P. multocida subsp. gallicida, and 3 (10%) as P. multocida subsp. septica. All strains were grouped in 8 biotypes, and 70% of the strains presented capsular type A. The most frequent somatic serotypes were 1 (n:11) and 3 (n:9). P. multocida strains from swine source were resistant to tiamulin, streptomycin and tetracycline. Characterization of P. multocida strains isolated in Argentina is the first step to conduct future studies intended for the prevention and treatment of pasteurellosis in human and veterinary medicine.
Key words: pasteurellosis, Pasteurella multocida, biochemical typing, minimum inhibitory concentration, PCR.

La familia Pasteurellaceae está constituida por 9 géneros, de los cuales Pasteurella es el género tipo. Todos los miembros de este género son microorganismos gram-negativos, aerobios-anaerobios facultativos, no esporulados e inmóviles. Según el Comité Internacional sobre Sistemática de Procariotes (http://www.the-icsp.org/subcoms/Pasteurellaceae.htm7), la especie tipo del género es Pasteurella multocida, caracterizada por producir catalasa, citocromo oxidasa e indol; reducir nitrato; utilizar glucosa, manosa y sacarosa; no crecer en agar MacConkey y no producir hemólisis ni ureasa (8). P. multocida se divide en tres subespecies según su capacidad de utilizar trehalosa, dulcitol y sorbitol: P. multocida subsp. multocida, P. multocida subsp. septica y P. multocida subsp. gallicida (8). Los esquemas de tipificación utilizados con mayor frecuencia para P. multocida incluyen 5 tipos capsulares (A, B, D, E, F) y 16 serotipos somáticos (1-16) (2, 5).
La pasteurelosis es considerada una enfermedad zoonótica, cuyo principal reservorio se encuentra en los animales domésticos y silvestres (7). Los animales domésticos padecen diferentes presentaciones de pasteurelosis: cólera aviar, neumonía porcina, septicemia hemorrágica bovina. También se describen infecciones que afectan a conejos, cabras y ovejas (1). Estas enfermedades tienen un gran impacto económico, principalmente en los animales de cría intensiva como cerdos y aves. Las infecciones más frecuentes en el hombre están asociadas con mordeduras o arañazos de perros y gatos (6, 8). En la Argentina, el primer aislamiento de Pasteurella se realizó en 1939 (13), el primer caso de pasteurelosis humana se describió en 1950, y en la década de 1970 se reconoció a P. multocida como agente etiológico de pasteurelosis en aves, porcinos, conejos y bovinos (3). El principal método para el control de las enfermedades causadas por P. multocida en animales de cría intensiva es un adecuado manejo sanitario. Sin embargo, en los criaderos de cerdos se utilizan antibióticos como terapia preventiva, y en la industria avícola se usan vacunas muertas para prevenir el cólera aviar. Hasta el presente, en la Argentina no se han realizado estudios sobre la resistencia de P. multocida a los antimicrobianos de uso masivo en animales domésticos, y no se conoce si el criterio de selección de las cepas vacunales se fundamenta en estudios epidemiológicos. El objetivo del presente trabajo fue identificar, biotipificar y caracterizar 30 cepas de P. multocida aisladas en la Argentina a partir de muestras de origen humano y animal con diagnóstico definitivo de pasteurelosis.
Se estudiaron 10 cepas de P. multocida aisladas de cerdos con neumonía, 9 cepas de gallinas reproductoras con cólera aviar crónico, 3 cepas de aves antárticas con cólera aviar, y 8 cepas de origen humano (Tabla 1). Se incluyeron 3 cepas de referencia como controles positivos: P. multocida subsp. multocida NADC P-1059, P. multocida subsp. septica NADC P-1591 y P. multocida subsp. gallicida ATCC 51689. Todas las cepas fueron identificadas por el micrométodo comercial API20E (BioMérieux, St. Louis, Missouri, EE.UU.) y por sus características tintoriales, morfológicas y bioquímicas (4, 8).

Se realizaron las siguientes determinaciones: hemólisis en medio agar base sangre (Difco Laboratories, Le Pont de Claix, France) adicionado con 5% de sangre de carnero, catalasa (Difco), citocromo oxidasa (Laboratorio Britania, Bs. As., Argentina), crecimiento en agar MacConkey (Difco), reducción de nitrato (Difco), producción de indol en agar sulfuro indol movilidad (Difco), descarboxilación de ornitina (Difco) y producción de ureasa (Difco). Cada aislamiento fue inoculado en caldo base rojo de fenol (Difco), al que se le adicionaron los siguientes carbohidratos al 1%: glucosa, manosa, ara-binosa, dulcitol, lactosa, maltosa, manitol, sacarosa, trehalosa, sorbitol y xilosa (ICN Biomedicals, Aurora, Ohio, EE.UU.). Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
La tipificación capsular se realizó en el Laboratorio de Diagnóstico Microbiológico USGS (Wisconsin, EE.UU.) utilizando la técnica de PCR múltiple, descripta por Townsend et al. (14). La serotipificación somática se realizó mediante la técnica de inmunodifusión, acorde con la metodología descripta por Heddleston et al. (5), empleando antisueros provistos por el National Veterinary Services Laboratory (Ames, Iowa, EE.UU.).
Se evaluó la sensibilidad de las cepas a los siguientes antimicrobianos: aivlosin (Vetanco S.A., Vicente López, Bs. As., Argentina), ampicilina (ICN), cefalotina (ICN), ceftiofur (Vetanco), enrofloxacina (Vetanco), estreptomicina (Wako Pure Chemical Ltd., Osaka, Japón), florfenicol (Vetanco), gentamicina (ICN), tetraciclina (ICN), tiamulina (Laboratorios Aviar, Bs. As., Argentina), y tilosina (Laboratorios Aviar). La concentración inhibitoria mínima (CIM) se determinó mediante la técnica de microdilución (11). Cada cepa se evaluó por duplicado. La interpretación de los resultados se realizó teniendo en cuenta los valores definidos para P. multocida (10, 11), a excepción de gentamicina (otras bacterias no-Enterobacteriaceae), ampicilina, tetraciclina (Enterobacteriaceae), tiamulina (Actinobacillus pleuropneumoniae) y estreptomicina (E. coli) (12). Hasta el presente, los valores de corte para los macrólidos aivlosin y tilosina no se encuentran estandarizados.
Las cepas aisladas de aves antárticas y de gallinas reproductoras presentaron en agar sangre colonias pequeñas, de 2-3 mm de diámetro, opacas y adherentes al medio, mientras que las cepas aisladas de cerdos y humanos presentaron colonias mucosas y confluentes. Al microscopio óptico todas las cepas mostraron morfología de bacilos cortos gram-negativos, con coloración bipolar. Las 30 cepas aisladas en la Argentina y las 3 cepas de referencia fueron identificadas como P. multocida. Entre las cepas estudiadas se identificaron las 3 subespecies de P. multocida (Tabla 1). Veintidós cepas (73%) fueron identificadas como P. multocida subsp. multocida, cinco (17%) como P. multocida subsp. gallicida, y tres (10%) como P. multocida subsp. septica.
Si bien Mutters et al. (9) sugirieron que la capacidad de descarboxilar ornitina es útil para diferenciar las especies del género Pasteurella, Fegan et al. consideraron que el valor de esta prueba es limitado (4). Las cepas aisladas de aves antárticas fueron ornitina descarboxilasa negativas e identificadas como P. multocida subsp. gallicida. Sólo una cepa aislada de cerdo fue indol negativa, esto coincide con lo informado por Holmes et al. (6), quienes demostraron que el 80-89% de las especies del género Pasteurella son indol positivas. Fegan et al. (4) y Koneman et al. (8) describieron que P. multocida subsp. gallicida se caracteriza por producir ácido a partir de xilosa; sin embargo, 4 cepas de P. multocida subsp. gallicida aisladas en la Argentina y la cepa ATCC 51689 no utilizaron este hidrato de carbono. Según Koneman et al. (8), no todas las cepas de P. multocida subsp. gallicida producen ácido a partir de arabinosa; nosotros identificamos una cepa de P. multocida subsp. gallicida aislada de gallina arabinosa negativa. Por lo tanto, consideramos que la utilización de xilosa y arabinosa puede ser variable en la subespecie gallicida. En el presente trabajo se identificaron 2 cepas de P. multocida subsp. multocida de origen humano que utilizaron lactosa. Si bien P. multocida no se caracteriza por producir ácido a partir de lactosa, en raras ocasiones se pueden encontrar cepas lactosa positivas (8).
Considerando las particularidades fenotípicas mencionadas, las 30 cepas aisladas en la Argentina fueron agrupadas en 8 biotipos (Tabla 2). Entre estos biotipos se incluyeron las cepas de referencia NADC P-1059 y NADC P-1591. Sin embargo, la cepa de P. multocida subsp. gallicida ATCC 51689 presentó un perfil bioquímico diferente del de las cepas de P. multocida subsp. gallicida autóctonas.

Veintidós cepas (70%) presentaron el tipo capsular A, (8 cepas aisladas de gallinas reproductoras, 6 cepas aisladas de humanos, 5 cepas aisladas de cerdos y 3 cepas aisladas de aves antárticas). Cinco cepas aisladas de cerdos presentaron el tipo capsular D. Es interesante mencionar que si bien el tipo capsular D se asocia a rinitis atrófica porcina, las cepas analizadas fueron aisladas de pulmones de cerdos que no presentaban lesiones en la cavidad nasal. El serotipo somático 1 fue identificado con mayor frecuencia en las cepas de origen aviar y humano (n:11), y el serotipo 3 fue más frecuente entre las cepas de origen porcino (n:9).
Todas las cepas aisladas de humanos, de aves antárticas y de gallinas reproductoras fueron sensibles a ampicilina, cefalotina, ceftiofur, enrofloxacina, estreptomicina, florfenicol, gentamicina, tetraciclina y tiamulina. Los valores de CIM obtenidos con aivlosin estuvieron entre 64 y 256 µg/ml, y aquellos obtenidos con tilosina entre 16 y 64 µg/ml. Con las cepas de origen porcino se obtuvieron los valores más altos al realizar la CIM en microdilución con ambos macrólidos. Nueve cepas aisladas de cerdos presentaron resistencia a un antibiótico por lo menos; seis cepas fueron resistentes a tiamulina (32 µg/ml) y a estreptomicina (≥ 128 µg/ml), dos fueron resistentes a tiamulina (32 µg/ml), y una cepa fue resistente a tiamulina (32 µg/ml) y a tetraciclina (32 µg/ml) (Tabla 1). Esta resistencia podría adjudicarse a la utilización indiscriminada de antibióticos como terapia preventiva en las piaras.
Consideramos que el conocimiento de las características fenotípicas de cepas de P. multocida aisladas en la Argentina es un paso importante para la prevención y el tratamiento de la pasteurelosis en medicina humana y veterinaria, y que es necesario analizar un mayor número de cepas en el marco de estudios epidemiológicos.

Agradecimientos: al Dr. M. J. Wolcott (USGS-National Wildlife Health Center, Madison, Wisconsin, EE.UU.) por colaborar en la serotipificación de las cepas y por proveer las cepas de referencia. A la Dra. N. Leardini, al Dr. J. C. Perfumo y a la Méd. Vet. F. Moredo por su colaboración en el tema.

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Recibido: 10/4/06
Aceptado: 31/7/06