R. Lorenz^2,4*, E. de los A. Méndez^1,3, C. Ahumada¹, A. Nagel^1,2, C. Ramos^1,2, M. A. Mendosa^1,2, M. E. Nardín^1,2, S. Morano¹, A. Mollerach^1,2

¹Sección Microbiología, Laboratorio Central, Hospital "Dr. José María Cullen" Santa Fe; ²Carrera de Especialista en Bacteriología Clínica, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNL, Santa Fe; ³Cátedra de Bacteriología, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, UNL, Santa Fe; ⁴Clínica de Nefrología, Urología y Enfermedades Cardiovasculares. Avenida Freyre 2150 (3000) Santa Fe, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: roslorenz@hotmail.com

RESUMEN
La detección de Staphylococcus aureus meticilina-resistente (SAMR) representa un serio problema para el laboratorio de microbiología de baja y mediana complejidad. En el presente trabajo se evalúa la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo de placas de screening (AS) de cefoxitina (FOX) y cefotaxima (CTX) (8 y 16 µg/ml), con 4% de NaCl o sin agregado de sal, para la detección de SAMR. El AS oxacilina (OXA) y el test de aglutinación MRSA-Screen Latex para detección de PLP2a se utilizaron como métodos de referencia. El 100% de las cepas PLP2a positivas (94 cepas) fueron detectadas como SAMR por el AS FOX (8 µg/ml) y por el AS CTX (8 µg/ml, con 4% de NaCl). La ventaja del AS FOX (8 µg/ml) es que no requiere de NaCl y la del AS CTX (8 µg/ml, con 4% de NaCl), que CTX es un antimicrobiano fácilmente disponible en nuestro país.
Palabras clave: Staphylococcus aureus meticilina-resistente, cefoxitina, cefotaxima

ABSTRACT
Evaluation of cefoxitin and cefotaxime screening plates for the detection of methicillin-resistance in Staphylococcus aureus. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates represents a serious problem to low and media level microbiology labs. In this work cefoxitin (FOX) and cefotaxime (CTX) screen plates (AS) (8-16 µg/ml) with and without 4% of NaCl were evaluated to detect MRSA. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values were determined. The AS oxacillin and the agglutination test MRSA-Screen Latex for the detection of PLP2a were used as reference methods for the evaluation of the different studied screening plates. The 100% (94 strains) PLP2a positive were detected as MRSA with FOX (8 µg/ml), and CTX (8 µg/ml with 4% NaCl) AS. The advantage of FOX AS (8 µg/ml) is that it does not need the addition of NaCl, and CTX AS (8 µg/ml with 4% NaCl) is that cefotaxime is an antimicrobial easily accessible in our country.
Key words: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, cefoxitin, cefotaxime

Staphylococcus aureus meticilina-resistente (SAMR) ha emergido en las últimas décadas como patógeno nosocomial y, recientemente, a nivel comunitario.
El mecanismo más importante de resistencia a la meticilina es la expresión de una proteína ligadora de penicilina (PLP) denominada (PLP2a), la cual es codificada por el gen mecA y se caracteriza por presentar muy baja afinidad por los antibióticos ß-lactámicos.
SAMR posee resistencia cruzada a oxacilina (OXA), y diversas investigaciones demostraron que este antimicrobiano podía ser utilizado en las pruebas de sensibilidad por ser más estable (5).
Varios factores influyen en la expresión del fenotipo resistente, los que deben ser considerados al realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos, como el agar screening (AS) OXA y el antibiograma por difusión con discos. Estas condiciones se refieren a la incorporación de cloruro de sodio (NaCl) al medio, al pH, a la densidad de los inóculos, a la temperatura de incubación, que puede ser de 30 o 35 °C (no superior a 35 °C), y al tiempo de incubación (24 h). Las cepas que son heterogéneas a 37 °C pueden aparecer homogéneamente resistentes a 30 °C o con el agregado de 4% de NaCl al medio (1, 3, 7, 14, 15).
Tradicionalmente, la detección fenotípica de SAMR se realizaba utilizando el método de difusión con disco de OXA (1µg). En el 2004, el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) –en la actualidad, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)– propuso la utilización del disco de cefoxitina (FOX) (30 µg) (2, 9). El uso de ambos discos aumenta la sensibilidad y especificidad en la detección de la resistencia mediada por el gen mecA.
El AS OXA constituye el método fenotípico de referencia para determinar resistencia a meticilina en cepas de S. aureus (8, 10, 12, 13).
En el año 2002, el NCCLS aceptó la detección de la PLP2a como método alternativo para la evaluación de meticilina-resistencia en S. aureus (10).
La detección del gen mecA es considerada el gold standard (6, 9, 15, 24, 32); sin embargo, en nuestro país su realización rutinaria en laboratorios clínicos aún resulta poco práctica y de alto costo, y su estudio se restringe a grupos de investigación (11).
La detección de SAMR continúa siendo un problema para los laboratorios de mediana complejidad. A pesar de ser OXA la droga de elección; en nuestro país se hace difícil acceder a ella y tiene un costo relativamente elevado.
Debido a la importancia de la detección de estas cepas y a la dificultad de utilizar AS OXA, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) del AS cefoxitina (FOX) y del AS ce-fotaxima (CTX) (8 y 16 µg/ml), con 4% de NaCl o sin la inclusión de la sal, usando el AS OXA y la prueba de aglutinación MRSA-Screen Latex para la detección de PLP2a como métodos de referencia.
Se analizaron 200 cepas consecutivas y no seleccionadas de S. aureus aisladas de muestras clínicas. El 47% de las cepas (94) eran SAMR; el 53% restante (106), SAMS. Para la detección de SAMR se utilizó la prueba MRSA-Screen Latex (Denka Seiken, Niigata, Japón).
Se prepararon AS con los siguientes antimicrobianos de potencia certificada: OXA (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo.), FOX (Merck Sharp & Dohme, Argentina) y CTX (Northia, Argentina).
– Agar Mueller Hinton con 6 µg/ml de OXA
– Agar Mueller Hinton con 8 µg/ml de FOX y 4% P/V NaCl
– Agar Mueller Hinton con 8 µg/ml de FOX
– Agar Mueller Hinton con 16 µg/ml de FOX y 4% P/V NaCl
– Agar Mueller Hinton con 16 µg/ml de FOX
– Agar Mueller Hinton con 8 µg/ml de CTX y 4% P/V NaCl
– Agar Mueller Hinton con 8 µg/ml de CTX
– Agar Mueller Hinton con 16 µg/ml de CTX y 4% P/V NaCl
– Agar Mueller Hinton con 16 µg/ml de CTX

Para la selección de las concentraciones de los AS estudiados, se tuvieron en cuenta los puntos de corte del NCCLS (9) para cada antimicrobiano: FOX (8-32 µg/ml) y CTX (8-64 µg/ml) para cepas sensibles y resistentes, respectivamente.
Se utilizó un inóculo estandarizado; para ello se realizó una suspensión de cada aislamiento a partir de cultivos de 24 h, acorde con un equivalente de turbidez del estándar 0,5 de Mc Farland.
La siembra se realizó con hisopo, el inóculo se dispersó en un área de 10-15 mm de diámetro. Las placas se incubaron a 35 °C durante 24 h en atmósfera aeróbica.
La visualización de cualquier número de colonias se consideró positivo y la ausencia de crecimiento, negativo. Cepas de referencia: S. aureus ATCC 43300 (resistente a la meticilina) y S. aureus ATCC 29213 (débilmente productora de ß-lactamasa, sensible a la meticilina).
Los resultados obtenidos en el AS FOX y el AS CTX se muestran en la Tabla 1. Los porcentajes de S y VPN de los distintos AS estudiados se muestran en la Tabla 2.

El 100% de las cepas de S. aureus PLP2a negativas (106) fueron identificadas como SAMS por todos los AS estudiados, no hubo resultados falsos positivos (errores mayores), la E y el VPP fueron del 100% para todos los AS ensayados.
El 100% de las cepas de S. aureus PLP2a positivas (94) fueron identificadas como SAMR por el AS FOX (8 µg/ml) y el AS CTX (8 µg/ml, con 4% de NaCl).
Se pudo observar una S, una E, un VPP y un VPN del 100% con el AS FOX (8 µg/ml) y el AS CTX (8 µg/ml, con 4% de NaCl). La ventaja de la utilización del AS FOX es que no requiere NaCl, lo cual facilita su preparación; y la ventaja del AS CTX radica en que es un antimicrobiano fácilmente disponible en nuestro país.
Este trabajo intentó proponer un nuevo método fenotípico de referencia para la detección de SAMR en el laboratorio de microbiología, considerando que la OXA es costosa y de difícil acceso en nuestro medio.
Los excelentes resultados obtenidos con el AS FOX (8 µg/ml) y el AS CTX (8 µg/ml, con 4% de NaCl) ameritan continuar el estudio con un mayor número de aislamientos para establecer un nuevo método de screening de referencia, accesible a los laboratorios de nuestro país.

Agradecimiento: a la Profesora Elena Carreras y a todo su equipo por la valiosa colaboración en el análisis de datos.

BIBLIOGRAFÍA
1. Annear DI. The effect of temperature on resistance of Staphylococcus aureus to methicillin and some other antibiotics. Med J Aust 1968; 1: 444-6.         [ Links ]
2. Boutiva-Ben Boubaker I, Ben Abes R, Ben Abdallah H, Mamlouk K, Mahjoubi S, Kamnoun A et al. Evaluation of a cefoxitin disc diffusion test for the routine detection of methicillin-resistance. J Clin Microbiol 2004; 10: 762-5.         [ Links ]
3. Chambers HF, Hackbarth CJ. Effect of NaCl and nafcillin on penicillin-binding protein 2a and heterogeneous ex-pression of methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1987; 31: 1982-8.         [ Links ]
4. Chung M, De Lencastre H, Matthews P, Tomasz A, and the Multilaboratory Project Collaborators. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by pulsed field gel electrophoresis: comparison of results obtained in a multilaboratory effort using identical protocols and MRSA strains. Microb Drug Resist 2000; 6: 189-98.         [ Links ]
5. De Lencastre H, Figueiredo AM, Urban C, Rahal J, Tomasz A. Multiple mechanisms of methicillin-resistance and improved methods for detection in clinical isolates of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 632-9.         [ Links ]
6. Geha G, Uhl J, Gustaferro C, Persing D. Multiplex PCR for identification of methicillin-resistant staphylococci in the clinical laboratory. J Clin Microbiol 1994; 32: 1768-72.         [ Links ]
7. Hartman BJ, Tomasz A. Expression of methicillin-resistance in heterogeneous strains of Staphylococcus aureus. Anti-microb Agents Chemother 1986; 29: 85-92.         [ Links ]
8. Jorgensen J, Ferraro M. Antimicrobial susceptibility testing: special needs for fastidious organisms and difficult to detect resistant mechanisms. Clin Infect Dis 2000; 30: 799-808.         [ Links ]
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 14^th informational supplement, 2004; M100-S14. Wayne, Pa, USA.         [ Links ]
10. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 12^th informational supplement, 2002; M100-S12. Wayne, Pa, USA.         [ Links ]
11. Sola C, Gribaudo G, Córdoba MRSA Collaborative Study Group, Vindel A, Patrito L, Bocco JL. Identification of a novel methicillin-resistant Staphylococcus aureus epidemic clone in Córdoba, Argentina, involved in nosocomial infections. J Clin Microbiol 2002; 40: 1427-35.         [ Links ]
12. Soloaga R, Corso A, Gagetti P, Faccone D, Galas M, Grupo Colaborador MRSA. Detección de meticilino-resistencia en S. aureus: comparación de métodos convencionales y aglutinación con MRSA-Screen Latex. Rev Argent Microbiol 2004; 36: 36-40.         [ Links ]
13. Soloaga R, Procopio A, Aguilar J, Dutruel A, Labat R, Domínguez M et al. Comparación de diferentes métodos para la detección de resistencia a meticilina en Staphylococcus aureus. Rev Argent Microbiol 2002; 34: 52-6.         [ Links ]
14. Thornsberry C, Caruthers JQ, Baker CN. Effect of temperature on the in vitro susceptibility of Staphylococcus aureus to penicillinase - resistant penicillins. Antimicrob Agents Chemother 1973; 4: 263-9.         [ Links ]
15. Tomasz A, Nachman S, Leaf H. Stable classes of phenotypic expression in methicillin - resistant clinical isolates of staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 124-9.        [ Links ]

Recibido: 27/12/05
Aceptado: 07/8/06