M. N. Almuzara*, C. De Mier, C. R. Rodríguez, A. M. R. Famiglietti, C. A. Vay

Laboratorio de Bacteriología, Departamento de Bioquímica Clínica, Hospital de Clínicas "José de San Martín", Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. Avenida Córdoba 2351 (1120) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*E mail: marisaalmuzara@arnet.com.ar

RESUMEN
Se evaluó la capacidad del sistema API Coryne, versión 2.0, (bioMérieux) para identificar 178 cepas de bacilos gram-positivos: 78 del género Corynebacterium y 100 de géneros relacionados, aislados de muestras clínicas de pacientes atendidos en el Hospital de Clínicas José de San Martín (UBA) en el período 1995-2004. Los aislamientos fueron identificados de acuerdo al esquema de von Graevenitz y Funke. Sobre un total de 178 cepas, 162 (91%) fueron correctamente identificadas a nivel de género y especie (IC₉₅ = 85,6- 94,6 ), 44 de ellas (24,7%) requirieron el uso de pruebas adicionales para la identificación definitiva. En 16 cepas (9%) no se llegó a la identificación correcta (IC₉₅= 5,4-14,4 ) y no hubo cepas no identificadas. API Coryne versión 2.0 es un sistema útil para la identificación de la mayoría de las especies de Corynebacterium de importancia clínica: Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium amycolatum y de las especies relacionadas Arcanobacterium haemolyticum, Dermabacter hominis, Listeria monocytogenes, entre otros. No obstante para bacilos gram-positivos difteroides que presentan pigmento amarillo (Aureobacterium spp, Leifsonia aquatica, Microbacterium spp. y Cellulomonas spp.) y para bacilos gram-positivos ácido resistentes (Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella y Nocardia), la utilidad en la identificación del género es limitada.
Palabras clave: bacilos gram-positivos, API Coryne (versión 2.0), identificación bacteriana

ABSTRACT
Evaluation of API Coryne system, version 2.0, for diphteroid gram-positive rods identification with clinical relevance. The ability of the API Coryne system, version 2.0, to identify 178 strains of gram-positive rods was evaluated. Seventy eight isolates belonged to genus Corynebacterium and one hundred to related genera, all strains were isolated from clinical samples at the Laboratory of Bacteriology, Hospital de Clínicas José de San Martín (UBA) between 1995 and 2004.The isolates were identified according to von Graevenitz and Funke's scheme. One hundred and sixty two out of 178 strains (91%) were correctly identified at genus and species level (IC₉₅= 85.6-94.6), in 44 of them (24.7%) additional tests were needed to final identification. Sixteen strains (9%) were not correctly identified (IC₉₅=5.4-14.4); none of the 178 strains remained unidentified. The API Coryne system, version 2.0, is useful to identify the majority of Corynebacterium species with clinical relevance: Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium amycolatum and related species such as Arcanobacterium haemolyticum, Dermabacter hominis, Listeria monocytogenes, among others. Nevertheless for yellow-pigmented diphteroid gram-positive rods (Aureobacterium spp., Leifsonia aquatica, Microbacterium spp. and Cellulomonas spp.) and for acid fast gram-positive rods (Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella and Nocardia) the identification usefulness the system is limited.
Key words: gram-positive rods, API Coryne (version 2.0), bacterial identification

Con excepción de las especies del grupo "Corynebacterium diphtheriae", los bacilos gram-positivos difteroides son bacterias oportunistas que pueden ocasionar infecciones preferentemente en pacientes inmunocomprome-tidos o con enfermedades predisponentes (1). Durante los últimos años el número de casos publicados en los que se los asocia con enfermedad infecciosa se ha incrementado notoriamente (9).
La identificación de las bacterias corineformes es uno de los mayores desafíos que enfrenta el laboratorio de bacteriología clínica. Esto es debido principalmente a la enorme diversidad de estos microorga-nismos y al número relativamente pequeño de pruebas bioquímicas convencionales disponibles para su diferenciación. Sin embargo, un esfuerzo se debería realizar en este sentido cuando el microorganismo se halla en un cultivo puro del espécimen clínico o predomina en una muestra proveniente de una cavidad cerrada. No obstante, la identificación mediante la metodología convencional es a menudo dificultosa y requiere de varios días para determinar correctamente el género y/o la especie.
API Coryne , versión 2.0, es un sistema manual capaz de identificar en 24 horas a 49 especies de bacterias corineformes encontradas habitualmente en clínica. Contiene 20 pruebas, 11 enzimáticas y 8 de utilización de hidratos de carbono, con su correspondiente control.
El objetivo de este trabajo fue comparar la habilidad del sistema API Coryne, versión 2.0, para la identificación de bacilos gram-positivos difteroides con respecto a la metodología convencional, la que fue considerada como método de referencia.
Se estudiaron un total de 178 bacilos gram-positivos difteroides provenientes de aislamientos clínicos de diferentes materiales biológicos de pacientes atendidos en el Hospital de Clínicas "José de San Martín" en el período comprendido entre enero de 1995 y julio de 2004.
Todas las cepas fueron conservadas en leche descremada a –70 °C hasta el momento de su estudio, y subcultivadas en agar base Columbia con 5% de sangre a 35 °C en atmósfera ambiente durante 18 a 24 horas antes de ser inoculadas en el sistema, excepto en el caso de las especies lipofílicas de Corynebacterium que fueron subcultivadas en agar base Columbia con 5% de sangre y 0,1-1% de Tween 80.
Los microorganismos fueron identificados a nivel de género y especie mediante el uso de pruebas convencionales de acuerdo a la metodología previamente descrita por von Graevenitz y Funke (15), la cual fue considerada método de referencia. Se trató de un estudio comparativo no ciego entre un método miniaturizado ( API Coryne, versión 2.0) y un método de referencia (pruebas bioquímicas convencionales).
Las galerías de API Coryne (bioMérieux, Marcy L'Étoile, France) fueron inoculadas e interpretadas de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Los biocódigos fueron ingresados en la base de datos APILAB versión 2.0.
Los primeros 11 pocillos (reducción del nitrato, pirazinamidasa, pirrolidonil arilamidasa, fosfatasa alcalina, ß-glucuronidasa, ß-galactosidasa, -glucosidasa, N-acetil ß-glucosaminidasa, hidrólisis de la esculina, ureasa, hidrólisis de gelatina) fueron inoculados con una suspensión bacteriana equivalente al tubo N° 6 de la escala de Mc Farland. Se llenó el tubo y la cúpula con la suspensión. El pocillo correspondiente a la prueba de ureasa se llenó con aceite de parafina estéril. Los últimos 9 pocillos (control de fermentación de hidratos de carbono, fermentación de: glucosa, ribosa, xilosa, manitol, maltosa, lactosa, sacarosa, y glucógeno), con la mezcla resultante de la adición de 0,5 ml de la suspensión del microorganismo equivalente al tubo N° 6 de la escala de Mc Farland en un medio enriquecido que contenía un indicador de pH (GP medium). Las cúpulas se llenaron con aceite de parafina estéril.
Cada galería fue incubada en cámara húmeda a 35-37 °C durante 24 horas. La reacción de catalasa (prueba 21 de la galería) se realizó añadiendo una gota de agua oxigenada al 3% en la prueba de esculina o gelatina. La aparición de burbujas se interpretó como prueba positiva. El pocillo de nitratos fue revelado por adicción de los reactivos 1 (ácido sulfanílico-ácido acético) y 2 (N,N-dimetil-1-naftilamina). Los pocillos con enzimas (pirazinamidasa, pirrolidonil arilamidasa, fosfatasa alcalina, ß-glucuronidasa, ß-galactosidasa, ?-glucosidasa, N-acetil ß-glucosaminidasa) fueron revelados con 1 gota del reactivo ZYM A (Tris-hidroximetil-aminometano y lauril sulfato de sodio) y una gota de ZYM B (Fast Blue BB) y leídas luego de 10 minutos.
La lectura de las reacciones se llevó a cabo utilizando la guía del fabricante y se codificó el conjunto de los resultados obtenidos en un perfil numérico (biocódigo) el cual fue leído en un programa computarizado (versión 2.0).
Se consideró "identificación correcta" cuando el sistema indicó que el biocódigo obtenido correspondía a una identificación excelente, muy buena o buena, y coincidió con la identificación por el método patrón. La expresión "baja discriminación" fue aceptada como correcta, cuando el microorganismo pudo ser identificado mediante el uso de pruebas adicionales sugeridas por el fabricante. Se consideró "identificación incorrecta" cuando el bio-código correspondió a una especie diferente de la identificada por el método patrón.
Se calificó como correcta la identificación de Corynebacterium xerosis cuando el sistema indicó Corynebacterium striatum-Corynebacterium amycolatum dado que C. xerosis no se encuentra en la base de datos de API Coryne, versión 2.0.
Análisis estadístico: se calculó la sensibilidad por fórmula (VP / VP + FN) x 100 y el correspondiente intervalo de confianza del 95% (IC₉₅) con paquete estadístico EPIINFO 6.04 (Atlanta Univ.).
Los resultados de la identificación de 178 cepas de bacilos gram-positivos difteroides por el sistema API Coryne, versión 2.0 se muestran en la Tabla 1.

Sobre un total de 178 cepas, 162 (91%) fueron correctamente identificadas a nivel de género y especie (IC₉₅ = 85,6- 94,6), 44 de ellas (24,7 %) requirieron el uso de pruebas adicionales para la identificación definitiva. En 16 cepas (9%) no se llegó a la identificación correcta (IC₉₅= 5,4-14,4 ). Ninguna cepa resultó en la categoría no identificada.
API Coryne identificó el total de los aislamientos de Corynebacterium urealyticum, de Corynebacterium CDC Grupo F, y de otras especies relacionadas como Dermabacter hominis sin la necesidad de pruebas adicionales. Según los resultados del presente trabajo, y de acuerdo con otros autores (8, 9), el sistema no permite separar C. striatum de C. amycolatum, ni Aureobacterium spp. de Leifsonia aquatica. Según la literatura, tampoco discrimina Cellulomonas spp. de Microbacterium spp., Corynebacterium afermentans de Corynebacterium coyleae y Corynebacterium auris de Turicella otitidis (8, 9). Para alcanzar la identificación definitiva fueron necesarias las pruebas adicionales sugeridas por el fabricante, pero muchas de ellas no se hallan disponibles en el laboratorio clínico. Es por eso que en algunos de estos casos hemos sugerido para tal fin pruebas sencillas alternativas (basadas en la literatura y en nuestra experiencia previa) (Tabla 2).

La asimilación de ácido fenilacético propuesta por API Coryne para separar C. striatum de C. amycolatum es una prueba que no se encuentra normalmente al alcance de un laboratorio de baja o mediana complejidad, por lo que proponemos separar estas especies utilizando la sensibilidad al compuesto vibriostático O129 (150 µg), la hidrólisis de la tirosina y la prueba de CAMP (9) (Tabla 2). Además, la multirresistencia antibiótica generalmente está asociada con C. amycolatum (7, 13).
La mayoría de las cepas de Corynebacterium afermentans fueron identificadas con muy baja discriminación puesto que el sistema no puede discriminar entre C. afermentans y Corynebacterium coyleae. Para ello recurre a pruebas adicionales: el tipo de metabolismo (fermentativo en C. coyleae y oxidativo en C. afermentans) y la reacción de CAMP (positiva en C. coyleae y variable en C. afermentans). No obstante, cabe aclarar que C. coyleae es un fermentador lento (6), por lo que es necesario prolongar el tiempo de incubación de los hidratos de carbono para detectar acidez. C. afermentans subsp. lipophilum no está incluido en la base de datos de API Coryne versión 2.0 pero su perfil numérico (2100004) es el mismo que el de C. afermentans; la única diferencia es la lipofilicidad de C. afermentans subsp. lipophilum (colonias < 0,5 mm de diámetro en agar base Columbia con 5% de sangre ovina a las 24 horas de incubación). El biocódigo obtenido para C. afermentans (2100004 ) coincide con el de Corynebacterium auris y Turicella otitidis. Para separar estas tres especies, el sistema propone la combinación de tres pruebas: CAMP, asimilación de L-aspartato y de D-manosa. No obstante, la identificación definitiva de estas especies se alcanza en laboratorios de referencia por la utilización de hidratos de carbono (9).
El sistema tampoco separa Aureobacterium spp. de Leifsonia aquatica y propone la hidrólisis de la caseína como prueba diferencial. Otras dos características: la hidrólisis de la gelatina y el tiempo de desarrollo de pigmento amarillo pueden utilizarse para diferenciar ambas especies (Tabla 2) (10).
De siete aislamientos de Microbacterium spp. identificados como Microbacterium-Cellulomonas, dos requirieron de pruebas adicionales. La prueba diferencial que propone el sistema para separar estos dos géneros es el crecimiento a 42 °C. La combinación de algunas pruebas, como la reducción de nitratos y la fermentación de la xilosa (Tabla 2) pueden ser usados para separar estos géneros, según la literatura (3) y sobre la base de nuestra propia experiencia. La mayoría de las especies de Cellulomonas expresan actividad de celulasa (5), pero la única especie reconocida en especímenes humanos, Cellulomonas hominis, no presenta esta actividad, por lo que la diferenciación entre C. hominis y Microbacterium spp. sólo se obtiene a través de estudios quimiotaxonómicos (9).
La mayoría de los aislamientos de Arthrobacter (7 de 11) fueron identificados de forma errónea; además, 2 aislamientos requirieron pruebas adicionales para separar Arthrobacter de Brevibacterium. Las pruebas convencionales no permiten separar fehacientemente ambos géneros, pues comparten varias características fenotípicas: ambos poseen metabolismo oxidativo, presentan ciclo coco-bacilo (morfología corineforme luego de una incubación de 24 horas y principalmente cocoide después de 72 horas) y expresan actividad de DNasa y de gelatinasa (4). La presencia de movilidad, de actividad hidrolítica de urea o de esculina son las únicas características fenotípicas disponibles hasta el momento para descartar el género Brevibacterium (Tabla 2). Además, muchas de las cepas de Brevibacterium aisladas de materiales clínicos humanos tienen un olor distintivo a queso o a transpiración humana (2, 9), que no muestran los aislamientos de Arthrobacter (4)
Las ocho cepas de Listeria monocytogenes fueron identificadas correctamente como L. monocytogenes-Listeria innocua. La presencia de beta hemólisis y la reacción de CAMP con Staphylococcus aureus ATCC 25923, pruebas sugeridas por el fabricante, son complementarias para diferenciar estas especies (L. monocytogenes: ambas pruebas positivas y L. innocua: ambas pruebas negativas) y, por ende, no pueden incluirse en el sistema.
La mayoría de las cepas del género Rhodococcus fueron identificadas con el recurso de pruebas adicionales, en coincidencia con lo publicado por otros autores (8). Funke et al. consideran que API Coryne, versión 2.0, presenta sólo un valor limitado para la identificación de las especies bacterianas ácido-resistentes: Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella, Dietzia y Nocardia (8).
Freney et al. (1) estudiaron la versión 1.0 de API Coryne en el año 1991, cuando fue introducido en el mercado. De 240 aislamientos de bacilos gram-positivos difteroides analizados, el 97,6% fue correctamente identificado en concordancia con los resultados obtenidos por el método convencional: 158 (65,8%) sin la necesidad de ensayos complementarios, 76 (31,8%) requirieron de pruebas adicionales, 6 (2,5%) no fueron identificados y 6 (2,5%) fueron identificados de forma incorrecta. Otro estudio realizado por Gavin et al. (11) demostró que API Coryne, versión 1.0, identificó 90 (86,5%) de 104 cepas del género Corynebacterium pero sólo 8 (36,4%) de 22 cepas de otros géneros corineformes relacionados, en ambos casos sin necesidad de pruebas complementarias. Soto, Zapardiel y Soriano encontraron que API Coryne identificó correctamente 105 (65,6%) de 160 aislamientos y un adicional de 35 difteroides (21,8%) fueron identificados con el uso de pruebas complementarias (14). Un trabajo de Funke et al. publicado en 1997, fue el primero en mostrar resultados del empleo de la versión 2.0. En este estudio multicéntrico se incluyeron 407 cepas de bacterias corineformes (géneros Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix, Rhodococcus, Gordonia y Dietzia): 390 pertenecían a las 49 taxas incluidas en la base de datos 2.0 y 17 a taxas no incluidas. El resultado obtenido con estas 17 cepas no se tomó en cuenta en el momento de evaluar la eficiencia del sistema. El 90,5% de las cepas que pertenecían a las taxas incluidas en la base de datos fueron identificadas correctamente (55,1% requirieron de pruebas adicionales), 5,6% no fueron identificadas y 3,8% fueron identificadas de forma errónea. Los principales problemas de identificación fueron observados con Corynebacterium coyleae, Propionibacterium acnes y con Aureobacterium spp. (incluídos en la base de datos del sistema). Nuestro principal problema de identificación fue con el género Arthrobacter aunque no incluimos cepas de C. coyleae. La base de datos de API Coryne ha sido actualizada para incluir algunas de las taxas descritas recientemente: la versión 1.0 contenía 33 taxas, mientras que la versión actualizada 2.0 contiene 49 taxas e incluye no sólo los géneros Corynebacterium, Listeria y Erysipelothrix sino también otros recientemente descritos como Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Dermabacter y Turicella (12).
En nuestra experiencia y en coincidencia con Funke et al. (8), API Coryne, versión 2.0, es un sistema útil para la identificación de la mayoría de las especies de Corynebacterium de importancia clínica como C. jeikeium, C. urealyticum, C. striatum, C. pseudodiphtheriticum, C. amycolatum y de otros bacilos difteroides como Arcanobacterium haemolyticum, Dermabacter hominis y Listeria monocytogenes. Para ciertos bacilos gram-positivos con pigmento amarillo como Aureobacterium spp., Leifsonia aquatica, Microbacterium spp. y Cellulomonas spp., y para bacilos que presentan ácido resistencia como Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella y Nocardia, parecen ser necesarios, según la literatura, estudios adicionales para lograr la identificación definitiva (8).
Finalmente debemos destacar la valiosa información que brindan la morfología cultural y microscópica, el tipo de metabolismo, la presencia de pigmento y la hemólisis. Recordemos que estas características no están incluidas en ningún método comercial y son imprescindibles para la identificación de las bacterias corineformes. Además, se debe tener en cuenta que cuando un bacilo gram-positivo posee metabolismo oxidativo debe evaluarse su ácido resistencia, puesto que en este grupo residen micobacterias, Nocardia, y otros actinomicetos "Kinyoun positivos" que no pueden identificarse a través de sistemas comerciales y cuyo impacto clínico puede ser relevante.

Agradecimientos: este trabajo fue realizado con el apoyo del proyecto UBACyT B080.

BIBLIOGRAFÍA
1. Freney J, Duperron MT, Courtier C, Hansen W, Allard F, Boeufgras JM et al. Evaluation of API Coryne in comparison with conventional methods of identifying coryneform bacteria. J Clin Microbiol 1991; 29: 38-41.         [ Links ]
2. Funke G, Carlotti A. Differentiation of Brevibacterium spp. encountered in clinical specimens. J Clin Microbiol 1994; 32: 1729-32.         [ Links ]
3. Funke G, Falsen E, Barreau C. Primary identification of Microbacterium spp. encountered in clinical specimens as CDC coryneform group A-4 and A-5 bacteria. J Clin Microbiol 1995; 33: 188-92.         [ Links ]
4. Funke G, Hutson RA, Bernard KA, Pfyffer GE, Wauters G, Collins MD. Isolation of Arthrobacter spp. from clinical specimens and description of Arthrobacter cumminsii sp. nov. and Arthrobacter woluwensis sp. nov. J Clin Microbiol 1996; 34: 2356-63.         [ Links ]
5. Funke G, Pascual Ramos C, Collins MD. Identification of some clinical strains of CDC coryneform group A-3 and A-4 bacteria as Cellulomonas species and proposal of Cellulomonas hominis sp. nov. for some group A-3 strains. J Clin Microbiol 1995; 33: 2091-7.         [ Links ]
6. Funke G, Pascual Ramos C, Collins MD. Corynebacterium coyleae sp. nov. isolated from human clinical specimens. Int J Syst Bacteriol 1997; 47: 92-6.         [ Links ]
7. Funke G, Punter V, von Graevenitz A. Antimicrobial susceptibility patterns of some recently established coryneform bacteria. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 2874-8.         [ Links ]
8. Funke G, Renaud FNR, Freney J, Riegel P. Multicenter evaluation of the updated and extended API (Rapid) Coryne Database 2.0. J Clin Microbiol 1997; 35: 3122-6.         [ Links ]
9. Funke G, von Graevenitz A, Clarridge JE, Bernard KA. Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 125-59.         [ Links ]
10. Funke G, von Graevenitz A, Weiss N. Primary identification of Aureobacterium spp. isolated from clinical specimens as "Corynebacterium aquaticum". J Clin Microbiol 1994; 32: 2686-91.         [ Links ]
11. Gavin SE, Leonard R, Briselden AM, Coyle MB. Evaluation of the rapid Coryne identification system for Corynebacterium species and others coryneforms. J Clin Microbiol 1992; 30: 1692-5.         [ Links ]
12. Janda WM. The corynebacteria revisited: New species, identification kits, and antimicrobial susceptibility testing. Clin Microbiol Newsl 1999; 21: 175-82.         [ Links ]
13. Riegel P, Ruimy R, Christen R, Monteil H. Species identities and antimicrobial susceptibilities of corynebacteria isolated from various clinical sources. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996; 15: 657-62.         [ Links ]
14. Soto A, Zapardiel J, Soriano F. Evaluation of API Coryne system for identifying coryneform bacteria. J Clin Pathol 1994; 47: 756-9.         [ Links ]
15. von Graevenitz A, Funke G. An identification scheme for rapidly and aerobically growing gram- positive rods. Zbl Bakt 1996; 284: 246-54.        [ Links ]

Recibido: 12/6/06
Aceptado: 27/11/06