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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.38 n.4 Ciudad Autónoma de Buenos Aires oct./dic. 2006

 

Listeria monocytogenes en alimentos: ¿son todos los aislamientos igual de virulentos?

V. López1, M. Suárez2, I. Chico-Calero2, J. Navas1, J. V. Martínez-Suárez1*

1Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Carretera de La Coruña km 7'5, 28040 Madrid, España. 2Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040 Madrid, España.
*E-mail: joaquin@inia.es

RESUMEN
Listeria monocytogenes es un patógeno humano que se transmite a través de los alimentos y que causa infecciones graves, con una alta tasa de mortalidad. A pesar de la ubicuidad del microorganismo, la tasa real de la enfermedad es bastante baja y se asocia casi siempre a condiciones predisponentes. Tradicionalmente se consideraba que los aislamientos presentes en los alimentos y en el ambiente tenían la misma capacidad patogénica que los aislamientos de origen clínico. Pero el análisis de mutaciones en los genes de determinados factores de virulencia (internalina, hemolisina, fosfolipasas, proteína de superficie ActA y proteína reguladora PrfA), los estudios cuantitativos realizados con cultivos celulares y la genética de poblaciones, están replanteando la discusión sobre la variabilidad de la virulencia de L. monocytogenes. A pesar de todos estos avances, no existe un único marcador que permita comprobar la virulencia de los aislamientos naturales de esta especie. Probablemente en el futuro, la combinación de diferentes marcadores moleculares permitirá detectar los alimentos contaminados sólo por los clones virulentos de L. monocytogenes, con lo que se mejorará la prevención de la listeriosis humana transmitida por alimentos.
Palabras clave: Listeria monocytogenes, alimentos, aislamientos avirulentos, atenuación de la virulencia

ABSTRACT
Foodborne Listeria monocytogenes: are all the isolates equally virulent?
Listeria monocytogenes is a foodborne human pathogen responsible for invasive infections presenting overall a high mortality. Despite the ubiquity of the microorganism, the actual disease rate is quite low and the disease is most often associated with an underlying predisposition. Foodborne and environmental isolates were traditionally considered of similar pathogenicity compared to clinical isolates. But the analysis of mutations in the genes encoding specific virulence factors (internalin, hemolysin, phospholipases, surface protein ActA and regulator protein PrfA), quantitative studies with cell cultures and population genetics have raised considerable concerns about virulence differences among L. monocytogenes strains. Despite this great step forward, there is not a single marker available to test the virulence of field isolates of this species. In the future, the combination of different molecular markers will probably allow the screening of food contamination by only the virulent clones of L. monocytogenes, thus improving the prevention of foodborne human listeriosis.
Key words: Listeria monocytogenes, foods, avirulent isolates, virulence attenuation

INTRODUCCIÓN

La listeriosis es una enfermedad infecciosa bacteriana grave del hombre y de los animales. La listeriosis humana es causada por Listeria monocytogenes y el consumo de alimentos contaminados es su origen fundamental. L. monocytogenes es un microorganismo saprofito y ubicuo en el ambiente, y está presente en bajo número en muchos alimentos, incluidos algunos que no necesitan ser cocinados antes de su consumo (43, 61, 63, 94, 95). Este microorganismo supone un problema grave para las empresas alimentarias debido a la dificultad que presenta su control en las plantas de procesado. Por todo ello, desde el punto de vista de la higiene y la salud alimentaria y pública, L. monocytogenes es un organismo prioritario en los planes de análisis de peligros y puntos de control críticos (APPCC) llevados a cabo en las industrias alimentarias, así como en los planes de prevención de enfermedades de las instituciones sanitarias (43, 68). En algunos países como Estados Unidos, las medidas adoptadas por la industria alimentaria en los últimos años han hecho disminuir la incidencia de la listeriosis humana (12).
Las graves manifestaciones clínicas características de la listeriosis (meningitis y/o encefalitis, abortos o infecciones neonatales, y septicemias) hacen que, aunque sea una enfermedad infecciosa de baja morbilidad, presente una alta mortalidad, con tasas que van del 13 al 34% (27), las más altas de todas las infecciones alimentarias (80).
La listeriosis humana puede presentarse como epidemias o en forma de casos esporádicos, y es fundamentalmente una infección de carácter oportunista que afecta sobre todo a mujeres embarazadas, recién nacidos, ancianos y adultos inmunodeprimidos, incluyendo a los afectados de SIDA (91).
Se sabe que la dosis infecciosa de L. monocytogenes es de, al menos, 102 células viables en el caso de los grupos de riesgo, y que esta cifra aumenta hasta 104 en el caso de la población sana. Sin embargo, aún existen muchas lagunas en la comprensión de la relación dosis-respuesta de la listeriosis humana y del papel que juega la virulencia de la cepa implicada, así como su interacción con el hospedador (43, 63). Por este motivo, en la actualidad se sigue considerando a todos los aislamientos de L. monocytogenes igual de patogénicos, aunque existen cada vez más estudios que indican que la virulencia varía de unas cepas a otras.

FACTORES DE VIRULENCIA DE Listeria Monocytogenes

Listeria monocytogenes es un parásito intracelular facultativo que entra en el hospedador de forma primaria a través del intestino. En los últimos años se han identificado un gran número de factores de virulencia involucrados en los pasos clave de este ciclo de vida intra-celular (26). El ciclo incluye la fagocitosis inducida por el propio patógeno, la lisis de la vacuola fagocítica, el movimiento en el citoplasma y la diseminación a las células vecinas (106) (Figura 1).

El ciclo comienza con la adhesión a la superficie de la célula eucariota y la subsecuente penetración de la bacteria dentro de la célula hospedadora mediante fa-gocitosis. El único mecanismo conocido que permite la unión covalente de las proteínas de superficie de la pared celular de bacterias gram-positivas a la célula eucariota requiere proteínas con una secuencia conservada LPXTG (Leu-Pro-X-Thr-Gly, donde X es cualquier aminoácido). En el genoma de L. monocytogenes se han detectado 41 genes que codifican para proteínas LPXTG. Las primeras proteínas de este tipo identificadas fueron la internalina (o InlA) y la proteína InlB, codificadas ambas por el operón inlAB (8, 55); la primera interviene en la adhesión e invasión de células epiteliales polarizadas, como las intestinales, mientras que InlB lo hace en el caso de células epiteliales no polarizadas, como los hepatocitos (81). Posteriormente se han descrito numerosos genes que codifican para proteínas del tipo de la internalina (inlC, inlC2, inlD, etc.). Existen muchas otras moléculas necesarias para la invasión y/o entrada de L. monocytogenes en la célula eucariota, entre las que se encuentran varias autolisinas (Ami, p60, Auto), una proteína fijadora de fibronectina (FbpA) y proteínas que también intervienen en fases posteriores del ciclo intracelular, como ActA (99) y la hemolisina o listeriolisina O (LLO) (26).
Una vez fagocitada, la bacteria es capaz de escapar del ambiente hostil del fagosoma gracias a la secreción de LLO, una hemolisina activa a bajo pH codificada por el gen hly y activada por tiol. LLO reconoce el colesterol de la membrana, forma poros y favorece la lisis de la membrana del fagolisosoma, lo que provoca la emigración de L. monocytogenes al citosol de la célula hospedadora (51, 67). La hemolisina de L. ivanovii tiene características que la diferencian de LLO (35, 36).
Además de esta toxina, L. monocytogenes secreta al medio extracelular dos fosfolipasas C asociadas con la virulencia, que pueden contribuir a dañar las membranas y a la correspondiente citolisis. Una de ellas, PI-PLC, tiene como sustrato específico al fosfatidilinositol (PI), está codificada por plcA y es capaz de romper los anclajes glicosil-PI. La otra, PC-PLC, es una lecitinasa codificada por plcB, que tiene un rango más amplio de sustrato, dado que hidroliza fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina (105). La lecitinasa es activada y atraviesa la pared bacteriana gracias a una metaloproteasa específica (Mpl) codificada por el gen mpl (109).
La glucosa actúa de represor de los genes de virulencia de L. monocytogenes (84). La glucosa-1-fosfato (G1P), que no produce este efecto, es el metabolito precursor y el producto primario de degradación del glucógeno, por lo que es abundante en las células de mamífero. Se ha demostrado que la G1P es fundamental para el crecimiento intracelular de L. monocytogenes (84). La multiplicación intracelular precisa un transportador de hexosa-fosfato (Hpt), que es homólogo del transportador de glucosa-6-fosfato (G6P) de la célula eucariota responsable de la entrada de G6P en el retículo endoplásmico desde el citosol (18, 34). Esta proteína también es responsable de la entrada de fosfomicina en el interior de la célula bacteriana, lo que explica su sensibilidad in vivo asociada con resistencia in vitro (97).
Una vez alcanzado el citoplasma, la bacteria utiliza el citoesqueleto de la célula hospedadora para desplazarse en su interior. El movimiento intracelular tiene lugar como consecuencia de un ensamblaje direccional de monómeros de actina de la célula hospedadora en uno de los polos de la bacteria, fenómeno aparentemente dirigido por la proteína de superficie ActA (99). Finalmente, algunas bacterias alcanzan la periferia de la célula infectada, entran en contacto con la membrana celular y forman protuberancias hacia la célula colindante en forma de evaginaciones citoplásmicas que contienen en su extremo una bacteria. Estas estructuras invasoras son fagocitadas y la bacteria queda encerrada en un fagosoma de doble membrana, en cuya rotura parece jugar un papel fundamental la lecitinasa (Figura 1). Al ser un mecanismo que permite la diseminación de la bacteria por los tejidos del hospedador sin entrar en contacto con los efectores humorales del sistema inmune, este fenómeno de paso directo de célula a célula es crucial en la patogénesis de la infección que causa L. monocytogenes (22). Este mecanismo también es el responsable de la formación de placas en los cultivos celulares, una característica que ha sido relacionada con la virulencia en ratones (104).
La secuenciación en el año 2001 del genoma completo de la primera cepa de L. monocytogenes y su comparación con el genoma de L. innocua permitió determinar que un 10% de los genes son diferentes en la especie patógena respecto de la no patógena (33). La comparación de los genomas de las diferentes especies del género Listeria muestra que las especies no patógenas han evolucionado a partir de progenitores patógenos por reducción de sus genomas (41).
Posteriormente se compararon los genomas de otras cepas de L. monocytogenes (de serotipo 1/2a y de serotipo 4b) (25, 75). Ello permitió identificar genes específicos de serotipo, y establecer que un 8% de las secuencias eran específicas del serotipo 4b, que es una diferencia similar a la que existe entre L. monocytogenes y L. innocua (25). De los 484 genes regulados durante el crecimiento intracelular de Listeria spp., 41 son específicos de L. monocytogenes, pero también existen 25 genes específicos del serotipo 1/2a que no están presentes en el genoma secuenciado de la cepa de serotipo 4b (41).
Todos estos resultados podrían explicar el potencial específico para la virulencia del serotipo 4b. Se puede decir, por tanto, que la diversidad genética que existe entre algunos serotipos de L. monocytogenes es tan grande como la que existe entre algunas especies de Listeria (26).
El análisis mediante microarrays construidos a partir de estos resultados y empleando un número mayor de cepas ha permitido comprobar que la mayoría de los genes de virulencia están presentes en todas las cepas de L. monocytogenes, pero que existen numerosas secuencias específicas de los grandes grupos genéticos en que se divide esta especie (divisiones o linajes) y de los diferentes serotipos (25). Incluso se ha detectado por primera vez que un gen implicado en la virulencia (aut) no está presente en el serotipo 4b, por lo que podrían existir más diferencias en la base genética de la virulencia de los distintos serotipos (26).
Los genes de virulencia de L. monocytogenes se organizan dentro de unidades genéticas conocidas como islas de patogenicidad, que son adquiridas por la bacteria por mecanismos de transferencia genética horizontal, algunas veces como parte de un elemento genético móvil, por lo cual son importantes en la evolución bacteriana (14). Seis de los genes de los factores de virulencia responsables del parasitismo intracelular de L. monocytogenes (prfA, plcA, hly, mpl, actA y plcB) están en una región del cromosoma de 9 kb conocida como "isla 1 de patogenicidad de Listeria" (Listeria pathogenicity island 1, LPI-1) o "agrupamiento de genes de virulencia" (virulence gene cluster, vgc) (Figura 2) (53, 106). La proteína reguladora PrfA es absolutamente indispensable para la expresión de la virulencia en las especies patógenas de Listeria (85). La expresión del regulón de virulencia a través de PrfA depende de diversas señales ambientales (38). Estas señales de activación incluyen temperatura alta (37 °C), condiciones de estrés y "secuestro" de componentes del medio de crecimiento celular por carbón activado (86); por otro lado, y como ya se ha mencionado, la expresión de los genes de virulencia a través de PrfA también está sujeta a represión por catabolito (84, 98).

A partir de la secuenciación del genoma de L. monocytogenes se han descubierto nuevos factores de virulencia, entre los que destacan nuevas proteínas de superficie del tipo de la internalina, las sortasas SrtA y SrtB (transpeptidasas que unen a la pared celular diferentes proteínas de superficie como la internalina), y una hidrolasa de sales biliares, BSH, que permite a la bacteria sobrevivir en el intestino y que no se encuentra en L. innocua (26).
Existe también una base de datos con los proteomas de Listeria, que facilita la asignación de funciones a los diferentes genes de los genomas secuenciados (24).

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE CEPAS

Los métodos de identificación de cepas han permitido caracterizar los subtipos y los grupos clonales de L. monocytogenes y asociarlos con fenotipos particulares, sobre todo con su potencial patogénico (107). Estas técnicas no sólo son herramientas muy valiosas para identificar los brotes epidémicos, sino también para prevenirlos, controlando las contaminaciones durante la producción y distribución de alimentos.
El estudio de los serotipos constituye una herramienta importante como primer nivel de diferenciación de las cepas de L. monocytogenes. La serotipificación se utiliza en todos los estudios epidemiológicos, a pesar de que posee una capacidad de discriminación bastante pequeña y que existen cepas no serotipables (48). Por ejemplo, L. monocytogenes se puede clasificar en 13 serotipos diferentes, mientras que algunos métodos genéticos diferencian más de 100 subtipos de esta especie (94). Los 13 serotipos están basados en las variaciones de los antígenos somáticos (O) y flagelares (H) detectadas mediante anticuerpos.
Junto con la serotipificación, los métodos moleculares empleados para estudiar los subtipos de esta especie han mejorado notablemente la caracterización de L. monocytogenes, permitiendo diferenciar cepas y clones (5). Los métodos moleculares más utilizados con L. monocytogenes son la amplificación al azar de polimorfismos del DNA (random amplification of polymorphic DNA, RAPD) (1, 60), la ribotipificación o estudio de polimorfismos en los genes de RNAs ribosómicos (ribotyping) (30, 95, 96), la electroforesis en gel en campo pulsante (pulsed field gel electrophoresis, PFGE) (54, 102) y, más recientemente, la secuenciación de DNA (10, 95, 96, 110). La electroforesis en gel en campo pulsante (Figura 3) es la técnica más utilizada en estudios epidemiológicos por su alta capacidad discriminatoria, ya que puede diferenciar cepas que se hallen muy próximas genéticamente, y también porque posee una buena reproducibilidad (2, 58, 59, 77, 92). Aunque esta técnica tiene un poder de discriminación mayor que la ribotipificación, la combinación de ambos métodos puede diferenciar un mayor número de subtipos moleculares (40). La electroforesis en gel en campo pulsante es, sin embargo, una técnica manual, delicada y lenta, por lo que no se presta al análisis microbiológico de los alimentos a tiempo real sino de forma retrospectiva. Es el método empleado por el Center for Disease Control and Prevention (CDC) de Estados Unidos en la red de vigilancia molecular de las infecciones alimentarias PulseNet USA. Esta red dispone de una base de datos de "pulsotipos" de aislamientos de alimentos y muestras clínicas de L. monocytogenes y otros patógenos, que es compartida por laboratorios de salud pública de ese país (31, 100).

Los avances que se están produciendo en la genómica bacteriana permitirán en los próximos años llevar a cabo el estudio de los subtipos moleculares de L. monocytogenes de forma mucho más fiable, identificando diferentes genes que podrán ser utilizados en técnicas diversas, como la comparación de secuencias de múltiples genes (multilocus sequence typing, MLST) (110), o de un único gen (single locus sequence typing, SLST) (95, 96) y mediante microarrays (11, 25).

IDENTIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS VIRULENTOS

Variabilidad de la virulencia en las poblaciones de Listeria monocytogenes
El dilema que se plantea en la evaluación y control de riesgos de la listeriosis alimentaria es que aunque la contaminación de determinados alimentos sea muy frecuente, y, por tanto, la exposición muy amplia, la enfermedad se asocia con una pequeña subpoblación de esta especie bacteriana y tiene lugar en una pequeña proporción de los individuos susceptibles. Tasas de prevalencia de L. monocytogenes del 1 al 10%, y aun mayores, son frecuentes en algunos alimentos; a pesar de ello, la listeriosis sintomática continúa siendo una enfermedad poco frecuente (43, 94).
El estudio de los serotipos y subtipos moleculares de las cepas de L. monocytogenes responsables de los grandes brotes epidémicos de listeriosis ha sido el punto de partida de la idea de la variabilidad de la virulencia, pues se ha demostrado con diferentes técnicas que existe un número muy pequeño de serotipos y de clones implicados (17, 48).
Analizando la distribución de los serotipos de L. monocytogenes en las muestras clínicas y en los alimentos, se observa que de los 13 serotipos en que se clasifica L. monocytogenes, tan sólo tres (4b, 1/2a y 1/2b) representan por sí solos la causa del 89 al 96% de los casos de listeriosis en todo el mundo, lo que sugiere que determinadas cepas de L. monocytogenes tienen más probabilidades de causar enfermedad que otras (43, 62, 94). Además, una parte de los casos esporádicos y gran número de los brotes asociados con alimentos son causados por cepas de serotipo 4b (27, 94). En los casos esporádicos predominan los mismos serotipos, aunque la frecuencia del serotipo 4b es menor que la de los serotipos 1/2a y 1/2b. Muchas cepas de serotipo 4b responsables de los grandes brotes epidémicos han sido caracterizadas molecularmente. El serotipo 4b es muy clonal y el número de cepas diferentes asociadas a los brotes en distintos países y durante más de 20 años es muy pequeño; por ejemplo, una cepa de serotipo 4b aislada en Austria después del año 2000 resultó idéntica a otra cepa también epidémica de Estados Unidos de 1985 (40). Estas cepas de serotipo 4b aisladas de la mayoría de los brotes epidémicos forman tres grupos genéticos homogéneos estrechamente relacionados, que se han denominado "clones epidémicos" (43, 69). En los alimentos no asociados con casos de listeriosis, por el contrario, predominan los serotipos 1/2, mientras que el serotipo 4b es muy escaso. Las cepas de serotipo 4b podrían tener una menor capacidad para formar biopelículas en las plantas de procesado de alimentos en comparación con las de los serotipos 1/2, lo que podría explicar su escasez en ellos (29). Por el contrario, la diferente distribución de los serotipos no está relacionada, aparentemente, con la existencia de alguna clase de ventaja del serotipo 1/2a frente al 4b en los medios de cultivo selectivos empleados habitualmente (37).
El análisis filogenético de múltiples genes (65, 110) permite agrupar a las cepas de L. monocytogenes en tres grandes grupos genéticos denominados linajes I, II y III (65, 70, 95, 107). Los serotipos 1/2b, 3b, 4b, 4d y 4e se encuentran normalmente en el linaje I, y son aislamientos de epidemias de origen alimentario en humanos y de casos esporádicos de listeriosis en animales y humanos, mientras que el linaje genético II corresponde a los serotipos 1/2a, 3a, 1/2c y 3c, aislamientos mayoritariamente de casos esporádicos de listeriosis en humanos (70). Esta clasificación filogenética de linajes sitúa a los tres serotipos mayoritarios en dos linajes diferentes: los serotipos 1/2b y 4b pertenecen mayoritariamente al linaje I y el serotipo 1/2a al linaje II. Se ha postulado que estos dos linajes representarían dos subespecies de L. monocytogenes. El linaje III, que incluye los serotipos 4a y 4c así como determinadas cepas de serotipo 4b (57), representa una unidad taxonómica más alejada y se ha postulado que podría representar una nueva especie. Las cepas del linaje III suelen tener características atípicas y son muy escasas en los alimentos y en las muestras clínicas, aunque se aíslan con cierta frecuencia en animales (88).
Los linajes predominantes, I y II, representan dos grupos evolutivos separados. Estudios realizados con cepas de L. monocytogenes procedentes de casos clínicos de listeriosis animal han mostrado que el linaje I es de naturaleza clonal, más citopatogénico, y se asocia predominantemente con casos de encefalitis, mientras que el linaje II es más diverso desde el punto de vista genético y se asocia por igual con los distintos cuadros clínicos del ganado (82).
Todos estos resultados de caracterización de amplias colecciones de cepas de L. monocytogenes indican que existen distintos grupos de cepas genéticamente homogéneos que podrían tener diferente potencial patogénico (82).
Al combinar el estudio de los subtipos moleculares con el estudio de la citopatogenicidad de dos grandes grupos de cepas de origen humano y alimentario (39) se ha observado que los subtipos previamente relacionados con brotes de listeriosis y los incluidos en el linaje I son más frecuentes en las cepas de origen humano y poseen más capacidad citopatogénica. Estos subtipos podrían formar un grupo clonal con mayor virulencia, lo que también favorecería la hipótesis de que las cepas humanas y alimentarias forman poblaciones diferentes (20). Por otro lado, el linaje II podría ser un subgrupo de L. monocytogenes especialmente adaptado a las condiciones ambientales (95). Existen subtipos moleculares en los alimentos que no aparecen en las muestras clínicas, y algunas cepas clínicas no se encuentran en los alimentos (32). No obstante, y dado que la listeriosis humana es una enfermedad de transmisión alimentaria, es lógico que estas poblaciones se solapen y que en la cadena de producción de alimentos se encuentren algunos subtipos de L. monocytogenes asociados a casos esporádicos o epidémicos de listeriosis humana (7, 96).
Desde otro punto de vista, se ha demostrado que el riesgo de contraer listeriosis no sólo depende de la relación dosis-respuesta, sino también del subtipo molecular (linaje y ribotipo) de la cepa implicada (15).

Variabilidad de la virulencia de aislamientos naturales
Numerosas observaciones indican que la virulencia de L. monocytogenes varía de unos aislamientos a otros.
Por ejemplo, en un brote de listeriosis en el que estaba implicada una cepa presente en el alimento con un bajo número de células se encontró que una segunda cepa no asociada con el brote y también presente en el mismo alimento se hallaba en números más altos, por lo que los autores sugieren que la virulencia de estas dos cepas de L. monocytogenes probablemente fuese diferente (64).
Distintos grupos han observado que entre un 8 y un 21% de los aislamientos naturales de L. monocytogenes, tanto de alimentos como ambientales, tienen atenuada su virulencia o son totalmente avirulentos (9, 13, 21, 79, 89, 104).
La virulencia de los aislamientos naturales de L. monocytogenes se ha estudiado con ensayos in vitro, con cultivos celulares y con modelos animales. Los ensayos in vitro pueden detectar marcadores de la virulencia fenotípicos (por ejemplo, el grado de hemólisis) o genotípicos (por ejemplo, mutaciones en el gen de la hemolisina) (87). Los ensayos con cultivos celulares más empleados para evaluar la virulencia de L. monocytogenes son la medida de la formación de placas de lisis en diferentes tipos de células, como las Caco-2, similares a los enterocitos humanos, y diferentes medidas de la citotoxicidad, como la evaluación de la entrada y multiplicación de las bacterias en células de epitelio intestinal (79, 104). Por último, el modelo in vivo más utilizado en ensayos de virulencia de L. monocytogenes es la determinación de la dosis letal 50% en ratones, así como la evaluación de la recuperación del patógeno del bazo e hígado de ratones inmunocompetentes o inmunode-primidos tras la inoculación oral o intravenosa (4, 83).
En la mayoría de los estudios realizados con cultivos celulares y en modelos murinos se ha llegado a la conclusión de que existe una gradación de la virulencia en los aislamientos de L. monocytogenes de origen alimentario, aunque las cepas de origen clínico no suelen ser más virulentas que las del grupo anterior.

Dificultades para detectar los diferentes grados de virulencia
A pesar de las diferencias en la distribución de serotipos, linajes y subtipos moleculares, los mecanismos responsables de la variablidad de la virulencia de L. monocytogenes aún no son bien conocidos. No existe un único marcador que permita diferenciar los aislamientos virulentos de los avirulentos. Por ejemplo, la resistencia al pH ácido y a las sales biliares no diferencia a las cepas de L. monocytogenes causantes de infecciones de aquellas procedentes de portadores sanos o de alimentos (78).
Por otro lado, cuando se han comparado diferentes subtipos moleculares o serotipos, no se ha encontrado una asociación clara de determinado grupo con los distintos grados de virulencia (21, 54, 60, 83, 87).
La secuenciación del genoma completo de L. monocytogenes y L. innocua (33) representó un gran avance, pero el papel que juegan los diferentes factores de virulencia sigue planteando interrogantes. En numerosos casos se ha comprobado que la deleción de los correspondientes genes origina la reducción de la virulencia in vitro e in vivo (83). Hasta ahora, sin embargo, la detección de genes de virulencia no se ha podido relacionar directamente con la virulencia funcional, ya que estos genes están presentes en prácticamente todas las cepas aisladas de alimentos. En muchos casos la asociación de determinados marcadores con la virulencia de L. monocytogenes ha sido infructuosa. Por ejemplo, estudiando 10 cepas, Chiu et al. (19) no pudieron medir diferencias en su virulencia tras analizar (i) la presencia de genes de virulencia mediante PCR; (ii) la actividad de la listeriolisina y de fosfolipasas; (iii) la hidrofobicidad de las cepas; (iv) la invasión de células Caco-2.
El modelo animal con ratones, tanto inmunocompetentes como inmunodeprimidos, tiene grandes limitaciones, ya que, en ocasiones, las cepas con diferentes grados de virulencia no muestran diferencias en la dosis letal 50% (101).
Las dificultades de los modelos celulares y animales actuales han llevado a buscar modelos alternativos para el estudio de la virulencia de L. monocytogenes. Se ha propuesto la utilización de células Vero en los ensayos de invasión, en lugar de las células Caco-2, porque en las primeras la invasión es uniformemente alta con las cepas de origen clínico, pero variable con las cepas de alimentos, independientemente de su serotipo (108). Entre los modelos celulares alternativos se encuentran las células de Drosophila (3) y Caenorhabditis elegans (103).
El estudio in vivo de las internalinas InlA e InlB indica que ambas son específicas de especie y que se necesitan nuevos modelos animales para estudiar sus funciones en relación con el inicio de la infección en los humanos (52). Además, los sistemas utilizados en los estudios de los factores de virulencia (bacterias clonales, cultivos celulares y animales genéticamente homogéneos) no reflejan la diversidad que se encuentra en la naturaleza.

Causas de la atenuación de la virulencia
Para desarrollar métodos que permitan detectar los grados de virulencia de L. monocytogenes es necesario conocer primero los mecanismos que dan lugar a la atenuación o a la ausencia total de la virulencia en los aislamientos naturales de esta especie (87).
La ausencia o disminución de la actividad hemolítica fue el primer factor estudiado para explicar la ausencia o disminución de la virulencia de algunos aislamientos naturales (23, 28, 87).
Dentro de los genes analizados para determinar la virulencia de L. monocytogenes es interesante resaltar la comparación de los que codifican para proteínas de superficie. Hasta ahora se han caracterizado en este grupo la internalina, las proteínas InlB y ActA y la proteína de adhesión Ami, todas participantes en el proceso de invasión (45). La internalina es la proteína que permite la entrada de L. monocytogenes en células epiteliales intestinales humanas en cultivo y en los enterocitos de los ratones transgénicos que expresan su receptor, la E-caderina humana (66). La proteína InlA es específica de L. monocytogenes (25). Se ha tratado de asociar los patrones de restricción diferentes de las secuencias inlA con los diferentes grados de virulencia (93). La especificidad del gen inlA se ha aprovechado para detectar L. monocytogenes mediante PCR (73) y con un anticuerpo monoclonal (42). Algunas cepas de L. monocytogenes expresan una forma no funcional de internalina, por lo que se ha comparado la expresión de esta proteína en dos grupos de cepas procedentes de infecciones humanas o de alimentos (44). Las cepas de origen clínico expresan la internalina completa con mayor frecuencia (96%) que las cepas procedentes de alimentos (65%). De los cuatro serotipos que se aíslan más frecuentemente, el serotipo 4b (que es el asociado con el mayor número de brotes de listeriosis humana) y el serotipo 1/2b expresan siempre la internalina completa, mientras que el serotipo 1/2a lo hace de forma variable y el serotipo 1/2c (raramente responsable de casos de listeriosis humana) expresa siempre la forma truncada de la internalina. Los autores concluyen que el estudio de la expresión de la internalina puede ser un buen marcador de la virulencia de L. monocytogenes en humanos, lo que permitiría evaluar los riesgos de listeriosis en función no sólo de los niveles de contaminación sino también de la funcionalidad de la internalina (44, 59).
Posteriormente se han identificado otras mutaciones que daban lugar a internalinas truncadas (76, 93). Los subtipos (ribotipos) de L. monocytogenes con codones de parada en las secuencias de sus genes inlA, que darían lugar a proteínas truncadas, son más frecuentes entre las cepas de origen alimentario que entre las de origen clínico (76).
Recientemente se han caracterizado un grupo de aislamientos de L. monocytogenes con su virulencia atenuada de forma natural (87). Tras la comparación de su citotoxicidad y la expresión de determinados genes de virulencia, los autores diferencian cuatro grupos. En el grupo de aislamientos no citotóxicos, los hay que no expresan el gen de la hemolisina a un nivel normal y otros en los que el nivel de expresión es normal pero la hemolisina es inactiva. Entre los aislamientos citotóxicos se encuentra un caso de hiperexpresión del gen de la hemolisina, que podría explicar su atenuación de la virulencia, y otros casos en los que la expresión y actividad de la hemolisina es normal pero que tienen un crecimiento intracelular inferior al normal, posiblemente relacionado con algún defecto en la expresión o función de la proteína ActA (87). Otros autores también han asociado la virulencia reducida de L. monocytogenes con deleciones en el gen actA (49). Estos cuatro grupos no están relacionados con ningún linaje ni subtipo particular de L. monocytogenes y en conjunto pueden representar del 3 al 5% de los aislamientos de alimentos y de la industria alimentaria (87).
Roche et al. (90) han clasificado un conjunto de 26 aislamientos naturales de L. monocytogenes con baja virulencia (en cultivos celulares y en ratones) también en cuatro grupos, basados igualmente en la infección de células eucariotas y la actividad de sus fosfolipasas. El grupo I está formado por aislamientos que no entran en las células y no tienen actividad fosfolipasa debido a mutaciones o deleciones del gen prfA que dan lugar a las correspondientes proteínas reguladoras inactivas. Los grupos II y III contienen aislamientos que entran en las células pero no forman placas en los cultivos debido, en la mayoría de los casos, a mutaciones en los genes plcA (grupo III) o plcB (grupo II) que dan lugar a niveles bajos de las correspondientes fosfolipasas. El grupo IV está formado por aislamientos que poseen una virulencia reducida en ratones pero que resultan indistinguibles de las cepas totalmente virulentas empleando los criterios anteriores (90).
A pesar de todos estos resultados, tanto la regulación y la expresión de los numerosos factores de virulencia de L. monocytogenes, como la estructura genética de sus poblaciones bacterianas y la diversidad de la población humana susceptible, son elementos de gran complejidad que hacen que la distinción inequívoca de las cepas virulentas y no virulentas de L. monocytogenes continúe siendo un reto. La atenuación de la virulencia en L. monocytogenes se debe a múltiples mecanismos, por lo que es poco probable que un único método basado en técnicas moleculares, cultivos celulares o ensayos con animales permita diferenciar los aislamientos con los distintos grados de patogenicidad. La combinación de métodos moleculares de alto rendimiento como los microarrays (11, 25) con técnicas rápidas y cuantitativas de cultivos celulares (87) es actualmente la tecnología más prometedora para identificar las cepas virulentas de L. monocytogenes. A más largo plazo, sería posible identificar determinados aminoácidos fundamentales para la correcta actividad de las proteínas de virulencia, lo que permitiría la detección de las mutaciones responsables mediante métodos más sencillos, como una PCR multiplex (90).
Dado que L. monocytogenes posee una patogenicidad variable, la capacidad de identificar rápidamente la especie (46) y las cepas específicas implicadas en los casos de listeriosis y de evaluar rápidamente su potencial patogénico es un factor crítico para controlar y prevenir la enfermedad (56).

SELECCIÓN DE CEPAS VIRULENTAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Al analizar la variabilidad de la virulencia de L. monocytogenes es importante tener en cuenta, también, el efecto que puede tener la adaptación del patógeno a los diferentes nichos ecológicos sobre la supervivencia y la virulencia de los subtipos asociados con la listeriosis humana cuando están presentes en los alimentos (6).
Los mecanismos de adaptación al estrés provocado por las condiciones ambientales o por el procesado y conservación de los alimentos en la industria (temperaturas extremas, falta de nutrientes, acidez) (71) pueden provocar cambios en la célula bacteriana que, por un lado, dificultan la detección de las células dañadas subletalmente de L. monocytogenes (47, 74) y, por otro lado, pueden afectar a la virulencia. L. monocytogenes va a encontrar condiciones similares (pH ácido, temperatura elevada, estrés oxidativo) durante su ciclo intestinal y también intracelular (en el fagosoma). Determinados factores causantes de estrés pueden inducir cambios en la virulencia, lo cual se ha comprobado en modelos animales (45). Es posible, por tanto, que algunas tecnologías habitualmente empleadas en la industria alimentaria como la refrigeración, deshidratación, congelación y descongelación, tratamiento con sal, pH ácido, exposición a desinfectantes y otras sustancias antimicrobianas, etc., influyan en el estado fisiológico y en la virulencia de este patógeno, seleccionando subpoblaciones bacterianas resistentes al estrés y más virulentas (50).
La influencia que puedan tener las tecnologías de procesado de alimentos en el aumento de la virulencia o en la selección de cepas virulentas precisa más estudios que aclaren este importante fenómeno (43). Pero tanto si las cepas virulentas de L. monocytogenes presentes en las plantas de alimentos proceden de poblaciones seleccionadas por las tecnologías de procesado, como si son poblaciones virulentas que simplemente se solapan con las cepas humanas, es necesario estudiar su trazabilidad para conocer el riesgo real que suponen. En el caso de la listeriosis humana, el papel del laboratorio de microbiología sigue reducido a la detección e identificación de L. monocytogenes (46), lo que resulta claramente insuficiente por tratarse de una bacteria ubicua ampliamente distribuida en el ambiente (61) y porque no permite diferenciar las cepas virulentas de las no virulentas, que probablemente son mayoritarias (16).
El análisis de la virulencia de clones específicos de L. monocytogenes aislados de la industria alimentaria podría contribuir a resolver el dilema que plantea la elevada contaminación que causa L. monocytogenes a lo largo de la cadena de producción de determinados alimentos, que no va acompañada, afortunadamente, de un elevado número de casos de listeriosis.
De momento, sin embargo, todas las cepas de L. monocytogenes se consideran potencialmente patógenas. Los avances futuros en la asociación de determinados marcadores de virulencia con los diferentes grupos genéticos de L. monocytogenes permitirán mejorar la evaluación de riesgos de la enfermedad que causa este microorganismo, teniendo en cuenta no sólo la definición de la especie sino también la de los subtipos virulentos.

Agradecimientos: el trabajo en el laboratorio de los autores se financia con los proyectos CAL03-027-C2-1, PTR1995-0789-OP y RTA2005-00202-C02 del Ministerio de Educación y Ciencia (España) y GR/SAL 583-04 de la Comunidad Autónoma de Madrid (España).

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Recibido: 26/6/06
Aceptado: 6/11/06