Comparación de métodos de extracción de ADN de sangre para detectar ADN fúngico por PCR

V. M. Jewtuchowicz*, J. L. Finquelievich , E. Durán, M. T. Mujica, C. A. Iovannitti

Centro de Micología, Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Paraguay 2155 (1121) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: minivirj@hotmail.com

RESUMEN
La infección fúngica invasora (IFI) está asociada a un alto índice de mortalidad, que alcanza el 50% debido a la frecuente falla en el tratamiento antifúngico. Existen dificultades para realizar un diagnóstico micológico rápido y certero dada la baja sensibilidad de los métodos convencionales, especialmente en pacientes neutropénicos y con SIDA. Numerosos métodos para diagnosticar infecciones micóticas basados en el estudio del ADN fúngico están actualmente en desarrollo. Nosotros evaluamos la utilidad de dos procedimientos de extracción y purificación del ADN fúngico presente en sangre para su posterior detección por PCR. Ambos métodos resultaron igualmente eficientes para obtener ADNs de óptima calidad y para realizar la técnica de PCR con los iniciadores universales para hongos ITS 1 e ITS 4.
Palabras claves: ADN fúngico, PCR, Qiagen, tiocianato de guanidina

ABSTRACT
Comparison of different methods of DNA extraction from blood to detect fungal DNA by PCR. Invasive fungal infections (IFI) are associated with high mortality by reaching levels of 50%, and also with a significant failure in antifungical treatments. This fact mostly obeys to difficulties in obtaining a fast and accurate mycologic diagnosis due to the low sensitivity of conventional methods, mainly in neutropenic and AIDS patients. Various methods based on fungal DNA study are currently being used for the diagnosis of mycotic infections. We herein evaluated two procedures of extraction and purification of fungal DNA in blood for their use in PCR detection. Both of them showed equal efficiency in obtaining high performance DNA with universal primers ITS 1and ITS 4 as target.
Key words: fungal DNA, PCR, Qiagen, guanidine thiocyanate

En la última década, las infecciones fúngicas invasoras (IFI) han mostrado un importante incremento en frecuencia y complejidad. Los pacientes con compromiso inmunológico y aquellos que requieren cuidados especiales a causa de su situación crítica se han convertido en los huéspedes con mayor predisposición hacia este tipo de infecciones. La mortalidad relacionada con IFI se ha mantenido muy elevada; así, la vinculada a candidemia es del 40 al 60% (1) y la ligada a aspergilosis invasora superior al 50% (4).
En los pacientes con sospecha de IFI el diagnóstico rápido y certero es muy importante, ya que el inicio temprano del tratamiento antifúngico está relacionado con la disminución de la mortalidad (8). En las IFI, los métodos tradicionales de diagnóstico micológico (histológico, microscópico y cultivo) presentan muy baja sensibilidad y requieren un tiempo prolongado para obtener los resultados (2, 12). Por otra parte, la reciente introducción de nuevos antifúngicos con diferente espectro de acción (azólicos, equinocandinas) hace imprescindible identificar a nivel de especie, objetivo difícil y laborioso de lograr mediante estudios microscópicos y bioquímicos.
Los métodos basados en la amplificación de ADN que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) muestran un gran potencial como herramienta diagnóstica (2, 13, 15). En uno de los primeros estudios prospectivos en 84 pacientes con transplante de médula ósea, Herbart et al. (4) demostraron que la PCR positiva precedía, en promedio, en dos días a la aparición de los signos clínicos de IFI.
El procedimiento de extracción de ADN a partir de muestras biológicas tiene un impacto significativo sobre la sensibilidad y reproducibilidad de la prueba de diagnóstico molecular (3, 5). Por ello es de vital importancia estandardizar previamente la metodología con modelos experimentales, para luego proceder a realizarlos sobre las muestras clínicas.
El objetivo de este trabajo fue evaluar dos métodos de extracción de ADN a partir de muestras de sangre para su posterior empleo en la detección de ADN fúngico mediante PCR. Para ello, se utilizó el equipo estandardizado comercial QIAamp™ DNA blood Mini Kit (Qiagen AG, Basel, Switzerland) y un protocolo convencional no comercial que utiliza tiocianato de guanidina como agente lítico.
Las muestras de sangre tomadas se colocaron en tubos estériles con EDTA (1,6 mg/ml) (12). Sangre de dadores sanos (mezcla de 30 individuos) fue inoculada con diferentes diluciones de Candida albicans ATCC 90028 (1-10⁴ UFC/ml) o Candida parapsilosis ATCC 22019 (1-10⁴ UFC/ml). Cada dilución fue dividida en dos alícuotas, una para determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC/ml) usando el medio agar Sabouraud glucosado (Laboratorios Britania) y la otra para la obtención de ADN. Como control negativo se usó sangre de diez dadores sanos sin inocular. En este estudio se incluyeron las muestras de sangre de cuatro pacientes con candidiasis sistémica documentada por cultivo, uno de ellos también con aspergilosis invasora probada. La extracción del ADN se realizó mediante dos procedimientos. El primero de ellos, no comercial, se basó en la técnica de Sandhu et al. (10), que usa una mezcla de tio-cianato de guanidina, fenol alcalinizado en buffer Tris (pH 8) e incubación a ebullición para lograr la lisis celular. El otro procedimiento empleado fue un equipo comercial estandardizado para la extracción y purificación de ADN, el QIAamp™ DNA blood Mini Kit (Qiagen AG, Basel, Switzerland), según las indicaciones del fabricante.
La extracción de ADN de las cepas C. albicans ATCC 90028 y C. parapsilosis ATCC 22019 (utilizadas como controles positivos en la PCR) se efectuó con la técnica de Scherer et al. (11). Como control de A. fumigatus se utilizó una cepa obtenida de la colección del Centro de Micología y cuyo ADN se obtuvo por un procedimiento utilizado previamente por Yamakami et al. (15). Los ADNs se conservaron a -20 ºC en buffer TE (Tris 10 mM –EDTA 1 mM).
La integridad de los ADNs fue verificada por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, a 4 voltios/cm. Después de la electroforesis, el gel fue coloreado con bromuro de etidio (0,5 μg/μl) durante 20 a 30 minutos y observado en un transiluminador UV (EPI-Chemi Darkroom. UVP, Laboratory Products). La determinación de pureza y cantidad del ADN extraído se efectuó en un espectrofotómetro a 260 nm (SmartSpec^TM 3000 Spectrophotometer, BIO-RAD).
Todos los ADNs obtenidos fueron amplificados utilizando la técnica de PCR de Mullis et al. (9), con los iniciadores universales para hongos: ITS 1 (GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC) e ITS 4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC). La reacción de PCR fue optimizada y realizada con el siguiente procedimiento: buffer PCR 1X, 100 μM de cada desoxirribonucleósido trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 10 pM de cada iniciador, 5μl de ADN, 1,25 U de Taq DNA Polimerasa (Invitrogen), en un volumen final de 25 μl. Los ciclos se realizaron en el termociclador Mini Cycler^TM (MJ Research INC), 5 min a 95 ºC; 30 ciclos de: 20 seg a 95 ºC, 15 seg a 55 ºC, 65 seg a 72 ºC y finalmente 5 min a 72 ºC. Los fragmentos de ADN amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% a 4 voltios/cm, utilizando 1μg/μl de marcador de peso molecular (DNA Ladder 100 pb, Invitrogen). Después de la electroforesis, el gel fue coloreado y observado en el transiluminador UV antes mencionado. El programa VisionWorks 31 Imaging Software fue usado para generar las imágenes en una computadora.
Los métodos basados en la amplificación de ADN (PCR) muestran un gran potencial como herramienta diagnóstica no invasora (7). En los años recientes, la amplificación de genes universales de la región ITS (Internal Transcript Spacer) del ADN ribosomal ha mostrado una gran especificidad para la detección de patógenos fúngicos en muestras biológicas (2, 5, 13, 15).
Los primeros métodos utilizados para la extracción de ADN a partir de sangre u otras muestras biológicas consistían en protocolos no comerciales extensos y de varias etapas (3, 6). En nuestro trabajo ambos métodos permitieron acortar los tiempos de extracción considerablemente (entre 4 y 6 horas), no evidenciaron diferencias con respecto a la pureza de los ADNs obtenidos y resultaron óptimos para la realización de la PCR, con concentraciones que variaron de 50 a 300 ng/μl para Qiagen y de 1 a 30 ng/μl en la técnica no comercial. El procedimiento no comercial que se utilizó en este trabajo disminuyó los costos en aproximadamente unas diez veces, respecto del equipo comercial.
La amplificación con los iniciadores universales para hongos ITS 1 e ITS 4 de los ADNs fúngicos extraídos de sangre de dadores sanos inoculada con suspensiones de C. albicans o de C. parapsilosis evidenció la presencia de ADN fúngico por la aparición de una única banda de amplificación cercana a 600 pb, independientemente del procedimiento de extracción de ADN empleado y de la especie de levadura (Figuras 1 y 2: calles 1-10). El inóculo de levaduras utilizado (1-10⁴ UFC/ml) fue corroborado al realizar el recuento de colonias en Sabouraud glucosado. Ambas técnicas ensayadas permitieron detectar 1 UFC /ml, en concordancia con datos publicados por otros autores (6, 7, 10).

La PCR de los ADNs de sangre de dadores sanos no inoculada sirvió como control negativo (Figura 1: calle 11 y Figura 2: calle 14).
Las amplificaciones correspondiente al ADN fúngico en las muestras de sangre de los cuatro pacientes con candidiasis sistémica y de aquel con aspergilosis invasora, todas ellas documentadas por cultivo, resultaron positivas con ambas técnicas (Figura 1: calles 12-16 y Figura 2: calles 11-14. Estos resultados, aunque preliminares, resultan promisorios para el diagnóstico molecular.
Coincidentemente con nuestros resultados con respecto a la pureza del ADN obtenido, Loffler et al. y White et al. concluyeron que no hubo diferencias entre los ADNs extraídos con el equipo comercial Qiagen y los logrados mediante otros procedimientos no comerciales propuestos por diferentes autores (6, 14).
Los iniciadores universales para hongos ITS 1 e ITS 4, utilizados en la reacción de PCR, amplificaron ADN fúngico y presentaron la ventaja de permitir en una etapa posterior su identificación a nivel de especie, ya sea por secuenciación y/o PCR anidada (resultados no mostrados).
Basados en nuestros resultados, concluimos que ambas técnicas pueden ser implementadas en laboratorios de mediana complejidad, ya que son eficientes en la obtención ADN de muestras de sangre. Sin embargo, a pesar de que el método no comercial disminuyó los costos con respecto al equipo comercial, este último evita la preparación de reactivos (incluidos en el equipo), lo cual disminuye el tiempo empleado en la determinación. El equipo comercial es una buena elección si el objetivo es implementar esta metodología en la práctica diaria, ya que es un método estandardizado que permitirá comparar resultados en diferentes centros.

Agradecimientos: Agradecemos al Prof. Dr. Ricardo Negroni por la revisión del manuscrito. Este trabajo fue realizado con el subsidio M 039 de la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad de Buenos Aires.

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Recibido: 05/09/05
Aceptado: 05/02/07