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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.39 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./mar. 2007

 

Diagnóstico de pseudotuberculosis en ovinos patagónicos

S. Estevao Belchior1*, A. Gallardoz1, A. Ábalos1, Y. Díaz1, L. Álvarez1, R. Callejo2, M. Prieto2, N. Jodor1, O. Jensen3

1Centro Regional de Investigación y Desarrollo Científico Tecnológico (CRIDECIT), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Ciudad Universitaria Km 4 (9000) Comodoro Rivadavia, Chubut; 2Servicio de Bacteriología Especial, INEI-ANLIS "Dr Carlos G. Malbrán", Avda. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires; 3Departamento de Zoonosis, Secretaría de Salud de la Provincia de Chubut, Chacra N° 18 (9020) Sarmiento, Chubut. Argentina.
* Correspondencia. E-mail: sbelchior@unpata.edu.ar

RESUMEN
La linfadenitis caseosa (LAC) es una enfermedad bacteriana supurativa crónica que afecta a ovinos. El agente etiológico es Corynebacterium pseudotuberculosis. El diagnóstico diferencial con otras afecciones que presentan manifestaciones clínicas similares sólo puede hacerse sobre la base del aislamiento y la identificación del agente etiológico. El objetivo de este trabajo fue caracterizar metabólica y genéticamente al agente causal de abscesos granulomatosos observados en ovinos en la región patagónica. En las muestras, se observó un contenido caseoso rodeado de una membrana fibrosa, y en el examen histopatológico, un centro de necrosis caseosa rodeado por células epitelioides, linfocitos y polinucleares. Mediante estudios microscópicos, bacteriológicos y moleculares fue confirmada la infección causada por C. pseudotuberculosis biovar ovis.
Palabras clave: pseudotuberculosis, ovinos, Corynebacterium pseudotuberculosis

ABSTRACT
Diagnosis of caseous lymphadenitis in sheep from Patagonia
. Caseous lymphadenitis (CLA) is a chronic bacterial, infectious and contagious disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis. It affects sheep and results in abscesses of the lymph nodes in subcutaneous tissue, as well as in internal organs such as lungs, liver and kidneys. Differential diagnosis of the disease is based on the isolation and biochemical identification of the etiological agent. The purpose of this study was to characterize the bacteria isolated from typical CLA lesions in sheep from Patagonia, Argentina, at metabolic and genetic levels. Macroscopic observations show a fibrous membrane containing caseous necrotic tissue. Histopathological analysis shows an eosinophilic necrotic area surrounded by epitheloid cells and polymorphonuclear infiltration. Other analyses performed such as microscopic observations, in vitro culture, biochemical tests and 16s rDNA sequencing confirmed diagnosis of caseous lymphadenitis due to C. pseudotuberculosis.
Key words: pseudotuberculosis, sheep, Corynebacterium pseudotuberculosis

La linfadenitis caseosa (LAC), pseudotuberculosis, apostema de los ovinos o enfermedad de Preisz-Nocard, es una enfermedad bacteriana supurativa crónica que afecta principalmente a pequeños rumiantes (1, 2). Puede causar enflaquecimiento y deterioro del estado general de los animales enfermos, que se traduce en la disminución de la producción de lana, carne y leche (11). La enfermedad se presenta en las formas cutánea y/o visceral. La primera se caracteriza por la formación de abscesos en el sistema linfático subcutáneo, que se palpan a través de la piel. En la forma visceral, los abscesos se manifiestan en ganglios internos de la cavidad torácica y órganos importantes, como pulmones, hígado y riñones (2, 7). El hallazgo de abscesos en ganglios linfáticos y órganos en ovinos de la región patagónica de Argentina es común durante la faena (3).
El agente causal de la LAC es Corynebacterium pseudotuberculosis. En estudios realizados por Songer et al. (13), se identificaron dos biotipos basados en la producción de la enzima nitrato reductasa, y se han propuesto los términos "biovar equi" para las especies que reducen nitratos y "biovar ovis" para aquellas que no cumplen con esa condición. La última biovariedad es el agente etiológico de LAC en pequeños rumiantes (2, 7, 8, 13).
El objetivo de este trabajo fue caracterizar metabólica y genéticamente al agente causal de abscesos granulomatosos observados en ovinos de la región patagónica argentina.
La población en estudio fueron ovinos procedentes de la región patagónica austral de Argentina, de las razas Merino y Corriedale, de ambos sexos y de todas las categorías de ovinos adultos: borregos, ovejas, capones y carneros. Para el análisis se consideraron aquellos ovinos que mediante inspección ocular y palpación de canales y órganos presentaron ganglios y vísceras de consistencia y tamaño anormal. Se observaron 600 animales sacrificados en un frigorífico local, de los cuales 180 (30%), cumplieron con los criterios de inclusión fijados.
Una porción de cada espécimen fue fijada en formol al 10%, procesada por la técnica clásica de inclusión y cortes en bloques de parafina y coloreada con hematoxilina-eosina.
Una alícuota de aproximadamente 1 g del contenido interior de las lesiones se homogeneizó con 9 ml de solución fisiológica estéril mediante vórtex. De esta suspensión se realizó microscopía y aislamiento. Las muestras se colorearon con las técnicas de Gram y de Ziehl Neelsen y se sembraron en agar sangre e incubaron en atmósfera normal a 37 °C durante 48 a 72 h. La caracterización de las colonias se realizó de acuerdo al tamaño, pigmento, olor y presencia de hemólisis (15).
Las colonias aisladas se identificaron de manera preliminar, previa coloración de Gram, con las pruebas de catalasa, oxidasa, oxidación/fermentación de glucosa en agar cistina tripteína, producción de hemólisis y efecto de los lípidos sobre el crecimiento. Además, se realizaron las pruebas de hemólisis sinérgica frente a Rhodococcus equi (prueba de CAMP) y de inhibición de la β-hemolisina del Staphylococcus aureus (CAMP reversa), de sensibilidad frente al factor 0/129 e hidrólisis de gelatina a 22 °C. Estas pruebas se practicaron e interpretaron de acuerdo a metodología estandarizada (6, 15). El sistema comercial API® Coryne (bioMérieux, France) fue utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los ensayos se incubaron 48 h a 37 °C.
La identificación de las cepas se confirmó por técnicas moleculares mediante la secuenciación del gen 16S rDNA. La amplificación de este gen se realizó con los primers correspondientes a la posición 827 y 1492 del gen 16S rDNA de Escherichia coli. Los productos de PCR fueron secuenciados utilizando el equipo Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems) y analizados en el ABI 377 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems). El alineamiento de las secuencias se realizó con el programa BLAST, comparándolas con secuencias disponibles en la base de datos del National Center for Biotecnology Information (NCBI). Para la identificación bacteriana se utilizó el programa BIBI (Bioinformatics Bacterial Identification), cuya dirección electrónica es, http://pbil.univ-lyon1.fr/bibi/, y mediante el programa CLUSTAL W se construyó el árbol y se establecieron las distancias filogenéticas.
La sensibilidad a antibióticos se determinó utilizando el método de difusión con discos, de acuerdo a metodologías estándar ya establecidas (4). Para ello se utilizó agar Mueller-Hinton suplementado con 5% de sangre ovina. Las lecturas de los halos de inhibición se realizaron a las 48 h y, dado que no hay valores de corte aceptados que específicamente asignen categorías interpretativas para las corinebacterias, se utilizaron los valores recomendados por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) para Staphylococcus spp. (10).
Se analizaron 123 muestras de ganglios y vísceras, de consistencia y tamaño anormal, obtenidas de diferentes animales que cumplieron con el criterio de inclusión. Su distribución fue la siguiente: ganglios superficiales (78), ganglios mediastínicos (18) y abscesos granulomatosos observados en pulmones (16), hígados (4) y riñones (7). Debido a problemas operativos, no fue posible determinar con certeza a qué número de animales pertenecían los órganos analizados.
Macroscópicamente, se observó en el interior de las muestras tejido necrótico de consistencia caseosa en el 47% de los materiales, el 21% presentó núcleos de calcificación, el 19% con disposición en catáfila de cebolla, y con contenido de pus verdoso y espeso en el 13%. Histológicamente, se determinó un centro eosinófilo de necrosis de tipo caseosa rodeado por células epitelioides, linfocitos y polinucleares, más externamente tejido conectivo fibroso. Algunas muestras presentaron focos de calcificación rodeados de envoltura fibrosa, con linfoplasmocitos y corona de linfocitos. Con la microscopía se pudieron reconocer formas bacilares gram-positivas agrupadas. No se observaron bacilos ácido-alcohol-resistente.
En los cultivos predominaron colonias de 1 mm de diámetro, de color blanco y de consistencia seca, rodeadas de un halo tenue de β-hemólisis. Se seleccionaron 89 cepas de bacilos gram-positivos pequeños, agrupados en empalizada, compatibles con corinebacterias. Los aislamientos fueron no lipofílicos, con metabolismo fermentativo; presentaron reacción positiva para las pruebas de catalasa, oxidasa, α-glucosidasa, ureasa, CAMP, CAMP reversa, producción de ácido a partir de glucosa y ribosa; y fueron negativos para reducción de nitrato, pirazinamidasa, pirrolidonil-arilamidasa, β-glucuronidasa, β-galactosidasa, N-acetil-β-glucosaminidasa, hidrólisis de gelatina a 37 y 22 °C, fermentación de: xilosa, manitol, lactosa y glucógeno, y resistentes al factor 0/129. El 50% de las cepas fueron fosfatasa alcalina positiva, el 70% fermentó maltosa y el 40% sacarosa.
Con el método molecular, se obtuvo una similitud del 99% con las secuencias de referencia de C. pseudotuberculosis CIP 102968T y NCTC 3450, depositadas en el GenBank.
Todas las cepas fueron sensibles a: penicilina (10U), vancomicina (30 µg), cefotaxima (30 µg), gentamicina (10 µg), kanamicina (120 µg), eritromicina (30 µg), tetraciclina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), norfloxacina (10 µg), ampicilina (10 µg), rifampicina (5 µg), trimetoprima-sulfametoxazol (25 µg), cloranfenicol (30 µg). El 16% mostró sensibilidad intermedia a amicacina (AMK-30 µg) y el 6% a nitrofurantoína (NIT-300 µg). La resistencia a oxacilina (1 µg) fue de 37%, a AMK 19% y a NIT 2%.
Las características macroscópicas e histológicas de las muestras examinadas se correspondieron con las lesiones patognomónicas de la enfermedad LAC (7).
Teniendo en cuenta los resultados de las observaciones microscópicas y las pruebas preliminares, el microorganismo estudiado se consideró perteneciente al género Corynebacterium. El resultado negativo de la prueba de pirazinamidaza permitió agrupar las cepas dentro del grupo Corynebacterium diphteriae, del que forman parte las especies C. diphteriae, ulcerans y pseudotuberculosis (6). Las pruebas de ureasa y resistencia al factor O/129 diferenciaron a C. pseudotuberculosis de las especies C. diphteriae y C. ulcerans, respectivamente (6, 15). El análisis molecular permitió confirmar la identidad taxonómica de la cepa como perteneciente a la especie C. pseudotuberculosis. Dado que las cepas no fueron productoras de nitratorreductasa, se clasificaron como biovariedad ovis (13). Las pruebas de CAMP y CAMP reversa confirmaron la producción de la toxina fosfolipasa D (FLD), determinante de patogenicidad de C. pseudotuberculosis. In vivo, la FLD hidroliza la esfingomielina de las membranas celulares endoteliales de vasos sanguíneos y linfáticos, facilitando la colonización y diseminación del patógeno en el huésped (14).
Las características bioquímicas obtenidas coincidieron con las informadas en publicaciones de autores que estudiaron cepas de C. pseudotuberculosis en Francia (12), República Checa (8), Australia, Sudáfrica, Estados Unidos y Canadá (13). El perfil de sensibilidad a los antibióticos fue similar al comunicado por Lipky et al. (9) y Judson y Songer (5). Si bien las cepas resultaron sensibles a la mayoría de los antibióticos, ha sido demostrado que la eficacia de éstos in vivo resulta prácticamente nula (9).
Mediante las metodologías de laboratorio empleadas se confirmó el diagnóstico de linfadenitis caseosa en las muestras analizadas. Este estudio permitió, además, caracterizar metabólicamente cepas autóctonas de C. pseudotuberculosis biovar ovis aisladas de ovinos de la región patagónica.

BIBLIOGRAFÍA
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Recibido: 14/08/06
Aceptado: 11/12/06