Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: presencia en los alimentos y su relación con la enfermedad de Crohn

K. Cirone^1,3, C. Morsella¹, M. Romano³, F. Paolicchi^1,2*

¹INTA Balcarce, ²UNMdP, ³CONICET. Laboratorio de Bacteriología, Unidad Integrada Balcarce INTA - Universidad Nacional de Mar del Plata. RN 226, Km 73,5 (7620) Balcarce, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: fpaolicchi@balcarce.inta.gov.ar

RESUMEN
La paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enteritis crónica producida por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, que afecta a bovinos y a otras especies. En la Argentina se ha caracterizado en rodeos bovinos y de ciervos, con aislamientos tipificados en distintos patrones genéticos. M. avium subsp. paratuberculosis ha sido vinculado en humanos con una inflamación crónica del intestino, denominada enfermedad de Crohn. Existen evidencias clínicas y experimentales que relacionan a M. avium subsp. paratuberculosis con la enfermedad en el humano, mediante su detección por PCR y por cultivo a partir de biopsias de órganos, de leche materna y de sangre de pacientes afectados. La leche y sus subproductos serían posibles fuentes de infección y se ha sugerido que M. avium subsp. paratuberculosis resistiría las condiciones de pasteurización. Diversos trabajos de investigación demostraron que esta micobacteria podría estar presente en leches comercializadas en diversos países, como Reino Unido, Estados Unidos, República Checa, y también en la Argentina. La presencia de M. avium subsp. paratuberculosis en productos lácteos y agua de consumo ha sido relacionada con la resistencia del microorganismo tanto a los procesos de elaboración como a los factores climáticos adversos, lo que enfatiza el rol de los alimentos y del agua como vías de transmisión al humano. Las investigaciones en curso podrían ratificar el riesgo y las implicancias de la exposición del humano a M. avium subsp. paratuberculosis a través de los alimentos y del agua contaminados, para determinar la importancia de la paratuberculosis como enfermedad zoonótica.
Palabras clave: paratuberculosis, enfermedad de Crohn, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, alimentos lácteos

ABSTRACT
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in food and its relationship with Crohn's disease. Paratuberculosis or Johne's disease is a chronic enteritis of the cattle and other small ruminant animals caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. In Argentina, the strains were characterized in beef and dairy cattle and deer in different genetic patterns by molecular tools. M. avium subsp. paratuberculosis has been linked in men to a chronic inflammation of the intestine, named Crohn's disease. There is clinical and experimental evidence to link M. avium subsp. paratuberculosis with Crohn's disease by PCR, positive bacteriological culture from mother milk, blood and affected tissues by in situ hybridization. The milk and sub-products might be one of the possible infection sources and it has been suggested that M. avium subsp. paratuberculosis could resist pasteurization. Several works showed that this mycobacteria could be present in retail milk of countries such as United Kingdom, USA, Czech Republic, and recently in Argentina. M. avium subsp. paratuberculosis was associated with different dairy products and water for human consumption. Therefore, it is possible that these food sources may have a role for transmission. New investigations should emphasize the role of contaminated food and water in human infection around the world and determine the possible zoonotic role of M. avium subsp. paratuberculosis.
Key words: paratuberculosis, Crohn's disease, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, dairy food

INTRODUCCIÓN

La paratuberculosis (PTBC) o enfermedad de Johne es una enfermedad infecciosa producida por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Este agente etiológico ha sido investigado en un amplio rango de especies domésticas y de ambientes ecológicos de fauna silvestre y parques zoológicos, como cabras, ciervos blancos, ciervos rojos, alces, muflones, camellos, ovinos, gnus, búfalos, llamas, pero en la especie que más se ha estudiado es en el bovino. En éste, la enfermedad se caracteriza por una enteritis crónica, que puede conducir a la muerte del animal afectado.
La epidemiología está ligada a las características biológicas del microorganismo: lento desarrollo, parasitismo obligado, alta resistencia ambiental, posibilidad de infección congénita y transmisión a través de la leche. La PTBC presenta el mismo patrón epidémico que otras enfermedades infecciosas, la diferencia radica en el curso de ésta, por ello es necesario medir la tasa de prevalencia en el rodeo durante un período de varios años. Es por esta razón que no se observan epidemias (13).
La prevalencia de la PTBC en Europa oscila entre 7 y 55%, en los Estados Unidos alcanza el 40% en los rodeos de más de 300 cabezas, y en Australia la prevalencia en los rodeos lecheros se encuentra entre 9 y 22%. En la Argentina, datos recogidos por el grupo de investigación del INTA Balcarce indican una seroprevalencia que varía entre 7,2 y 19,6% en rodeos de cría de la Cuenca del Salado, en la provincia de Buenos Aires (49).
Desde 1913 fue sugerida una posible asociación entre M. avium subsp. paratuberculosis y la enfermedad de Crohn (EC) en humanos, cuando se encontraron similitudes patológicas y sintomatológicas entre humanos y animales con enfermedad de Johne. Actualmente, después de casi 100 años, muchos trabajos de investigación evidencian esta asociación mediante la detección de M. avium subsp. paratuberculosis por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por cultivo de biopsias intestinales o ganglios linfáticos de pacientes con EC, o por detección de la respuesta serológica a antígenos del microorganismo; también debido a la remisión de la enfermedad tras la aplicación de terapias con antibióticos activos para M. avium subsp. paratuberculosis en este tipo de pacientes (36). Si bien estos últimos resultados con el uso de terapias antibióticas resultan alentadores, estos deberían ratificarse con pruebas científico-clínicas.
Una posible vía de transmisión al humano serían los alimentos contaminados, principalmente los lácteos. La mayoría de los estudios realizados enfatizan el rol de la leche fluida como principal vector de transmisión, ya que la pasteurización, según las evidencias presentadas, no lograría eliminar totalmente las células de M. avium subsp. paratuberculosis viables presentes en el alimento. Otros productos lácteos y cárnicos y el agua podrían también trasmitir esta micobacteria al humano, pero estos alimentos han sido poco estudiados (30).
Este trabajo presenta información sobre las enfermedades causadas por M. avium subsp. paratuberculosis, tanto en animales como en humanos, y provee algunas evidencias que sugieren su posible rol zoonótico y la asociación con el agua y los alimentos contaminados como vías de transmisión a los humanos.

Etiología y caracterización molecular
Entre los Actinomycetes y organismos relacionados se encuentran los pertenecientes al orden Actinomycetales, subdivididos en distintas familias: Actinomycetaceae, Dermatophilaceae, Nocardiaceae, Streptomycetaceae y Mycobacteriaceae. M. avium subsp. paratuberculosis se encuentra clasificado dentro de esta última, en el género Mycobacterium, especie avium, subespecie paratuberculosis.
M. avium subsp. paratuberculosis es un bacilo ácido-alcohol resistente, positivo a las coloraciones de Gram y Ziehl Neelsen, aerobio facultativo y muy resistente a las condiciones ambientales. Necesita micobactina exógena para su crecimiento in vitro, principalmente en el aislamiento primario, y durante su desarrollo forma pequeñas colonias de 1 a 5 mm, firmes, brillantes, blancas y lisas. Es un patógeno obligado, porque solamente se multiplica en el huésped susceptible (35).
El agente etiológico de la PTBC crece lentamente en medios de cultivo y, a pesar de este inconveniente, el aislamiento continúa siendo el mejor método para su detección. Existen otras técnicas para la detección y caracterización de esta micobacteria, como PCR y la búsqueda del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Estos análisis se basan en la identificación del segmento de inserción IS900, una secuencia repetida de 14 a 18 veces en su genoma y considerada única de M. avium subsp. paratuberculosis (32).
Existen evidencias de que M. avium subsp. paratuberculosis puede sobrevivir en forma vegetativa como esferoplastos o formas "L" (cells wall deficient), las que no son cultivables por los métodos tradicionales de cultivo (68).

Paratuberculosis en animales
En los bovinos, la enfermedad se caracteriza por una enteritis crónica, cuyos síntomas son: diarrea, pérdida de peso, edema submandibular y desmejoramiento corporal progresivo que conduce, eventualmente, a la muerte del animal afectado. Se manifiesta a la edad adulta (3 o más años), sobre todo en las proximidades del parto; es menos frecuente a edades menores y muy raramente se presenta alrededor del año de vida. Existen también portadores asintomáticos considerados como infectados subclínicamente. En los pequeños rumiantes domésticos la PTBC se manifiesta, por lo general, con debilitamiento y pérdida de peso, sin observarse diarrea. Esta enfermedad causa, además, importantes pérdidas económicas directas por la disminución de producción de leche o carne. Mediante estudios realizados en otros países, se estimó que la reducción en la producción de leche se aproximaría a un 4% del rendimiento total (14). Investigaciones realizadas en INTA, Argentina, estimaron que esta disminución alcanzaría hasta un 19%, y que las pérdidas económicas directas e indirectas en la producción pecuaria se aproximarían a 22 millones de U$S para explotaciones de bovinos destinados a carne y hasta 6,3 millones de U$S para las cuencas lecheras de la provincia de Buenos Aires. En la zona denominada Cuenca del Río Salado, la seroprevalencia observada fue de 7,2 a 19%, y se encontró que en rodeos lecheros la PTBC es más prevalente (pp 18,8%) y presenta un riesgo de infección mayor (OR=3,9) que en los bovinos para carne (4).
El grupo de investigación del INTA Balcarce ha colectado más de 210 cepas de M. avium subsp. paratuberculosis de la Argentina, caracterizadas y tipificadas por métodos moleculares y que son actualmente usadas para estudios de antígenos de interés diagnóstico. Se han identificado algunos antígenos de importancia como el denominado Lpp24, una proteína de membrana útil para aumentar la especificidad en técnicas como ELISA o MAPIA (25). Por otro lado, se han desarrollado técnicas de PCR para identificar M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de leche, órganos, materia fecal de animales sospechosos y animales clínicamente enfermos, e incluso desde los filtros del sistema de colecta de leche cruda hacia el tanque de enfriado en el mismo tambo (12). La serología por ELISA y la histopatología son dos elementos de diagnóstico de rutina de alta utilidad para identificar rodeos infectados y animales subclínicamente enfermos o con la manifestación clínica de la enfermedad (48).
Las enfermedades en los animales afectan de una manera muy directa a la salud y economía de los países del mundo. La lucha contra la PTBC está basada en su detección y control, para lo cual se necesitan técnicas de diagnóstico rápidas, sensibles y específicas, que permitan la localización de los focos de infección y su posterior control. La carencia de métodos de diagnóstico específicos para la identificación de animales recientemente infectados dificulta el control de la enfermedad, por lo que es deseable contar con técnicas de mayor sensibilidad, especificidad, facilidad de automatización y bajos costos, para la lucha contra la PTBC en los rodeos bovinos del país.

Enfermedad de Crohn en humanos
M. avium subsp. paratuberculosis ha sido vinculado a la EC en humanos, un desorden sistémico que causa principalmente la inflamación crónica del intestino, con una apariencia macroscópica similar a la que se observa en bovinos con PTBC (Figura 1). La patogénesis de esta enfermedad es compleja y parece ser multifactorial. Ha sido definida como una enfermedad de etiología múltiple, que involucra infecciones persistentes por M. avium subsp. paratuberculosis, Listeria spp. o Escherichia coli, defectos de la barrera mucosal del intestino o fenómenos de desregulación del sistema inmune con pérdidas de tolerancia; también se la ha asociado a factores genéticos de susceptibilidad individual. La combinación de algunos o de todos estos factores sería necesaria para producir la enfermedad en humanos.

Durante el transcurso de esta patología, M. avium subsp. paratuberculosis puede parasitar las células inmunorreguladoras en el intestino de personas con susceptibilidad adquirida o heredada, lo que resultaría en una inmunodepresión del revestimiento mucosal del intestino y la aparición de síntomas como: diarrea profusa, inflamación de ganglios linfáticos e intestino, depresión inmunológica general y debilitamiento (35). Otros síntomas asociados a la EC son dolor abdominal, fiebre leve y persistente, poco apetito, pérdida de peso, ruidos abdominales, fatiga, sangrado intestinal y heces fétidas. Se han notificado molestias en la piel, articulaciones, ojos, hígado, retraso en la aparición de la pubertad y problemas de crecimiento y, finalmente, complicaciones como obstrucción intestinal, úlceras y fístulas (22).
No existen muchos datos aún sobre tasas de prevalencia de esta enfermedad en los distintos países del mundo. En Estocolmo se realizó un estudio de los casos de EC entre los años 1990 y 2001, y se determinó que la prevalencia en esa zona era de 213 cada 100.000 habitantes, o sea que un 0,2% de la población sufría EC (42). En el Reino Unido no existen datos oficiales sobre la incidencia actual y prevalencia de esta enfermedad, pero un estudio realizado en el norte de Inglaterra estimó que podría acercarse a 144,8 cada 100.000 habitantes por año (36).
Los datos epidemiológicos marcan que en los países más desarrollados (ej. EE.UU.) se presentan tasas de EC más elevadas que en Latinoamérica, donde se identifican 2 grupos etarios: uno cuyas edades van desde los 15 a los 30 años, con un pico a los 24, y otro grupo de afectados adultos, cuyo pico está entre los 60 y los 65 años (22). Una de las explicaciones de este hecho radica en los factores ambientales que influyen en la inmunorregulación de los organismos. Los cambios en el estilo de vida, que redujeron la exposición del humano a muchos organismos patógenos, afectaron el desarrollo de la respuesta inmune del revestimiento mucosal del intestino, lo que se trasformó en un factor de riesgo para las enfermedades inflamatorias del tracto intestinal. Es decir, genes que antes conferían resistencia a enfermedades infecciosas en un ambiente poco sanitario se han convertido en factores de riesgo debido a excesivas respuestas inmunoinflamatorias en el seno de un estilo de vida moderno y ambiente sano (26).
Los antecedentes bibliográficos citan que en casos de EC se ha detectado ADN de M. avium subsp. paratuberculosis por medio de PCR en el 90% de los casos estudiados, por hibridación in situ en el 70% de los casos, y por RT-PCR (ARN) en el 100% de los casos (59). Por otro lado, M. avium subsp. paratuberculosis ha sido cultivado en enfermos de Crohn en heces, tejido intestinal (8) y en muestras de sangre periférica (Tabla 1).

En pacientes humanos con hemofilia, SIDA, linfocitopenia y diarrea profusa, mediante biopsias de colon, hígado y médula ósea se detectaron bacilos ácido-alcohol resistentes, y los análisis por cultivo y PCR resultaron positivos para M. avium subsp. paratuberculosis (55). También fueron informados casos de niños enfermos de quienes se logró aislar esta micobacteria por cultivo de los linfonódulos afectados (33). Un hallazgo de importancia clínica y que refuerza el concepto de zoonosis es que M. avium subsp. paratuberculosis ha sido cultivado de la leche materna de dos mujeres que padecían EC, aislamiento que fue confirmado por detección de la secuencia de inserción IS900 por PCR (46). Se desarrolló un ensayo de PCR de tipo nested dirigido a la secuencia IS900 para la detección de M. avium subsp. paratuberculosis en biopsias frescas de mucosa ileocolónica de pacientes con EC y sin ella. El ensayo detectó a la micobacteria en el 92% de las muestras de pacientes con EC y en el 26% de los pacientes sin EC. Según Bull et al. (8), la detección usando esta técnica fue altamente significativa e involucra a M. avium subsp. paratuberculosis en la etiología de la EC, ya que resultaron negativos para la nested-PCR tanto ADN de otras micobacterias (Mycobacterium spp. 2333, WA-1, WA-2, 22850), como segmentos génicos relacionados con IS900, pero no presentes en M. avium subsp. paratuberculosis (IS1613, IS1626, IS901/902, IS1100, IS116 e IS110). Finalmente, en varios casos de EC, el uso de antibióticos como claritromicina y rifabutina, para los cuales M. avium subsp. paratuberculosis es sensible, ha permitido remitir la expresión clínica de la enfermedad (30). En un estudio realizado por Barta et al. (3) se prueba que de 34 pacientes control, el 9% fueron serológicamente positivos para M. avium subsp. paratuberculosis, en contraste con una seropositividad del 33,33% en 42 pacientes con EC. No obstante, varios grupos de investigación realizaron estudios similares a los mencionados y no hallaron relación alguna entre la EC y M. avium subsp. paratuberculosis. Bernstein et al. (6) realizaron colonoscopía y biopsia de muestras de pacientes con EC (n=28), pacientes con colitis ulcerosa (n=28) y controles sin enfermedades inflamatorias del intestino (n=28). La PCR para M. avium subsp. paratuberculosis fue positiva sólo en uno de los pacientes con colitis ulcerosa, pero no en los pacientes con EC, mientras que 6 de los 19 controles fueron positivos. Baksh et al. (2) no hallaron ADN de M. avium subsp. paratuberculosis en cortes histológicos embebidos en parafina de pacientes con EC. Bernstein et al. (5) no encontraron diferencias en el rango de seropositividad de pacientes con EC, con colitis ulcerosa y controles, en un estudio realizado en Manitoba.
En un trabajo reciente se estudiaron mediante cultivo y PCR muestras de sangre de humanos, y se identificaron colonias de M. avium subsp. paratuberculosis en la sangre del 50% de los pacientes con EC, en el 22% de aquellos con colitis ulcerosa y no hubo cultivos positivos en los individuos sanos. El análisis del ADN mediante PCR dio resultados positivos en el 46% de los individuos con EC, en el 45% de los que presentaban colitis ulcerosa y en el 20% de los que no padecían enfermedades inflamatorias del intestino (47). Por otro lado, en un estudio sobre 145 personas, 27 con EC, 34 con colitis ulcerosa, 4 con colitis indeterminada y el resto pacientes controles, se detectó ADN de M. avium subsp. paratuberculosis en la sangre del 40,7% de los pacientes con EC, del 41,2% de los pacientes con colitis ulcerosa y del 42,5% de los pacientes control. El alto porcentaje de detección de ADN de M. avium subsp. paratuberculosis en los pacientes controles demostraría su distribución uniforme al comparar estos últimos con los pacientes con EC, lo que no daría evidencias suficientes para establecer una relación causal entre M. avium subsp. paratuberculosis y la EC (18).
Se ha informado que la mutación génica NOD2/CARD15 en el cromosoma 16 del humano –gen de expresión y función no bien conocidas– está asociada a la EC, pero no a pacientes con colitis ulcerosa. Tres mutaciones del gen (R702W, G908R y L1007fsinsc) predisponen a aproximadamente entre el 15 y 30% de los pacientes con EC a una mayor susceptibilidad de la mucosa a la agresión de M. avium subsp. paratuberculosis. Los genes NOD2/CARD15 parecen mediar el reconocimiento de muropéptidos bacterianos alterando la vía mayor inflamatoria contra estos, y se ha propuesto que NOD2 podría funcionar como factor antibacteriano en células epiteliales del intestino humano, al menos para dirigir la muerte de Salmonella Typhimurium intracelular, por lo que su falta podría afectar la respuesta contra estos patógenos (30). Sechi et al. (61) realizaron estudios a partir de biopsias intestinales de 34 pacientes con EC y otros 34 sin esta enfermedad, y encontraron que más del 70% de los enfermos que poseían al menos uno de los alelos de susceptibilidad (NOD2/CARD15) estaban infectados con M. avium subsp. paratuberculosis, ya que hallaron su ADN a partir de biopsias intestinales. Buhner et al. (7) hallaron que el 40% de los pacientes con EC poseen una mutación en el gen CARD15 y el 75% de ellos poseen también una mutación más en el mismo gen, la que incrementa la permeabilidad intestinal, lo que indicaría que existe una influencia genética en detrimento de la función de la barrera intestinal. Por otro lado, en un estudio realizado en Alemania, Italia y Canadá, se determinó que variantes del gen DLG5 R30Q constituyen un factor de susceptibilidad a la EC en hombres pero no así en mujeres (20). Por el contrario, Buning et al. (9) hallaron que variantes del mismo gen DLG5 R30Q no estarían implicadas en estas alteraciones gastrointestinales.
Cepas de M. avium subsp. paratuberculosis aisladas de bovinos con PTBC exhiben idéntico patrón polimórfico (short sequence repeats) que cepas aisladas de pacientes con EC que presentan mutaciones del tipo NOD2/CARD15 en genes para la expresión de susceptibilidad a la enfermedad, lo que demuestra una fuerte asociación entre las cepas aisladas de ovinos, cabras y/o bovinos con PTBC y las cepas aisladas de humanos con EC. Esta asociación podría indicar transmisión de cepas de M. avium subsp. paratuberculosis interespecie y marcar un significativo rol zoonótico de la PTBC (23).

M. avium subsp. paratuberculosis en la cadena alimentaria

M. avium subsp. paratuberculosis en leche. En los últimos años se ha avanzado en la investigación sobre la relación de M. avium subsp. paratuberculosis y la EC, y se ha puesto énfasis en los productos alimenticios como vías de transmisión. Algunas evidencias sugieren que los humanos se podrían infectar vía leche contaminada, ya que los animales enfermos excretan las micobacterias acantonadas en la glándula mamaria, aunque existe poca información acerca del número de microorganismos que podrían estar presentes en ésta. Se han encontrado entre 2 y 8 UFC en 50 ml de leche de animales clínica y subclínicamente infectados (64), en cambio en Dinamarca (24) se detectaron menos de 100 UFC/ml de leche proveniente de animales con sintomatología clínica. Además, a este número deberían sumarse las bacterias provenientes de la contaminación fecal que toma contacto con los pezones de vacas enfermas, ya que las heces de bovinos con PTBC podrían contener más de 108 UFC/g (10).
Actualmente es de considerable interés determinar la eficacia de los tratamientos térmicos usados en la industria láctea, para evitar la presencia de células viables de M. avium subsp. paratuberculosis en el producto final y determinar el tratamiento más efectivo y factible de aplicar que asegure la eliminación de esta micobacteria durante la producción de lácteos. El lento crecimiento de M. avium subsp. paratuberculosis en medios de cultivo y la naturaleza hidrofóbica de su superficie celular –que provoca el agregado de la bacterias en las superficies de los líquidos o bien en las paredes de tubos, pipetas y otros instrumentos– así como su tendencia a formar agregados bacterianos o clumps (que dan lugar a una sola colonia y hacen erráticos los recuentos de bacterias viables), son los principales problemas a los cuales se deben enfrentar los investigadores para realizar los estudios de resistencia al calor (43). Es por ello que la información disponible, proveniente de estudios que simulan la pasteurización de leche artificialmente inoculada, es variada. Estos resultados están resumidos en las Tablas 2 y 3; la primera muestra los resultados de estudios de pasteurización a nivel laboratorio, mientras que la segunda resume la información obtenida a partir de estudios en plantas piloto o pasteurizadores comerciales a escala.

Observando los resultados de los trabajos mostrados en la Tabla 2, podemos concluir que:
1. en 3 de los 5 trabajos que aplicaron un tratamiento de pasteurización convencional (63 °C por 30 min), la disminución de la viabilidad de M. avium subsp. paratuberculosis fue mayor a 5 logaritmos (log), mientras que los dos restantes muestran una disminución de sólo 2 a 3 log, lo que no sería suficiente para obtener un "alimento seguro". Además se observa que a mayor inóculo, mayor es la disminución de viabilidad de esta micobacteria;
2. en 6 de los 10 estudios que aplicaron pasteurización por alta temperatura por corto tiempo (HTST), la reducción de M. avium subsp. paratuberculosis viables fue mayor a 4 log; en 5 de esos 6 estudios esto coincidió con la aplicación de flujo laminar en la unidad de pasteurización. En los restantes (leche calentada en baños de agua) la reducción logarítmica fue mucho menor. Este hecho demuestra que el movimiento de partículas presentes en la leche durante el tratamiento podría favorecer la eliminación de M. avium subsp. paratuberculosis.
Stabel et al. (63) describen algunas dificultades al comparar datos obtenidos de varios trabajos de investigación y cuestionan algunas de las metodologías utilizadas, pero concluyen que la pasteurización HTST disminuiría entre 5 y 6 log la población de M. avium subsp. paratuberculosis viables. Sin embargo, esta conclusión no es compatible con los resultados obtenidos a partir de estudios realizados en plantas HTST pilotos (26).
Las principales conclusiones que pueden extraerse de la información presentada en la Tabla 3 son:
1. aplicando una pasteurización 1 o 2 grados por encima de 72 °C (tratamiento HTST), se podría asegurar ausencia de M. avium subsp. paratuberculosis viables en el producto final (44, 52, 54);
2. una pequeña cantidad de células de la micobacteria podría sobrevivir a la pasteurización HTST, si está presente en la leche cruda en alta concentración (104 o más UFC/ml de leche) (21, 29, 34);
3. la aplicación de homogenización durante el proceso de pasteurización HTST reduciría la viabilidad de M. avium subsp. paratuberculosis en gran medida, si se compara con el mismo tratamiento térmico pero sin homogenización. Esto, sumado al aumento del tiempo de pasteurización hasta 25 seg en vez de los 15 seg rutinariamente utilizados, podría eliminar completamente las células de M. avium subsp. paratuberculosis viables (31).
El motivo por el cual las células de M. avium subsp. paratuberculosis mantienen su viabilidad durante el tratamiento térmico, consiste en que previamente a este proceso estas células pueden encontrarse simples o aglomeradas. Durante el tratamiento térmico, a medida que aumenta el tiempo de calentamiento la proporción de células viables decrece y las células simples se inactivan rápidamente, mientras que las aglomeradas podrían mantener su viabilidad. Al estudiar la cinética de la inactivación térmica del organismo, fue obtenida una curva no lineal. En los tiempos de calentamiento correspondientes a la región de la cola de la curva de muerte térmica, se observan algunas células viables que están siempre localizadas en dichos agregados. Estas células pueden sobrevivir por largos períodos durante el calentamiento, por estar protegidas por otras células muertas que se encuentran alrededor de ellas, o por algún otro mecanismo desconocido (27).
Algunos estudios se han centrado en detectar la presencia de M. avium subsp. paratuberculosis viables en leche comercial; por la técnica de cultivo se ha encontrado entre 1,6 y 2,8% de muestras positivas (Tabla 4). En el Reino Unido esta micobacteria ha sido detectada en un 2% de muestras de leche pasteurizada comercial y en un 6,7% de muestras de leche cruda sometida a pasteurización experimental a 72 °C por 15 o 25 segundos (29). También en los estados de California, Minnesota y Wisconsin en Estados Unidos, fueron encontrados organismos viables de M. avium subsp. paratuberculosis en un bajo número de envases de leche comercial pasteurizada. En este caso, de 702 muestras analizadas un 2,8% contenían células viables (20). El más reciente de estos estudios fue realizado en República Checa (1), donde un grupo de investigadores analizaron muestras de leche pasteurizada comercializada en distintos puntos de venta de ese país. M. avium subsp. paratuberculosis fue cultivado a partir de 4 (1,6%) de 244 muestras. Estos resultados indican que este patógeno es capaz de sobrevivir, en ocasiones, la pasteurización comercial. En 7 países europeos fueron analizadas mediante PCR muestras de leche en polvo, un 49% de ellas resultaron positivas, a pesar de que M. avium subsp. paratuberculosis fue cultivado sólo en una de las muestras (38). En Argentina, en la EEA INTA Balcarce, se realizó un trabajo donde se analizaron 70 muestras de leche fluida comercial sometida a distintos tratamientos térmicos (Tabla 5). En este estudio se logró la identificación de dos cepas de M. avium subsp. paratuberculosis a partir de leches (2,86%) por cultivo, y ambas fueron confirmadas por PCR IS900 (Figura 2). Mediante RFLP, estas cepas demostraron pertenecer al patrón genotípico "A", un patrón ya conocido por ser el prevalente en Argentina, tanto en bovinos como en ciervos, y por ser similar al C17 europeo (11, 45) (Figuras 3 y 5).

M. avium subsp. paratuberculosis en quesos. Otros productos lácteos también podrían estar contaminados con M. avium subsp. paratuberculosis especialmente aquellos elaborados con leche cruda, como los quesos de oveja o cabra. En quesos, el bajo pH y la concentración de sal son los dos factores más importantes que contribuyen a la inactivación de patógenos durante el proceso de maduración. Collins et al. (15) estudiaron el efecto de tres factores (pH, concentración de sal y tratamiento térmico) que influyen en la producción de quesos sobre la viabilidad de M. avium subsp. paratuberculosis, y determinaron que el calentamiento y el pH bajo afectan la viabilidad de este patógeno; sin embargo, la concentración de sal no fue correlacionada con su muerte. Otras investigaciones realizadas en quesos duros y semiduros, elaborados con leche cruda artificialmente contaminada, encontraron que los recuentos decrecieron lentamente durante la maduración, y relacionaron la muerte del bacilo con la temperatura aplicada durante la elaboración y el descenso del pH durante la maduración (62).
Estudios recientes demuestran que la población de micobacterias puede concentrarse durante la producción de quesos y que M. avium subsp. paratuberculosis puede sobrevivir al proceso de maduración de este producto durante más de 27 semanas (17). Un estudio realizado por el grupo de investigación del INTA Balcarce demostró que el agente etiológico de la PTBC puede sobrevivir en quesos elaborados con leche bovina hasta los 45 días de maduración, y en los quesos elaborados con leche de origen caprino durante más de 60 días (11). Igualmente fueron estudiados los efectos del pH durante la maduración de estos quesos, y se halló una correlación positiva entre este factor y la viabilidad de la micobacteria, en casos de quesos elaborados con leche caprina (Figura 4).

Ikonomopoulos et al. (40) investigaron la presencia de M. avium subsp. paratuberculosis en distintos tipos de quesos comercializados en Grecia y República Checa, y encontraron que un 31,7% y un 3,6% de las muestras estudiadas fueron positivas por PCR y por cultivo, respectivamente. Un dato interesante es que pudieron correlacionar el mayor porcentaje de positividad con los quesos que tenían menor concentración de NaCl (<2%). El aislamiento de la micobacteria a partir de quesos comerciales, si bien se dio en baja frecuencia, indica que estos productos podrían ser otra fuente de exposición del humano a M. avium subsp. paratuberculosis.

M. avium subsp. paratuberculosis en agua. El agua también representa un potencial vehículo de transmisión de M. avium subsp. paratuberculosis al ser humano. El ganado bovino enfermo con PTBC puede excretar células viables en su materia fecal y contaminar el ambiente, de esta manera el microorganismo puede llegar hasta aguas superficiales u otras fuentes de agua de consumo humano. Esta micobacteria es muy resistente a la purificación con cloro, a las bajas temperaturas y al incremento del pH, condiciones que podrían encontrarse en los sistemas de suministro de agua potable. En el Reino Unido encontraron que el tratamiento del agua con cloro sólo reduce en 2 log la población de células viables (66). Además, M. avium subsp. paratuberculosis fue encontrado en fuentes de agua potable de grandes ciudades pertenecientes a países industrializados. En Estados Unidos se comprobó que durante los tratamientos rutinarios realizados al agua de consumo, M. avium subsp. paratuberculosis sobrevive a concentraciones mayores de 2 ppm de cloro (33).
Varios estudios han evaluado la presencia de esta micobacteria en los cursos de agua superficiales a donde podrían llegar los desechos de los animales enfermos presentes en la zona. En Reino Unido detectaron, mediante PCR y cultivo, la presencia de M. avium subsp. paratuberculosis en el 7,8% de muestras de agua en el Norte de Irlanda (67). En un estudio reciente donde se tomaron muestras del río Taff, Gales, se demostró que el 32,3% de las muestras fueron positivas por PCR. Este hallazgo fue positivamente correlacionado con la alta incidencia de la EC en Cardiff, una de las ciudades ubicadas en las márgenes del río Taff (53).

M. avium subsp. paratuberculosis en otros alimentos. Otras fuentes de infección alimenticia como carnes, vegetales u otros productos lácteos distintos de los mencionados, aún no han sido bien investigadas, a pesar de que la carne podría ser un alimento de bajo riesgo para la contaminación del humano con cepas de M. avium subsp. paratuberculosis.

CONCLUSIONES

Existe evidencia creciente del rol zoonótico de M. avium subsp. paratuberculosis en el desarrollo de la EC, aunque en un grado aún no bien determinado, fundamentalmente en casos donde la predisposición genética individual otorga oportunidades a bacterias como M. avium subsp. paratuberculosis para colonizar, infectar y superar las barreras inmunes del intestino; se sumarían a esta categoría de personas susceptibles los pacientes inmunosuprimidos.
Teniendo en cuenta el potencial zoonótico de M. avium subsp. paratuberculosis y su importancia desde el punto de vista de la salud pública, deberían enfatizarse los controles en los sistemas sanitarios pecuarios, tanto en rodeos bovinos lecheros como en industrias lácteas, con el objetivo de proteger a los consumidores contra el posible riesgo de infección. Asimismo, deberían desarrollarse métodos de detección rápidos, confiables y accesibles a la mayoría de los laboratorios e industrias de alimentos para identificar poblaciones infectadas, áreas de riesgo y luego aplicar medidas de control más eficientes, tanto en la producción primaria como en la elaboración o procesado de alimentos.
Otros trabajos de investigación en los que se continúe evaluando la presencia de M. avium subsp. paratuberculosis en leche comercial y productos lácteos, así como en productos cárnicos y aguas de consumo humano, deberán ser realizados a fin de relacionar estos estudios con la presencia de PTBC en el ganado y en otras especies animales, lo que finalmente permitiría concluir sobre el rol zoonótico de un patógeno como M. avium subsp. paratuberculosis en el desarrollo de la EC en humanos.

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Recibido: 13/02/06
Aceptado: 24/10/06